专利名称：一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸盐的制备方法，尤其是涉及一种L-鸟氨酸- α -酮戊二酸盐的制备方法。
背景技术：
L-鸟氨酸- α -酮戊二酸盐是广泛使用于医药保健的原料，是一种肌肉能量合剂， 同时也能帮助加速生长激素缺乏的孩子生长和加速外伤患者的创伤愈合。制备L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐的方法主要是L-鸟氨酸与α酮戊二酸直接成盐反应后结晶。而由于L-鸟氨酸制备方法的不同，可以由不同途径来制备L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐。目前，国内外对制备L-鸟氨酸的文献报道很多，L-鸟氨酸的制备方法主要有三种化学法、发酵法、酶解法。化学法目前工业上最常用的生产方法是采用化学水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸，1966年shell int. Rearsch采用丙稀酸和氰化钠作为主要原料合成L-鸟氨酸。 (GB1020492,1966)。发酵法用肠杆菌中的某些菌类如 Escherichia coli，Aerobacter aerogenes, Proteusrettgeri和Proteus mirabili的突变菌株，进行发酵生产L-鸟氨酸，发酵液中 L-鸟氨酸最高为 15mg/ml, (GB1098348,1968 ；US39668072,1972)，Shibuya 等利用 Arthrobacter citreus23_2A的突变株发酵生产L-鸟氨酸，发酵72h，产率为35. 2g/L。酶解法沈淑英等用粪链球菌ATCC8043，粪产碱杆菌ATCC21400，粪链球菌S-43游离细胞转化底物L-精氨酸制备L-鸟氨酸，转化率95-100 %，提取收率为85-90 % (天津微生物，1981，3 :28-38)。1995年，M Kyriakos等利用从动物肝脏中提取的精氨酸酶水解L-精氨酸用于L-鸟氨酸盐的制备(USM05761，1995)。因为上述L-鸟氨酸酶法生产过程都是利用游离细胞转化底物L-精氨酸，所以转化液中会含有少量菌体蛋白和其他杂质，不利于产物的分离纯化；且转化要去除菌体，降低产物得率，导致生产成本增加。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、精氨酸转化率高、产量高的固定化酶生产L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐的方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种L-鸟氨酸- α -酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用碳酸钾溶液浸泡6-1 后过滤，再将滤出的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化氢按重量比为1 (0.1-0.6) (0.2-0. 5)配制成溶液，于冰浴中反应5-60min，调节pH值至7_10，再加入精氨酸酶，使其与三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂的重量比为(0.002-0.01) 1，于l-10°c反应12-4他，洗涤后用饱和食盐水浸泡0. 5-3h，再利用去离子水洗净至溶液中检测不出氯离子，即得固定化酶，保存于水中；(2)转化条件的优化将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按重量比 1 (1-3) (0.004-0.02)混合，加入去离子水中，搅拌，采用乙酸调节PH值至9. 0-9. 4， 在35-40°C下，反应15-1 得固定化酶混悬液；(3)产物提取及精制将步骤( 中的固定化酶混悬液过滤后，向滤液中加α酮戊二酸、活性炭，于20°C 以下搅拌反应5-30min后，过滤，加入醇类，搅拌0. 5_lh，析出L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐， 搅拌3- ，控温至20°C以下、离心、干燥即得产品。所述步骤(1)中的溶液中含三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂的重量百分浓度为 40-60g/mlo所述步骤⑴中的碳酸钾为摩尔浓度1-5M的溶液，所述的溴化氢为重量百分浓度 l-4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶为重量百分浓度l_4g/L的溶液。所述步骤(1)中调节pH采用摩尔浓度为0. 05-2M的碳酸氢钠溶液。所述步骤(1)中洗涤过程是依次利用体积为100_400ml，浓度为0. 05-0. 3M的碳酸氢钠溶液、0. 5-4M的氯化钠溶液及去离子水洗涤2-5次。所述步骤⑵中搅拌反应的搅拌速度为70-80rpm，反应终点利用高效液相(HPLC) 控制。所述步骤(3)中加入α酮戊二酸量为[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(调pH 所用的乙酸量)，活性炭的加入量为2-5g/100ml滤液。所述步骤(3)中的浓缩后溶液中L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的重量百分数为 30-33%。所述步骤(3)中的醇类包括甲醇、乙醇或正丙醇。所述步骤(3)中加入醇类后的搅拌反应的温度为20°C以下。与现有技术相比，本发明具有生产成本低、生产条件温和、转化体系中杂质较少、 工艺步骤简单、生产操作安全等优点，采用本发明生产L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐纯度高、 产量高，每升反应溶液中含有300_320g的L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐，α -酮戊二酸的转化率90%以上。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1一种酶转化生产L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备原料用量如下所示三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g、精氨酸酶400mg、饱和食盐水以能浸没固定酶为准，取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g，用2M碳酸钾溶液浸泡12h，过滤，滤干后，加入100ml 2M碳酸钾溶液，于冰浴下加入IOml溴化氢(2g/ml)于冰浴下反应15min，其中三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂浓度为40g/ml。用冷0. IM碳酸氢钠洗至pH值至 8. 5，加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分浓度为4g/l)，4°C反应Mh。依次用0. IM碳酸氢钠、IM氯化钠，去离子水洗涤3次，每次200ml，再用饱和食盐水浸泡固定化酶lh，最后利用去离子水将其洗净至检测不出氯离子，保存于水中，备用；(2)转化条件的优化将精氨酸60g、乙酸4. 8g与乙酸锰0. 2g混合，溶于90g去离子水中得到混合液，将步骤(1)中制得的湿固定化酶50. 4g加入混合液中，控制pH值为9. 4，搅拌速度为 70-80rpm，在35-40°C搅拌17h ； α -酮戊二酸转化率达到90-92%，反应15h，以高效液相控制终点。反应结束后，过滤，滤饼(固相酶)保存于水中，下次备用；(3)产物提取及精制在步骤( 过滤后的滤液中加入19.2ga-酮戊二酸，5g活性炭，20°C以下搅拌 IOmin后，过滤，滴入800g 95 %乙醇，温度控制在20°C以下搅拌40min，料析出，继续保温 3h，降温至常温离心，干燥得Og L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐2 1。实施例2(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂40g，用IM碳酸钾溶液浸泡8h，过滤并滤干后，加入 IOml IM碳酸钾溶液，于冰浴下加入5ml溴化氢(lg/ml)于冰浴下反应5min，用冷0. 05M碳酸氢钠洗至PH值至7，加入精氨酸酶溶液400ml (重量百分浓度为lg/Ι)于1°C反应12h。 依次用0. 05M碳酸氢钠溶液100ml、0. 5M氯化钠溶液100ml，去离子水IOOml洗涤2次，最后用饱和食盐水浸泡固定化酶0. 5h，洗净至溶液中检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中，备用；(2)转化条件的优化将精氨酸60g，乙酸6. 4g与乙酸锰0. 2g混合，溶于90g去离子水中得到混合液，将步骤⑴中制得的湿固定化酶40. 5g加入混合液中，控制pH值为9. 4，在35-40°C搅拌18h， 以高效液相控制终点。反应结束后，过滤，滤饼(固相酶)保存于水中，下次备用；(3)产物提取及精制在步骤( 过滤后的滤液中加入α-酮戊二酸19.2g，6g活性炭，20°C以下搅拌 5min后，过滤，滴入750g 95%乙醇，温度控制在20°C以下搅拌30min，将料析出，继续搅拌 4h，离心，干燥得56. 0g, L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐。α -酮戊二酸转化率达92%。实施例3(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g，用2M碳酸钾溶液浸泡12h，过滤并滤干后，加入100ml 2M碳酸钾溶液，IOml溴化氢(2g/ml)于冰浴下反应15min，用冷0. IM的冷碳酸氢钠洗至PH值至8. 5，加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分浓度为4g/l)于4°C反应Mh.。依次用0. IM碳酸氢钠溶液200ml、IM氯化钠溶液200ml，去离子水200ml洗涤3次，最后用饱和食盐水浸泡固定化酶lh，洗净至溶液中检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中，备用；(2)转化条件的优化将精氨酸60g，乙酸7g与乙酸锰0.2g混合，溶于90g去离子水中，将步骤(1)中制得的固定化酶(湿)50. 4g加入混合液中，pH值9. 1，在35-40°C搅拌速度IOOrpm的条件下反应15h;反应结束后，过滤，滤饼(固相酶)保存于水中，下次备用；(3)产物提取及精制在步骤( 过滤后的滤液中加入19.4ga-酮戊二酸，8g活性炭，20°C以下搅拌 IOmin后，过滤，滴入700g95%乙醇，温度控制在20°C以下搅拌30min，料析出，继续保温5h， 离心，干燥得58. 7g L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐，α-酮戊二酸转化率达92.5%。实施例4(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂60g，用5Μ碳酸钾溶液浸泡18h，过滤，滤干后，加入 150ml 4M碳酸钾溶液，20ml溴化氢(4g/ml)于冰浴下反应60min，用冷2M的冷碳酸氢钠洗至PH值至10，加入精氨酸酶溶液200ml (重量百分浓度为2g/l)于10°C反应48h.。依次用 0. 3M碳酸氢钠溶液400ml、4M氯化钠溶液400ml，去离子水400ml洗涤5次，最后用饱和食盐水浸泡固定化酶3h，洗净至溶液中检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中，备用；(2)转化条件的优化将精氨酸60g，乙酸7.2g与乙酸锰0.2g混合，溶于90g去离子水中，将步骤(1)中制得的固定化酶(湿)60. 4g加入混合液中，PH值9. 0，在35-40°C搅拌速度200rpm的条件下反应15h;反应结束后，过滤，滤饼(固相酶)保存于水中，下次备用。(3)产物提取及精制在步骤( 过滤后的滤液中加入20. Sga-酮戊二酸，IOg活性炭，20°C以下搅拌 30min后，过滤，滴入800g 95 %乙醇，温度控制在20°C以下搅拌45min，料析出，继续搅拌 3h，离心，干燥得M.Og L-鸟氨酸-α酮戊二酸盐，α-酮戊二酸转化率达92.4%。实施例5(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g，用5M碳酸钾溶液浸泡6h，过滤并滤干后，加入 50ml 5M碳酸钾溶液，IOml溴化氢(2g/ml)于冰浴下反应35min，用冷0. 05M的冷碳酸氢钠洗至PH值至7，三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂浓度为60g/ml。加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分浓度为4g/l)于4°C反应Mh。依次用0.05M碳酸氢钠溶液400ml、4M氯化钠溶液 IOOml，去离子水200ml洗涤3次，最后用饱和食盐水浸泡固定化酶lh，洗净至溶液中检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中，备用；(2)转化条件的优化将精氨酸60g，乙酸6.8g与乙酸锰0. 12g混合，溶于90g去离子水中，将步骤(1) 中制得的固定化酶(湿)30g加入混合液中，pH值为9. 3，在30-35°C搅拌速度IOOrpm的条件下反应15h ；反应结束后，过滤，滤饼(固相酶)保存于水中，下次备用；(3)产物提取及精制在步骤( 过滤后的滤液中加入20g α-酮戊二酸，8g活性炭，α -酮戊二酸的加入量根据[(精氨酸量xO. 96) X 133/174]-(调pH所用的乙酸量)公式计算得到，35_40°C 保温搅拌IOmin后，过滤，滴入750g 95%的正丙醇，温度控制在20°C以下搅拌30min，料析出，温度控制在20°C以下，离心，干燥得54. Og L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐，α -酮戊二酸转化率达92. 0%。
实施例6一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂100g，用碳酸钾溶液浸泡6-1 后过滤，滤干后加入10L1M的碳酸钾、20ml重量百分比为lg/ml的溴化氢配制成溶液，于冰浴中反应5min，调节PH值至7，再加入0. 2L重量百分比为lg/L的精氨酸酶，于1°C反应48h，洗涤后用饱和食盐水浸泡0. 5h，再利用去离子水洗净至溶液中检测不出氯离子，即得固定化酶，保存于水中；(2)转化条件的优化将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按重量比1 1 0.004混合，加入去离子水中，搅拌，采用乙酸调节PH值至9.0，在35°C下，反应1 得固定化酶混悬液；(3)产物提取及精制将步骤O)中的固定化酶混悬液过滤后，向滤液中加α酮戊二酸、活性炭，其中， α酮戊二酸的加入量为[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(调ρΗ所用的乙酸量)，活性炭的加入量为2g/100ml滤液，于20°C以下搅拌反应5min后，过滤，加入甲醇，搅拌0. 5h，析出 L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐，搅拌池，控温至20°C以下、离心、干燥即得产品。实施例7一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂100g，用碳酸钾溶液浸泡1 后过滤，滤干后加入 12L5M的碳酸钾、12. 5ml重量百分比为4g/ml的溴化氢配制成溶液，于冰浴中反应60min，调节ρΗ值至10，再加入0. 25L重量百分比为4g/L的精氨酸酶，于10°C反应12h，洗涤后用饱和食盐水浸泡3h，再利用去离子水洗净至溶液中检测不出氯离子，即得固定化酶，保存于水中；(2)转化条件的优化将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按重量比1 3 0.02混合，加入去离子水中，搅拌，采用乙酸调节PH值至9.4，在40°C下，反应1 得固定化酶混悬液；(3)产物提取及精制将步骤O)中的固定化酶混悬液过滤后，向滤液中加α酮戊二酸、活性炭，其中， α酮戊二酸的加入量为[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(调ρΗ所用的乙酸量)，活性炭的加入量为5g/100ml滤液，于20°C以下搅拌反应30min后，过滤，加入正丙醇，搅拌lh，析出L-鸟氨酸- α -酮戊二酸盐，搅拌证，控温至20°C以下、离心、干燥即得产品。
权利要求
1.一种L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用碳酸钾溶液浸泡6-1 后过滤，再将滤出的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化氢按重量比为1 (0.1-0.6) (0. 2-0. 5)配制成溶液，于冰浴中反应5-60min，调节pH值至7_10，再加入精氨酸酶，使其与三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂的重量比为(0.002-0.01) 1，于1-10°C反应12-4 ，洗涤后用饱和食盐水浸泡 0. 5-3h，再利用去离子水洗净至溶液中检测不出氯离子，即得固定化酶，保存于水中；(2)转化条件的优化将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按重量比1 (1- (0. 004-0. 02) 混合，加入去离子水中，搅拌，采用乙酸调节pH值至9. 0-9. 4，在35-40°C下，反应15-1 得固定化酶混悬液；(3)产物提取及精制将步骤O)中的固定化酶混悬液过滤后，向滤液中加α-酮戊二酸、活性炭，于20°C 以下搅拌反应5-30min后，过滤，加入醇类，搅拌0. 5_lh，析出L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐 2 1，搅拌3-5h，再经降温至20°C以下、离心、干燥即得产品。
2.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的溶液中含三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂的重量百分浓度为40-60g/ml。
3.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于， 所述步骤(1)中的碳酸钾为摩尔浓度1-5Μ的溶液，所述的溴化氢为重量百分浓度l-4g/ml 的溶液，所述的精氨酸酶为重量百分浓度l_4g/L的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中调节PH采用摩尔浓度为0.05-2Μ的碳酸氢钠溶液。
5.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中洗涤过程是依次利用体积为100-400ml，浓度为0. 05-0. 3M的碳酸氢钠溶液、 0. 5-4M的氯化钠溶液及去离子水洗涤2-5次。
6.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤O)中搅拌反应的搅拌速度为70-80rpm，反应终点利用高效液相(HPLC)控制。
7.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入α-酮戊二酸量为[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(调pH所用的乙酸量)，活性炭的加入量为2-5g/100ml滤液。
8.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应液L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的重量百分数为30-33%。
9.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的醇类包括甲醇、乙醇或正丙醇。
10.根据权利要求1所述的一种L-鸟氨酸-α -酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于， 所述步骤(3)中加入醇类后的搅拌反应的温度为20°C以下。
全文摘要
本发明涉及一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，通过精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐包括以下步骤(1)固定化酶的制备，(2)转化条件的优化，(3)产物提取和精制工艺步骤。与现有技术相比，本发明具有生产成本低、生产条件温和、转化体系中杂质较少、工艺步骤简单、生产操作安全、纯度高，能合成符合透光要求的合格产品。每升反应溶液中含有300-320g的L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐，α-酮戊二酸转化率达90％以上等优点。
文档编号C12N11/02GK102373245SQ201010256510
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者张建宇, 苏建勇, 郑南华 申请人:上海汉飞生化科技有限公司