专利名称：一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法
技术领域：
本发明属于环境修复技术领域，特别涉及一种简便的用于测定白腐真菌降解多环 芳烃能力的方法。
背景技术：
^H^ii (Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs) g由以± 苯环稠合形成的持久性有机污染物。PAHs具有“三致”效应，因此美国环保署把16种PAHs列 为了优先控制的污染物。随着人类活动的增加，PAHs广泛的被分散到大气，土壤，水和沉积 物中，给生态环境构成了风险。根据分子量的不同，PAHs可以分为低分子量PAHs和高分子 量PAHs，随着分子量的增加，PAHs的毒性增大，持久性也增强。细菌可以有效的降解高分子 量PAHs，但对高分子量就PAHs的降解效果不佳(Juhasz AL and Naidu R. Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons :a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene. International Biodeterioration & Biodegradation. 2000，45 :57-88)。近来发现真菌可以有效的降解包括苯并[a]芘在 内的许多高分子量PAHs，因此真菌修复日益受到重视(Pointing SB. Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 2001, 57 20-33)。白腐真菌是一类可以引起木头腐烂分解的真菌，也是一种重要的PAHs降解真 菌。与其它真菌不同，白腐真菌对PAHs的代谢主要依赖于一系列胞外分泌的木质素降解 酶(木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶)的作用(Asgher M，Bhatti HN, Ashraf M and Legge RL. Recent developments in biodegradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system. Biodegradation. 2008,19 :771_783),因此其 分泌的粗酶液对PAHs降解率可以表观白腐真菌本身对PAHs的降解能力。传统的测定真菌对PAHs的降解能力方法的一般步骤为1)在体积为Vl的培养基 中添加PAHs，使初始含量达到Cl ；2)接种真菌，培养培养一定时期后过滤，得到真菌菌丝和 滤液两部分；3)用有机溶剂洗涤真菌菌丝若干次吸附的PAHs，得到洗涤液；4)用有机溶剂 萃取滤液若干次，得到萃取液；5)合并洗涤液和萃取液，旋转蒸发至近干，溶解，净化，氮气 吹干、用亲水性有机溶剂溶解后并定容至V2，高效液相分析其含量为C2 ；6)采用公式
降解率= C1V1-C2V2X100% 1 ^J 1计算降解率。在该方法中涉及到了萃取、洗涤、旋转蒸发、净化、吹干等过程，工作 量大、程序繁琐且易造成PAHs的损失，结果往往准确度不高，从而给PAHs高效降解真菌的 筛选与分离带了诸多不便。基于白腐真菌主要依赖于胞外酶来降解PAHs的原理，提出了一种简便的测定白 腐真菌降解PAHs能力的新方法。该方法操作简单，工作量小且准确度高，从而大大方便了 PAHs降解真菌的筛选与分离。
发明内容
发明目的本专利针对在真菌对PAHs降解率测定过程中工作量大、步骤繁琐、准 确度低等问题，提出了一种简便的测定白腐真菌对PAHs降解能力的方法。该方法程序简 单、便于操作、准确度高，从而大大方便了白腐真菌对PAHs降解率的测定。技术方案一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法，步骤为接种白腐 真菌于PDA平板培养，待菌丝长满后，截取5个直径为5mm的菌块接种于IOOmL Kirk培养 基中，28°C，150rpm条件下培养7天，取IOmL培养基1 IOOOg离心lOmin，得到上清液即为粗 酶液；2)取4. 5mL上清液，加入0. 5mL PAHs的乙腈溶液，混勻，置于暗室28°C培养24h，加 Λ 5. OmL乙腈摇勻终止反应，280C，150rpm培育lh, IlOOOg离心IOmin,过0. 22 μ m滤膜，采 用高效液相测定PAHs含量，其中，对照为粗酶液以灭活形式加入；3)白腐真菌对多环芳烃 降解率的计算公式为降解率=(C-B)X 100% /A其中A反应体系中PAHs的初始浓度；B为处理中PAHs的最终浓度；C为对照中 PAHs的最终浓度。上述所采用的培养基为Kirk培养基或其它适合白腐真菌生长和产酶的液体培养 基，其中Kirk培养基成分为IOg葡萄糖，0. 22g酒石酸铵，0. 2g KH2PO4,0. 05g MgSO4 ·7Η20， 0. OlgCaCl2, ImL无机溶液，0. 5mL维生素溶液，加去离子水至IL充分溶解，用乙酸钠调节pH 至4.5，121°C灭菌待用。上述白腐真菌在Kirk培养基中的培养时间为7 30d，温度为20 40°C，转速为 100 200rpm。粗酶液的制作方法为在4000 14000g的条件下离心Kirk培养基。采用高效液相测定PAHs含量时所用流动相为水和乙腈。有益效果本发明根据白腐真菌依靠胞外酶降解PAHs的特点，设计了一种白腐真 菌对PAHs的降解率的测定方法。在传统的测定方法中，菌丝洗涤、萃取、旋转蒸发、净化、氮 气吹干等步骤，均在开放的环境中进行，不仅工作量大、操作繁琐，而且容易造成PAHs的损 失，致使回收率低、准确度差；在本方法中，所有的操作步骤都十分简单且都在密封的条件 下进行，从而避免了实验过程中PAHs的损失，从而提高了回收率和准确度。此外，本方法还 可用于白腐真菌对其它有机污染物如多氯联苯，氯酚等的降解率测定。
四
图1为采用本方法对蒽和苯并[a]芘的回收率。其中黑色柱子代表3个重复回收 率的平均值，误差线代表标准差。回收率是评价PAHs降解率测定方法优劣的一个重要指 标，回收率越高，说明PAHs的损失就越少，结果也就越可靠。从图中可以看出，蒽和苯并[a] 芘的回收率很高，分别达到98. 2%和94. 1%，表明该方法的准确度是比较高的。图2为白腐真菌A对蒽和苯并[a]芘的降解率。其中黑色柱子代表3个重复降解 率的平均值，误差线代表标准差。从图中可以看出，白腐真菌A对蒽和苯并[a]芘的降解率 分别达到84.0%和43.5%。同时从结果还可以看出该方法的重复性较好，蒽和苯并[a]芘 降解率的变异系数分别只有2. 4%和2. 3%，表明该方法的精确度比较高。五具体实施例方式无机溶液1·5g 氨基三乙酸酯，3. Og MgSO4 · 7H20，0. 5g MnSO4,1. Og NaCl， IOOmgFeSO4 ·7Η20，IOOmg CoSO4,82mg CaCl2, IOOmg ZnSO4, IOmg CuSO4 ·5Η20, IOmgAlK(SO4)2, IOmg H3BO3, IOmg NaMoO4,加去离子水至IL充分溶解。维生素溶液2mg生物素，2mg叶酸，5mg维生素B1Amg核黄素，IOmg维生素B6盐酸 盐，0. Img维生素B12，5mg烟酸，5mg DL-泛酸钙，5mg对氨基苯甲酸，5mg硫辛酸，加去离子水 至IL充分溶解。实施例1 :白腐真菌粗酶液的制备从斜面上挑取白腐真菌A的菌丝接种于PDA平板，培养1周(28°C、避光)，待菌 丝长满平板后，截取5个直径为5mm的菌块接种于IOOmL Kirk培养基中，培养7天(28°C， 150rpm)，取IOmL培养基高速离心(llOOOg，lOmin)，上清液即为白腐真菌粗酶液(C液)。实施例2 蒽的回收率的测定取4. 5mL灭活C液(煮沸30min)置于15mL具塞棕色试剂瓶中，加入0. 5mL蒽浓 度为Img L-I的乙腈溶液，拧紧瓶塞，摇勻，置于暗室培养24h (25°C )，加入5. OmL乙腈终止 反应。摇勻，培育lh(25°C，150rpm)，高速离心(llOOOg，IOmin)，过0. 22 μ m滤膜，高效液相 测定。对照为加入未接菌的培养基代替灭活C液，每个处理3个重复。采用岛津UFLC-20系统(岛津，日本)分析样品中PAHs含量。采用反相C18柱 (3mmX 150mm,孔径2. 2 μ m)分离样品，流动相为乙腈和水，梯度稀释20min，流量为0. 8mL miiT1，柱温为 50 0C ο采用SPSS 11.0软件的One-way ANOVA检验进行数据统计。实施例3 白腐真菌粗酶液对蒽的降解率的测定取4. 5ml C液置于15mL具塞棕色试剂瓶中，加入0. 5mL蒽浓度为Img L—1的乙 腈溶液，拧紧瓶塞，摇勻，置于暗室培养24h(25°C )，加入5. OmL乙腈终止反应。摇勻，培育 Ih (250C，150rpm)，高速离心(llOOOg, IOmin)，过0. 22 μ m滤膜，高效液相测定。对照为C液 煮沸30min后加入，每个处理3个重复。采用岛津UFLC-20系统(岛津，日本)分析样品中PAHs含量。采用反相C18柱 (3mmX 150mm,孔径2. 2 μ m)分离样品，流动相为乙腈和水，梯度稀释20min，流量为0. 8mL miiT1，柱温为 50 0C ο采用SPSS 11.0软件的One-way ANOVA检验进行数据统计。实施例4 苯并[a]芘的回收率的测定取4. 5mL C液(煮沸30min)置于15mL具塞棕色试剂瓶中，加入0. 5mL苯并[a] 芘浓度为Img Γ1的乙腈溶液，拧紧瓶塞，摇勻，置于暗室培养24h(25°C )，加入5. OmL乙腈 终止反应。摇勻，培育lh(25°C，150rpm)，高速离心(11000g，IOmin)，过0. 22 μ m滤膜，高效 液相测定。对照为加入未接菌的培养基代替灭活C液，每个处理3个重复。采用岛津UFLC-20系统(岛津，日本)分析样品中PAHs含量。采用反相C18 柱(3mmX 150mm，孔径2.2 μ m)分离样品，流动相为乙腈和水，梯度稀释20min，流量为 0. SmLmirT1，柱温为 50 "C。采用SPSS 11. 0软件的One-way ANOVA检验进行数据统计。实施例5 白腐真菌粗酶液对苯并[a]芘降解率的测定
5
取4. 5mL C液(煮沸30min)置于15mL具塞棕色试剂瓶中，加入0. 5mL苯并[a] 芘浓度为Img Γ1的乙腈溶液，拧紧瓶塞，摇勻，置于暗室培养24h(25°C )，加入5. OmL乙腈 终止反应。摇勻，培育lh(25°C，150rpm)，高速离心(llOOOg，IOmin)，过0. 22 μ m滤膜，高效 液相测定。对照为C液煮沸30min后加入，每个处理3个重复。采用岛津UFLC-20系统(岛津，日本)分析样品中PAHs含量。采用反相C18柱 (3mmX 150mm,孔径2. 2 μ m)分离样品，流动相为乙腈和水，梯度稀释20min，流量为0. 8mL miiT1，柱温为 50 0C ο采用SPSS 11. 0软件的One-way ANOVA检验进行数据统计。实施例6接种白腐真菌于PDA平板培养，待菌丝长满后，截取5个直径为5mm的菌块接种于 IOOmL Kirk培养基中，28°C，150rpm条件下培养7天，取IOmL培养基IlOOOg离心lOmin， 得到上清液即为粗酶液；2)取4. 5mL上清液，加入0. 5mL PAHs的乙腈溶液，混勻，置于暗室 28°C培养24h，加入5. OmL乙腈摇勻终止反应，28°C，150rpm培育lh，IlOOOg离心lOmin，过 0.22μπι滤膜，采用高效液相测定PAHs含量，其中，对照为粗酶液以灭活形式加入；3)白腐 真菌对多环芳烃降解率的计算公式为降解率=(C-B)X 100% /A其中A反应体系中PAHs的初始质量浓度；B为处理中PAHs的最终质量浓度；C为 对照中PAHs的最终质量浓度(所有浓度单位由测量仪器统一)。上述浓度由岛津UFLC-20 系统(岛津，日本)分析测得。采用反相C18柱(3mmX150mm，孔径2.2μπι)分离样品，流动 相为乙腈和水，梯度稀释20min，流量为0.8mL mirT1，柱温为50°C。采用SPSS11. 0软件的 One-way ANOVA检验进行数据统计。培养基为Kirk培养基或其它适合白腐真菌生长和产酶的液体培养基，其中Kirk 培养基成分为:10g 葡萄糖，0. 22g 酒石酸铵，0. 2g KH2P04,0 . 05g MgSO4 ·7Η20，0. Olg CaCl2, ImL无机溶液，0. 5mL维生素溶液，加去离子水至IL充分溶解，用乙酸钠调节pH至4. 5， 121°C灭菌待用。白腐真菌在Kirk培养基中的培养时间为7 30d，温度为20 40°C，转 速为100 200rpm。粗酶液的制作方法为在4000 14000g的条件下离心Kirk培养基。 采用高效液相测定PAHs含量时所用流动相为水和乙腈。
权利要求
一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法，其特征在于步骤为接种白腐真菌于PDA平板培养，待菌丝长满后，截取5个直径为5mm的菌块接种于100mL Kirk培养基中，28℃，150rpm条件下培养7天，取10mL培养基11000g离心10min，得到上清液即为粗酶液；2)取4.5mL上清液，加入0.5mL PAHs的乙腈溶液，混匀，置于暗室28℃培养24h，加入5.0mL乙腈摇匀终止反应，28℃，150rpm培育1h，11000g离心10min，过0.22μm滤膜，采用高效液相测定PAHs含量，其中，对照为粗酶液以灭活形式加入；3)白腐真菌对多环芳烃降解率的计算公式为降解率＝(C B)×100％/A其中A反应体系中PAHs的初始浓度；B为处理中PAHs的最终浓度；C为对照中PAHs的最终浓度。
2.根据权利要求1所述的一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法，其特征 在于所采用的培养基为Kirk培养基或其它适合白腐真菌生长和产酶的液体培养基，其 中Kirk培养基成分为10g葡萄糖，0. 22g酒石酸铵，0. 2g KH2PO4,0. 05g MgSO4 · 7H20， 0. OlgCaCl2, ImL无机溶液，0. 5mL维生素溶液，加去离子水至IL充分溶解，用乙酸钠调节pH 至4.5，121°C灭菌待用。
3.根据权利要求1所述的一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法，其特征在 于所述白腐真菌在Kirk培养基中的培养时间为7 30d，温度为20 40°C，转速为100 200rpm。
4.根据权利要求1所述的一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法，其特征在 于其粗酶液的制作方法为在4000 14000g的条件下离心Kirk培养基。
5.根据权利要求1所述的一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法，其特征在 于采用高效液相测定PAHs含量时所用流动相为水和乙腈。
全文摘要
一种用于测定白腐真菌降解多环芳烃能力的方法，步骤为接种白腐真菌于PDA平板培养，待菌丝长满后，截取5个直径为5mm的菌块接种于100mLKirk培养基中，28℃，150rpm条件下培养7天，取10mL培养基11000g离心10min，得到上清液即为粗酶液；2)取4.5mL上清液，加入0.5mL PAHs的乙腈溶液，混匀，置于暗室28℃培养24h，加入5.0mL乙腈摇匀终止反应，28℃，150rpm培育1h，11000g离心10min，过0.22μm滤膜，采用高效液相测定PAHs含量，其中，对照为粗酶液以灭活形式加入；3)白腐真菌对多环芳烃降解率的计算公式为降解率＝(C-B)×100％/A；其中A反应体系中PAHs的初始浓度；B为处理中PAHs的最终浓度；C为对照中PAHs的最终浓度。本方法还可用于白腐真菌对其它有机污染物如多氯联苯，氯酚等的降解率测定。
文档编号C12Q1/02GK101935683SQ201010250160
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者张晶, 李烜桢, 林先贵 申请人:中国科学院南京土壤研究所