专利名称：一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在饲料中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在肉鸡饲料中的应用，属 于农业领域中的畜牧养殖技术领域和生物技术领域。涉及利用抗菌肽替代饲料中抗生素的 添加，减少鸡肉中抗生素的残留和保障食品的安全。
背景技术：
饲料安全即食品安全的概念在世界范围内已成为共识。食品和饲料在美国属于同 一管理范围，适用于同一部法律；丹麦政府为了保证食品安全，制定了饲料生产中禁止使用 抗生素的规定；欧盟已禁止在动物饲养中使用抗生素作为饲料促进剂。随着人民生活水平 的提高，对动物产品的需求量越来越大，对绿色食品的呼声越来越高。我国是养殖生产大 国，但畜产品的出口比例相当低下，与我国作为一个畜产品生产大国的地位极不相称。我国 的一些农副产品由于农药、抗生素等药物残留，重金属含量等技术指标超过欧盟及主要进 口国的质量标准，被拒收、扣留和终止合同等。近年来，畜产品中的抗生素药物残留问题越 来越受到人们的重视，我国已严格限制将某些抗生素作为保健和促生长剂用于饲料。2002 年，农业部发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》公告，这表明传统抗生素必将逐渐淡 出历史舞台，寻找安全高效的抗生素替代品就显得十分重要，鉴于抗生素的不利影响，开发 通过调整动物胃肠道平衡而达到促进生长、维持动物健康、无毒副作用的绿色饲料添加剂 已成为人们研究的热点。特别是在我国未来养殖业的发展中，政府将进一步加大对饲料、兽 药与畜产品卫生安全的监管力度，积极推动发展绿色养殖业。因此，应用现代高科技手段研 究和开发安全、高效、环保的抗菌添加剂，保障动物和人类自身的健康与安全，才能使我国 由养殖生产大国成为养殖生产强国，实现养殖业的现代化。国外对抗菌肽已有较多研究，在动物生产实际中也已开始应用，其作为饲料添加 剂的使用效果已被实验证实，并已形成一定的市场需求。但一般抗菌肽的抗菌谱窄，通常只 能抑制革兰氏阳性菌。动物源抗菌肽天然资源有限，限制了在饲料中的大规模使用。微生物 抗菌制肽由10个以下的氨基酸和一个脂肪酸组成一个环形的多肽分子，它和动物源抗菌 肽相比，具有广谱高效抗菌的优势。利用微生物发酵生产抗菌肽脂，可大规模工业化生产， 生产周期短，生产成本大大降低，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，是克服抗菌肽 实际应用技术瓶颈的最佳途径。
发明内容
技术问题针对饲料中抗生素的使用导致导致食品安全的问题和动物源抗菌肽生产量低的 问题。本发明利用枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的方法及其产品在鸡饲料中的应用。发明目的 之一抗菌肽生产方法及产品。发明目的之二 在鸡饲料中的添加方法。技术方案
—种来自枯草芽孢杆菌的抗菌脂肽的生产方法，包括以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) fmbj，种子培养基扩大培养，种子培养基 胰蛋白胨10. 0g，酵母膏5. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水1000ml，pH7. 2 ；体积比2 5 %接种， 28 35°C，5000L发酵罐液体深层发酵30 48h，液体发酵培养基葡萄糖20. Og/L，胰蛋 白胨 5. Og/L,谷氨酸钠 2 5%，MgSO4O. 5g/L，KCl 0. 5g/L，KH2PO4lg/L, FeSO4O. 15mg/L， MnS045. Omg/L, CuSO4O. 16mg/L, pH7. 0 ；发酵工艺参数为温度 28 35°C，搅拌转速 180" min，通气量80m7h，罐压0. 10 0. 12Mpa，ρΗ7· 0，消泡剂0. 3% ；发酵液经离心去除菌体， 然后在上清液中加入HCl调整ρΗ至2. 0，静置后离心，沉淀按发酵液体积分数25 30%加 乙醇并调PH至7. 0，进一步提取，提取物经赋型剂(麦芽糊精多孔淀粉=6 9 1)吸 附、干燥，或直接进行吸附、干燥，得抗菌肽成品，产品抗菌效价为20000 300000IU/g。消 泡剂为聚醚、硅油或大豆油，优选大豆油。所述的枯草芽孢杆菌fmbj抗菌脂肽在肉鸡饲料中的应用，其特征为在肉鸡基础 日粮中按照4000U/kg添加所述的抗菌脂肽，提高鸡的饲料利用率，并能够在一定程度上促 进肉鸡中枢免疫器官的发育，并通过提高三碘甲状腺氨酸(T3)和血清中的促甲状腺激素释 放激素(TSH)水平，降低甲状腺素(T4)水平而提高机体免疫力。添加抗菌脂肽对肉鸡的生 长发育和免疫机能具有较好的调节和促进作用。有益效果本发明的主要优点和积极效果如下1.本发明首次将枯草芽孢杆菌抗菌脂肽用于肉鸡饲料中，对提高鸡的饲料利用 率、免疫指数和免疫功能有积极的意义。2.本发明与目前肉鸡饲料中使用的黄霉素相比，具有更好的促进生产和调节免疫 的效果，对取代饲料抗生素添加和保障食品的安全具有重要意义。
具体实施例方式实施例1采用5000L的发酵罐，以500L放大后的最佳发酵工艺条件对枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) fmbj (保藏日期:2003 年 6 月 6 日，保藏号=CGMCC No. 0943，见专利公 开号CN1477189)进行发酵生产。最佳发酵工艺参数为温度28 35°C，搅拌转速180r/ min，通气量 80m3/h，罐压 0. 10 0. 12Mpa, ρΗ7· 0，大豆油 0. 3%0以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌种fmbj，种子培养基扩大培养，种子培 养基胰蛋白胨10. 0g，酵母膏5. 0g, NaCl 5. 0g，蒸馏水1000ml，pH7. 2 ；体积比2 5%接 种，28 35°C，5000L发酵罐液体深层发酵30 48h，液体发酵培养基葡萄糖20. 0g/L,胰 蛋白胨 5. 0g/L，谷氨酸钠 2 5%, MgSO4O. 5g/L，KCl 0. 5g/L，KH2PO4lg/L, FeSO4O. 15mg/L， MnS045. Omg/L, CuSO4O. 16mg/L, pH7. 0 ；发酵工艺参数为温度 28 35°C，搅拌转速 180" min，通气量80m3/h，罐压0. 10 0. 12Mpa，pH7. 0，消泡剂大豆油0. 3% ；发酵液采用的工业离心机为碟片式离心机(江苏巨能机械有限公司生产，DBY211 型)，转速为6000r/min，去除菌体，然后将离心所得清液用6N HCl调ρΗ至2. 0、静置24h， 过滤除滤液得沉淀，沉淀按发酵液体积分数25 30%加乙醇并调ρΗ至7. 0，进一步提取， 提取物经赋型剂[麦芽糊精(山东西王淀粉有限公司)多孔淀粉(重庆泰威生物工程股份有限公司)=6 9 1]吸附、干燥，或直接进行干燥，得抗菌肽成品。抗菌肽的回收率 为48. 4%，纯度为58. 5%，抑菌效价为50000 300000IU/g。实施例2采用5000L的发酵罐，以1000L放大后的最佳发酵工艺条件对Bacillus subtilis fmbj进行发酵生产。最佳发酵工艺参数为温度32°C，搅拌转速180r/min，通气量80m3/h， 罐压 0. 10 0. 12Mpa, pH7. 0，大豆油 0. 3%。采用的工业离心机为碟片式离心机，转速为6000r/min，去除菌体，然后采用喷雾 干燥方式进行干燥。其工艺为温度210°C、风机转速70转/s、赋形剂麦芽糊精多孔淀 粉=6 9 1，此时抗菌肽的回收率达54%，抑菌效价为20000 70000IU/g干粉。实施例3选用1日龄健康AA肉鸡600只(体重差异不显著，P > 0. 05)，采用单因子完全随 机试验设计，随机分为5个处理组，每个处理组设6个重复，每个重复20只鸡。空白对照组 (C组)饲喂基础日粮(基础日粮中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素对照组(AC)在基础日 粮中添加5mg/kg的黄霉素，试验I在基础日粮中添加抗菌脂肽4000U/kg。添加4000U/kg的I组平均日增重最高，较AC组提高3. 77%;1组的平均日采食较 C组和AC组也有下降趋势，但差异不显著。I组的料重比F/G较AC组降低4. 94%，较C组 也降低3. 14%。21天法氏囊指数I组较C组提高41. 48%,45天胸腺指数I组较C组分别提高 69. 91%。21天血清总蛋白含量I组较C组、AC组增加19. 00%，球蛋白水平21天时I组较 C组、AC组分别升高64. 63%，32. 76%。45天时分别升高55. 98%、6. 39%。I组较C组、AC 组T3和TSH水平提高，但T4水平下降。抗菌脂肽对21天及45天肉鸡血清溶菌酶含量的影 响不显著。实施例4选用1日龄健康AA肉鸡600只(体重差异不显著，P > 0. 05)，采用单因子完全随 机试验设计，随机分为5个处理组，每个处理组设6个重复，每个重复20只鸡。空白对照组 (C组)饲喂基础日粮(基础日粮中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素对照组(AC)在基础日 粮中添加5mg/kg的黄霉素，试验II组在基础日粮中添加抗菌脂肽8000U/kg。添加8000U/kg的II组平均日增重较AC组和C组差异不显著；II组的平均日采 食较C组和AC组分另|J降低4. 28%和3. 82%。II组的料重比F/G和较11组相同较AC组降 低4. 94%，较C组也降低3. 14%。该组的法氏囊指数、II组与C组、AC组无显著差异；该组各组肉鸡脾脏指数无显 著变化。但45天胸腺指数较C组提高61. 95%，较AC组也提高37. 59%。该组的T3和TSH 水平与C组和AC组相比有不同程度的提高，但T4水平下降。该组的白蛋白比C组低，和AC 组类似，但球蛋白较C组有所增加。该组肉鸡血清溶菌酶含量有增加。实施例5选用1日龄健康AA肉鸡600只(体重差异不显著，P > 0. 05)，采用单因子完全随 机试验设计，随机分为5个处理组，每个处理组设6个重复，每个重复20只鸡。空白对照组 (C组)饲喂基础日粮(基础日粮中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素对照组(AC)在基础日 粮中添加5mg/kg的黄霉素，试验III组分别在基础日粮中添加抗菌脂肽12000U/kg。
添加12000U/kg的III组平均日增重较AC组和C组差异不显著；该组平均日采食 最低，较AC组和C组分别降低6. 23 %和5. 77 %，该组的料重比最低，较AC组和C组分别降 低 6. 79%禾口 5. 03%。该组胸腺指数，该组较C组和AC组均显著提高；21天的法氏囊指数比C组高，与 AC组类似，45天法氏囊指数与AC和C组略有下降；21天该组T3较C组和AC组显著提高， T4与AC组相同，TSH比AC组有所增加，但45天T3水平接近，而T4与C组类似，TSH比C 组和AC组增加。该组的溶菌酶21天与AC组相同，明显高于C组，45天与C组、AC组类似； 该组总蛋白与C组、AC组差异不显著，但21天和45天的白蛋白高于AC组，低于C组，球蛋 白高于C组。
权利要求
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ抗菌脂肽的生产方法，其特征为以枯草芽孢杆菌fmbJ菌种，种子培养基扩大培养，种子培养基胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.2；体积比2～5％接种，28～35℃，5000L发酵罐液体深层发酵30～48h，液体发酵培养基葡萄糖20.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，谷氨酸钠2～5％，MgSO40.5g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO41g/L，FeSO40.15mg/L，MnSO45.0mg/L，CuSO40.16mg/L，pH7.0；发酵工艺参数为温度28～35℃，搅拌转速180r/min，通气量80m3/h，罐压0.10～0.12Mpa，pH7.0，消泡剂0.3％；发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH至2.0，静置后离心，沉淀按发酵液体积分数25～30％加乙醇并调pH至7.0，进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，或直接进行吸附、干燥，得抗菌肽产品，产品抗菌效价为20000～300000IU/g。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，消泡剂为聚醚、硅油或大豆油，优选大豆油。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，赋型剂为体积比麦芽糊精多孔淀粉 =6 9 1。
4.权利要求1-3之一所述的枯草芽孢杆菌fmbj抗菌脂肽在肉鸡饲料中的应用，其特征 为在肉鸡基础日粮中按照4000U/kg添加所述的抗菌脂肽。
全文摘要
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在饲料中的应用，属于饲料添加剂和生物技术领域。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ种子培养基扩大培养后，2～5％接种，28～35℃，5000L发酵罐液体深层发酵30～48h，然后提取，浓缩后喷雾干燥，或直接喷雾干燥，生产一种抗菌肽产品。这种抗菌脂肽以一定的效价添加至肉鸡基础日料中，提高了饲料利用率，并对肉鸡的生长发育和免疫力增强均有较好的效果。本发明菌株枯草芽孢杆菌为安全的微生物，其抗菌产物安全性高。另外与目前肉鸡饲料中使用的黄霉素相比，具有更好的效果，对取代饲料抗生素添加和保障食品安全具有重要意义。
文档编号C12P21/00GK101974586SQ20101025624
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者别小妹, 吕凤霞, 王恬, 王昱沣, 都海明, 陆兆新 申请人:南京农业大学