专利名称：一种高产纳豆激酶液体发酵方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域。涉及纳豆激酶高产菌株的选育，豆粕酶解液制品和 纳豆激酶的液体发酵方法。
背景技术：
血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之 首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。目前临床上治疗血栓主要是通过注射链激 酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)、组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type Plasminogen Activator, t-PA)和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(Single-chain Urokinase Type Plasminogen Activator, scu-PA)等。这些药物均为纤溶酶原激活剂，通 过激活纤溶酶原生成纤溶酶而降解纤维蛋白。但在实际应用中它们都具有一定的局限性， 或毒性强，副作用大，或体内半衰期比较短，或生产成本高，价格昂贵等，难以成为适用的大 众药品。1987年须见洋行在日本的传统发酵食品纳豆中发现了一种具有强烈纤溶活性的 酶，定名为纳豆激酶(Nattokinase，·)，是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由 纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，它可分泌到细胞外。 研究表明，NK是一种丝氨酸蛋白酶，能显著溶解体内外血栓，具有很强的纤溶活性，不但能 直接作用于纤溶蛋白，而且还能激活体内纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量与作用。纳 豆激酶在人体的活性半衰期远远超过目前临床上治疗血栓所使用的溶栓制剂和半衰期，一 般在8 10小时。此外纳豆激酶也具有一定的激酶作用，可激活内源酶原。具有安全性 好，作用迅速，成本低，可由细菌发酵生产等优点，可用于开发新一代溶栓剂或保健食品，是 一种很有潜力的新型口服溶栓药物，具有极为广阔的前景。由于纳豆激酶具有目前市场上正在使用的溶栓药物所不具有的优点，那么提高纳 豆激酶的单位产物的酶活力和生产效率对纳豆激酶的推广具有重要的意义。在发酵的方 式上，纳豆激酶现在的生产方式主要是以发酵为主，发酵工艺有液体发酵和固体发酵两种。 传统发酵方式为固体发酵即直接以黄豆为原料进行发酵产酶，产物即传统食品纳豆。这种 方式的特点是操作比较简便、工艺简单，但是若想进一步分离提取纳豆激酶却十分复杂，同 时，纳豆具有的特殊气味直接影响人们对它的接受程度。从工业角度考虑，由于固态发酵易 染菌，难散热，回收率低，很难满足有严格要求的药品尤其是生物制品的生产要求，因此我 公司采用纳豆激酶的液态发酵方式，解决了纳豆激酶工业化放大的技术难题，同时也为后 期提取纯化降低了成本。目前关于纳豆激酶的液体发酵的专利有申请号为02116667的发 明专利申请、申请号为02121352. 6的发明专利申请、申请号为200610129353. 7的发明专利 申请，以及纳豆激酶液体发酵的优化和分离纯化及酶学性质的研究》、《纳豆激酶高产菌株 筛选及发酵工艺优化研究》、《纳豆激酶的发酵工艺及其制剂学研究》等文章。分别介绍了不 同纳豆激酶液体发酵的方法，其所用主要原料为大豆蛋白胨，酵母膏、牛肉膏为原料直接进 行发酵，这些方法生产的纳豆激酶的酶活并不高，而且价格较贵，因此在纳豆激酶的工业化生产上受到了一定的限制。本发明的目的就是针对液体发酵方法的不足，提供一种自己筛 选的纳豆激酶的高产菌株，并采用豆粕酶解液作为氮源进行液体发酵的方法，，节约了成本 的同时也提高了纳豆激酶的生产效率和酶活。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产纳豆激酶液体发酵方法，克服现有技术的不足， 提供一种产酶率高，酶活力强的纳豆激酶菌株，提供一种提取工艺简便易行，节省能源和原 料，成本低，对环境的污染少的液体发酵工艺。采用纳豆激酶的固体发酵高产菌株H-13，经 诱变驯化筛选得到的用于液体发酵的高产菌株W-0923，以大豆蛋白胨为氮源进行摇瓶阶段 的发酵，以豆粕的胰蛋白酶解液作为主要的氮源进行IOL液体发酵。本发明的技术方案为一种高产纳豆激酶液体发酵方法，包括以下步骤(1)纳豆激酶液体发酵菌株的筛选及诱变驯化选用纳豆固体发酵高产菌株H-13，采用紫外，微波诱变，高浓度纤维蛋白原驯化平 板的方法进行纳豆激酶高产菌株的筛选，得到高产菌株W-0923。确定了紫外线诱变菌株的 最适条件为40W紫外灯，照射距离为30cm，菌悬液浓度为100个/mL，照射时间为20s。微波 诱变的最适条件为频率为2450MHz的700W微波炉进行微波诱变，最适菌悬液浓度IO4个 /mL，作用时间为5s。(2)豆粕酶解液的制备取豆粕(蛋白含量约为43% )，磨碎，加水拌勻，调节pH值，加入胰蛋白酶，加入 量为豆粕重量的2 %，水浴5 7个小时，反应结束后，在加热灭活，冷却至室温，再经板框 过滤，即得豆粕酶解液。过滤后的豆粕酶解液呈黄色，PH值在7左右，其氨基氮的含量为 0.2%，胨的含量7%。按照大豆蛋白胨相关指标氨基氮为3.1% (干基)，胨含量为80% (干基)，本发明加入20%的豆粕酶解液作为氮源代替2%的大豆蛋白胨。(3)发酵1)摇瓶发酵工艺摇瓶液体发酵培养基的组成麦芽糖，2%大豆蛋白胨、0.4% KH2PO4^O. 05% MgS04、0. 02% CaCl2 ；摇瓶发酵的最优条件为温度为37°C，初始pH为7. 2，培养基装液量为 20mL/100mL三角瓶，接种量2%，摇床转速为120r/min。在最优摇床发酵条件下，结合经过 优化后的液体发酵工艺，摇瓶液体发酵酶活可以达到1400IU/mL。2) IOL发酵罐的发酵工艺在IOL发酵罐中，我们用豆粕的蛋白酶解液来代替大豆蛋白胨作为氮源，搅拌联 动控制溶氧，分阶段控制溶氧在30%以上，发酵周期为65-80h，发酵单位可以达到2650IU/ mL，基本解决了纳豆激酶液体发酵工业化生产的瓶颈问题。与已有的纳豆激酶发酵技术相比，本发明的优点在于产酶率高，酶活力强，提取 工艺简便易行，节省能源和原料，在提高NK产量的同时，降低了生产成本，对环境的污染少 为工业化生产奠定了基础。
具体实施例方式1、纳豆激酶液体发酵菌株诱变驯化
1)菌悬液的制备方法将经新鲜斜面活化24h的菌体接人液体种子培养基中，于37°C、200r/min振荡培 养至指数生长期，离心收集菌体，用灭菌的生理盐水洗涤2-3次后，移入装有灭菌玻璃珠的 三角瓶内振荡，制成细胞浓度为IO6-IO8个/mL的菌悬液。2)紫外微波诱变将种子液的稀释度为100个/mL，在超净工作台上，取5mL即处理时的菌悬液的浓 度在菌悬液于无菌平板中，置于磁力搅拌器上，调整培养皿至紫外灯(40W)的距离为30cm。 打开紫外灯预热20-30min，然后在黑暗条件下，打开皿盖，边搅拌边用紫外线照射，时间为 20s。3)微波诱变调整700W微波炉频率为2450MHz，取IOml细胞浓度为IO4个/mL的菌悬液细胞悬 液置于灭过菌的直径为90mm的培养皿中，将培养皿置于微波炉中，开启微波炉，作用时间 为5s，关闭微波炉。4)高浓度纤维蛋白平板驯化纤维蛋白平板法称取标准纤维蛋白原粉，溶于0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS， PH = 7. 4)中，配制成高浓度的纤维蛋白原溶液，取9mL该溶液与lmL20U/mL的凝血酶溶液， 混勻后倒平板置于37°C下温育，至凝结成乳白色凝块。将上述诱变后的菌株取0. 2mL涂于 板上，37°C恒温培养，筛选出具有抗高浓度纤维蛋白原的菌株。2、摇瓶发酵工艺实施例培养基的配置麦芽糖10g，大豆蛋白胨 20g、KH2PO4 4g、MgSO4 0. 5g、CaCl2 0. 2g、 蒸馏水lOOOmL，用NaOH调pH至7. 2，加热沸腾，放置室温，分装到50个IOOmL的三角瓶中， 高温灭菌30min，放置室温。发酵在超净工作台上，将菌种接入上述的三角瓶中，温度控制37°C，培养基装液 量为20mL/100mL三角瓶，接种量2%，摇床转速为120r/min，时间为24h。3、IOL发酵罐的发酵工艺实施例豆粕酶解液的制备取豆粕(蛋白含量约为43% ) lkg，磨碎，加入50kg水拌勻，调 节PH值至7. 0-7. 5左右，加入20g胰蛋白酶，55°C水浴5 7个小时，反应结束后，在100°C 沸水浴中加热灭活lOmin，冷却至室温，再经板框过滤，即得豆粕酶解液。将上述豆粕酶解液 直接打入配料罐中备用。发酵液的配置豆粕的蛋白酶解液(代替大豆蛋白胨作为氮源)2kg，麦芽糖100g， KH2P0440g、MgSO4 5g、CaCl2 2g、蒸馏水8L，调pH至7. 2左右，定容到10L，高压灭菌，放置室发酵按接种量2 %的比例接入菌种，温度控制37 °C，搅拌联动控制溶氧在30 %以 上，发酵周期为65-80h。上述实施例，只是本发明的较适实施例，并非用来限制本发明的实施范围，故凡以 本发明权利要求所述的构造、特征及其原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权 利要求之内。
权利要求
一种高产纳豆激酶液体发酵方法，其特征在于采用自选纳豆激酶的高产菌株，以大豆蛋白胨为氮源进行摇瓶阶段的发酵。以豆粕酶解液作为主要的氮源进行10L液体发酵，其过程包括菌种的选育，豆粕酶解液的制备，高压灭菌，接种，发酵。
2.关于权利要求1的一种高产纳豆激酶液体发酵方法，其特征在于所用菌株为纳豆固 体发酵高产菌株H-13经诱变驯化得到的用于液体发酵的高产菌株W-0923，该菌株属枯草 芽孢杆菌属纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)
3.关于权利要求1所述的摇瓶发酵，其特征在于摇瓶液体发酵培养基的组成为麦 芽糖，2%大豆蛋白胨、0. 4% ΚΗ2Ρ04、0· 05% MgS04、0. 02% CaCl20
4.关于权利要求1所述的摇瓶发酵，其特征在于摇瓶发酵的条件为温度37V，初始 PH为7. 2，培养基装液量为20mL/100mL三角瓶，接种量2 %，摇床转速为120r/min，发酵周 期为24h。
5.关于权利要求1所述的IOL发酵，其特征在于所用的氮源为豆粕酶解液，其制备过 程是将豆粕磨碎后加水拌勻，调节PH值至7. 0-7. 5左右，加入胰蛋白酶，加入量为豆粕重 量的2%，55°C水浴5 7个小时，反应结束后，在100°C沸水浴中加热灭活IOmin，冷却至室 温，再经板框过滤，即得豆粕酶解液。
6.关于权利要求1所述的IOL发酵，其特征在于IOL发酵罐中培养基的组成为麦 芽糖，20%豆粕酶解液、0. 4% KH2PO4、0· 05% MgSO4、0· 02% CaCl2。
7.关于权利要求1所述的IOL发酵，其特征在于IOL发酵罐中发酵条件为温度 370C，pH为7. 2，接种量2%，搅拌联动控制溶氧，分阶段控制溶氧在30%以上，发酵周期为 65-80h。
全文摘要
本发明公开了一种高产纳豆激酶液体发酵方法，包括发酵的配方和条件。本发明选用纳豆固体发酵高产菌株，对其进行诱变驯化，筛选出纳豆激酶的高产菌株，再将其接入液体培养基进行发酵，在摇瓶液体发酵下酶活可以达到1400IU/mL。本发明采用了豆粕酶解液来作为中试发酵的氮源，在10L发酵罐中，发酵单位可以达到2650IU/mL。采用本技术方案，得到的发酵产物的纳豆激酶产率高，酶活力强，节省原料，节省能源，所用的原料来源方便且丰富，成本低，提取工艺简便易行。
文档编号C12R1/125GK101979531SQ201010292119
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者张云峰, 曹晓琴, 李军, 胡伶俐, 谢明利, 陈晓炜 申请人:湖北国力生物技术开发有限公司