专利名称：一种快速确定鸭疫里默氏杆菌培养物中细菌数量的方法
技术领域：
本发明涉及鸭疫里默氏杆菌的细菌计数，特别涉及利用紫外分光光度计来检测鸭 疫里默氏杆菌培养物中鸭疫里默氏杆菌细菌数量的方法。
背景技术：
鸭传染性浆膜炎是发生于家鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种接触性传染病，又称鸭 疫里默氏杆菌病、鸭疫巴氏杆菌病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫败血症和新鸭病，其病原为 鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestife^RA)。该病呈急性败血症或慢性感染，临床上 主要表现为咳嗽、喘气、下痢、眼鼻分泌物增多、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头 颈歪斜等症状；典型病变为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎。该 病一年四季均可发生，以冬季发病严重，主要经污染的饲料、饮水、飞沫等传播；1-8周龄的 鸭高度敏感，尤以2-3周龄的雏鸭发病率较高，可达90% ；死亡率受多种因素的影响，差别 较大，常为10-20%，但也有的高达60-75%。应激因素如饲养密度过大、通风不畅、卫生条 件差、气候突变等，可诱发该病的发生，死亡率大大提高；耐过鸭可表现神经症状，生长发育 缓慢、消瘦，饲料报酬下降，严重影响生产成绩，造成严重的经济损失。鸭传染性浆膜炎是目前对世界各国养鸭业造成危害最为严重的传染病之一，在世 界范围内分布，几乎在所有采用集约化养鸭生产的国家都有发现，给世界养鸭业造成了巨 大的经济损失。我国是一个养鸭大国，养鸭业在我国的农业经济中占有着重要的地位，也是 人们生活所需肉蛋的重要来源之一，鸭传染性浆膜炎在我国各养鸭地区的流行较严重，是 我国养鸭场(特别是商品鸭场)最难于对付、造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一，加 之RA的耐药性逐渐增强，给我国养鸭业造成了巨大经济损失。由于鸭传染性浆膜炎给养鸭业带来严重的经济损失，有关鸭疫里默氏菌的研究引 起了越来越多的关注。其中鸭疫里默氏菌的细菌计数是鸭疫里默氏菌及鸭传染性浆膜炎防 治有关研究的基础，如研究鸭疫里默氏菌的培养条件、增殖特性、致病剂量、疫苗含菌量等 等均离不开鸭疫里默氏菌的细菌计数。细菌计数的方法有计数器测定法、电子计数器计数 法、平板菌落计数法、比浊法、测定细胞重量法、测定细胞总氮量或总碳量、颜色改变单位法 等，其中比浊法和菌落计数法可满足绝大多数细菌的计数且也是最常用的方法。菌落计数法是根据每个活的细菌能培养长出一个菌落的原理设计的，不需要特殊 仪器，操作简单，测定时取一定容量的菌悬液作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进 行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数，此法灵敏度高，是一种检测 活菌数的好方法，但该法费时，至少需24小时才能出结果，且需判断选择好适宜的稀释度 (一般选取菌落数在30 300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确)，对鸭疫里默 氏菌来说，由于其培养条件较苛刻(如需特殊培养基或加入血、CO2等)，因此其操作的复杂 性、花费及时间等均增大。比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一 定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(0D值)表示样品菌液浓度。但光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形 态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响，且通常只能检测含有大量细菌的悬浮 液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品或组织样品等，不能用此法测定，但此法简便 快捷。比浊法测定细菌的数量主要的关键是如何排除样品中的干扰物、所采用的光波波长 的确定和测定的OD值与细菌数量间对应关系，否则只能判断出相对的细菌数目而不能确 定出准确的细菌数目。目前，利用紫外分光光度计来测定鸭疫里默氏杆菌数量还需摸索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速确定鸭疫里默氏杆菌培养物中鸭疫里默氏杆菌 数量的方法，涉及所用的检测仪器种类、检测过程中所采用的光波波长、检测步骤及OD值 与鸭疫里默氏杆菌培养物中鸭疫里默氏杆菌数量间的换算关系。本发明采用如下技术方案一种快速确定鸭疫里默氏杆菌培养物中细菌数量的方法，包括以下步骤①取样； ②离心洗涤以3000 5000转/分钟离心5-10分钟后，用生理盐水连续离心洗涤3次，每 次离心洗涤5-10分钟，转速3000 5000转/分钟；③稀释用生理盐水作N倍稀释；④检 测于紫外分光光度计下测定560nm处OD值；⑤计算按照以下公式计算鸭疫里默氏杆菌 的数量，含菌总数(CFU/ml) = OD56tlnm 值 XNX2X109CFU/ml。所述的方法，所述取样步骤中，液体培养物或菌液直接定量取样。所述的方法，所述取样步骤中，固体培养物用生理盐水将平板上的菌冲洗下后定 量取样。由于本发明测定鸭疫里默氏杆菌培养物中鸭疫里默氏杆菌细菌数目的方法摸索 出了符合鸭疫里默氏杆菌细菌浓度在与光密度具有良好线性关系的光波波长，且确定出OD 值与鸭疫里默氏杆菌数量间对应关系，利用该方法可准确、快速地测定出鸭疫里默氏杆菌 培养物中鸭疫里默氏杆菌的细菌数，在涉及鸭疫里默氏杆菌细菌计数相关领域(如研究鸭 疫里默默氏菌的最适培养条件、增殖特性、致病剂量、疫苗含菌量等)中具有极大的优势或 不可替代的作用。一、实现了利用仪器自动化检测和计数。传统的细菌培养计数是人工操作，因此 结果的可靠性与检测人员的业务素质有较大的影响，仪器自动化检测表明了检测方法的进步。二、简便。传统的细菌计数涉及培养试剂选择与准备、培养基的制备、培养条件的 准备、多步骤的人工操作等，因此操作复杂，需要具有微生物学知识特别是要掌握鸭疫里默 氏菌的培养特性。本发明操作简便，无微生物学和鸭疫里默氏菌知识的人员根据操作步骤 即可测定。三、快速。传统的细菌培养计数不仅操作复杂，且培养时间需24-48小时，而本发 明可在1小时出结果，大大地缩短了检测时间四、确定了检测所采用的光波波长和所测定的OD值与鸭疫里默氏杆菌数量间的 对应关系，结果准确。理论上细菌悬液的透光量可反映细菌的数量，但目前未见到底多少波 长的透光量可准确地反映鸭疫里默氏菌的细菌数量，他们之间的准确的数值关系是多少。本发明根据菌悬液的透光量可反映测定样品中的细菌的数量，对比浊法测定细菌的数量的两个主要的关键一测定所采用的光波波长和所测定的OD值与鸭疫里默氏杆菌数 量间对应关系进行了摸索，确定了 OD值与鸭疫里默氏杆菌数量间对应关系，同时，本发明 通过用生理盐水连续离心洗涤所测定的菌液，除去样品中的干扰物，结果准确。因此利用该 方法可准确、快速地测定出鸭疫里默氏杆菌培养物中鸭疫里默氏杆菌的细菌数，填补了利 用紫外分光光度计准确测定鸭疫里默氏杆菌的细菌数这一空白。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1①取样液体培养物或菌液直接定量取样；②离心洗涤以3000 5000转/分钟 离心5-10分钟后，用生理盐水连续离心(3000 5000转/分钟，5-10分钟)洗涤3次；③ 稀释用生理盐水作适当稀释；④检测于紫外分光光度计下测定560nm处OD值(注意用生 理盐水调0)；⑤计算根据以下公式计算出菌液含菌量，含菌总数(CFU/ml) = OD56tlnm值X 稀释倍数 X2X109CFU/ml。例如血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株用N-J合成培养基35-40°C通气发酵 24小时后，检测发酵液中鸭疫里默氏杆菌的含菌数，具体步骤为①取样取发酵菌液Iml ；②离心洗涤以3000 5000转/分钟离心5_10分钟 后，用生理盐水连续离心(3000 5000转/分钟，5-10分钟)洗涤3次；③稀释用生理盐 水50ml溶解和稀释沉淀(即50倍稀释)；④检测于紫外分光光度计下测定560nm处OD 值(注意用生理盐水调0)，测得OD56tlnmSO. 568 ；⑤计算根据以下公式计算出菌液含菌量， 含菌总数(CFU/ml) = OD56tlnm 值 X 稀释倍数 X2X109CFU/ml = 0. 568X50X2X 109CFU/ml =5. 68X1010CFU/ml。即每毫升该发酵液中鸭疫里默氏杆菌的含菌数为568亿个。实施例2本实施例列举一个固体培养物的具体操作例子.例如血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株用胰酶大豆琼脂培养基在12em培养皿 于35-40°C烛缸中培养24-48小时后，冲洗培养皿中鸭疫里默氏杆菌进行其他研究，若需要 对其含菌数检测，则具体步骤为①取样在培养皿中加入生理盐水5ml，用移液管吸取生理盐水冲洗生长于琼脂 表面的鸭疫里默氏杆菌，将洗下的菌液倒入15ml离心管中；另加生理盐水5ml重复冲洗琼 脂板1次，共获得菌液IOml ；②离心洗涤以3000 5000转/分钟离心5_10分钟后，用生 理盐水连续离心(3000 5000转/分钟，5-10分钟)洗涤3次；③稀释用生理盐水IOml 溶解沉淀(即不稀释)；④检测于紫外分光光度计下测定560nm处OD值(注意用生理盐水 调0)，测得OD56tlnm为0. 211 ；⑤计算根据以下公式计算出菌液含菌量，含菌总数(CFU/ml) =OD560nm 值 X 稀释倍数 X2X 109CFU/ml = 0. 2X 1 X2X 109CFU/ml = 2. IlX 108CFU/ml。即每毫升平板冲洗菌液中鸭疫里默氏杆菌的含菌数为211000000个。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
一种快速确定鸭疫里默氏杆菌培养物中细菌数量的方法，其特征在于，包括以下步骤①取样；②离心洗涤以3000～5000转/分钟离心5 10分钟后，用生理盐水连续离心洗涤3次，每次离心洗涤5 10分钟，转速3000～5000转/分钟；③稀释用生理盐水作N倍稀释；④检测于紫外分光光度计下测定560nm处OD值；⑤计算按照以下公式计算鸭疫里默氏杆菌的数量，含菌总数(CFU/ml)＝OD560nm值×N×2×109CFU/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤①中，液体培养物或菌液直接定 量取样。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤①中，固体培养物用生理盐水将 平板上的菌冲洗下后定量取样。
全文摘要
本发明公开了一种快速确定鸭疫里默氏杆菌培养物中细菌数量的方法，包括以下步骤①取样；②离心洗涤以3000～5000转/分钟离心5-10分钟后，用生理盐水连续离心洗涤3次，每次离心洗涤5-10分钟，转速3000～5000转/分钟；③稀释用生理盐水作N倍稀释；④检测于紫外分光光度计下测定560nm处OD值；⑤计算按照以下公式计算鸭疫里默氏杆菌的数量，含菌总数(CFU/ml)＝OD560nm值×N×2×109CFU/ml。
文档编号C12Q1/06GK101936890SQ201010256430
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者朱德康, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心