专利名称：一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及 其菌剂和应用。
背景技术：
大豆苷原(Daidzein)属于大豆异黄酮(Isoflavones)的一种。大豆异黄酮包括 大豆苷原(Daidzein)、染料木素(Genistein)、黄豆黄素(Glycitein)等十二种成分。大豆 籽粒中约50%-60%的大豆异黄酮为染料木素，30%-35%为大豆苷原,5%-15%为黄豆黄 素。从20世纪80年代起，很多研究报道以及动物实验表明，大豆异黄酮具有弱雌激素活 性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和控制白血病、骨质疏松、 胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多种疾病的发生，尤其是对乳腺癌、前列腺癌有积极的预防 和治疗作用。在动物生产上，可以促进动物生长，提高繁殖能力，增强机体免疫，改善 动物产品品质，提高生产性能。家畜、家禽最常用的日粮类型是玉米豆粕型日粮，以日采食量600g左右的生长 猪为例，一天摄入大豆异黄酮的量约Ig左右，但是摄入动物体内的大豆异黄酮，不能被 动物自身分泌的消化酶直接降解，尤其是生物活性更高的大豆苷原的代谢终产物雌马酚 只能由肠道细菌特异性产生 。对雌马酚的生物特性研究表明，大豆苷原的生物活性效用 取决于个体的雌马酚产生能力。而不同人体内大豆异黄酮降解菌的组成有很大差异，仅 有1/3至1/2的被调查个体具有将大豆异黄酮降解为雌马酚的细菌存在。猪肠道雌马酚 产生菌的分布同样存在个体差异，我们的一项研究中检测了 12头猪肠道细菌的产雌马酚 能力，结果表明2/3猪的肠道细菌能降解大豆苷原产雌马酚。目前人用的大豆苷原制品都为豆科植物来源的纯提取物，不仅得率低、价格昂 贵，而且正是由于不同人群体内大豆苷原降解菌组成的差异导致了临床应用效果的个体 差异，限制了大豆苷原制品的应用。因此，分离并开发应用大豆苷原降解菌，既可直接用于改善肠道微生物区系结 构，使不具雌马酚产生能力的人或动物，通过口服菌剂获得雌马酚产生能力，从而提高 从日粮中摄入的大豆苷原的功效；也可通过微生物发酵工程方法，提高大豆及其发酵产 品的生物活性。总之，无论以何种方式应用，动物肠道大豆苷原降解菌的筛选和开发应 用对提高饲料大豆利用效率及其经济附加值，改善宿主动物健康、提高其生产性能等均 有着显著的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对上述生产实践中的实际问题和需求，提供一株降解大豆 苷原产生雌马酚的菌株。本发明的另一目的是提供一种双酶梭菌益生菌剂。本发明的又一目的是提供该双酶梭菌的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现一株降解大豆苷原(daidzein)产生雌马酚(equol)的双酶梭菌(Hostridium bifermentans)，2007年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC N0.1995。
本发明提供的降解大豆苷原(daidzdn)产生雌马酚(equol)的双酶梭菌 {Clostridium bifermentans) CGMCC N0.1995主要生物学特性为革兰氏阳性(G+)，严格 厌氧生长，菌体直或微弯，产芽孢，芽孢卵圆，偏心到次端生，无芽孢外壁和附属丝， 端圆，单个或成对，能形成短链，偶见长链；能利用葡萄糖、麦芽糖和半乳糖氧化产 酸；能耐低pH值(pH2.5)及高胆盐浓度(l-3mg/L)；能以大豆苷原为唯一碳源进行 生长，将其转化为雌马酚。
一种双酶梭菌益生菌剂，通过如下方法制备1)将双酶梭菌CGMCC N0.1995斜面菌种接种于液体发酵培养基中，振荡试管培 养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入IOOml液体发酵培养基(发酵瓶容 量约140ml)，37°C培养至对数生长期，全流程培养时间为小时，发酵结束后菌体 数量达到10亿个/ml以上；3)发酵瓶中的菌液离心，所得菌泥即为本发明双酶梭菌益生菌剂。
其中，所述的液体发酵培养基配方为胰蛋白胨20 g/L ；牛肉浸膏10 g/L ；酵 母膏 6 g/L ；葡萄糖 4 g/L ； K2HPO4 2 g/L ； KH2PO4 1 g/L ； MgSO4 0.4 g/L ； CaCl2 0.2 g/ L ； FeSO4 0.1 g/L；盐酸半胱氨酸0.5 g/L ；通入CO2 20η ι除氧后调pH值至7.2-7.4，分 装后高压灭菌(121 °C，15 min)。
所述的双酶梭菌斜面培养基为BHI琼脂固体培养基配方为营养成分(脑/心 浸出物或蛋白胨)27.5 g/L，D( + )葡萄糖 2.0g/L，NaCl 5.0 g/L，Na2HPO4 2.5 g/L, 琼月旨15.0 g/L。
所述的离心条件是3000Xg，4°C下离心10分钟。
所述的双酶梭菌CGMCC N0.1995在制备动物饲料中的应用。
所述的双酶梭菌CGMCC N0.1995在制备清除胆固醇的制剂中的应用。
所述的双酶梭菌CGMCCN0.1995在制备大豆或豆粕发酵剂中的应用。
本发明的有益效果本发明双酶梭菌CGMCCN0.1995，可降解大豆苷原产雌马酚，较大程度的降低大鼠 血清低密度脂蛋白含量，显著提高高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值，有利于大鼠体 内胆固醇的清除，有利于宿主健康。
本发明双酶梭菌CGMCC N0.1995益生菌剂即可直接被动物口服，通过调整动 物肠道微生态的方法来加强动物对大豆中活性物质大豆苷原的利用，保障动物健康，改 善胴体脂肪品质，适用于现代农业生产中绿色无公害畜产品的生产。
该菌剂生产和使用成本较低，菌剂的使用可克服雌马酚价格昂贵且不稳定、不 宜长久保存的缺点。该菌剂既可用于直接口服、绿色安全，也可用于大豆或豆粕发酵。
本发明双酶梭菌CGMCC N0.1995也可用于豆粕发酵，利用微生物的方法降解 豆粕中的大豆苷原(Daidzdn)生成生物活性更高的代谢产物雌马酚(Equol)，充分发挥豆粕中天然大豆异黄酮的保健和促生长功能，从而提升大豆及大豆制品的经济附加
值。 菌种保藏信息
双酶梭菌(Clostridium bifermentms) ζχ-7,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会
普通微生物中心，地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所， 保藏号为CGMCCN0.1995，保藏日期为2007年4月16日。
图1双酶梭菌CGMCC NO. 1995菌落照片。图2双酶梭菌CGMCC NO. 1995革兰氏染色1000倍放大光镜照片。图3分子指纹技术显示大豆苷原对猪肠道细菌的选择性。图4无菌组肠道细菌对大豆苷原代谢的HPLC图谱。图5加菌组肠道细菌对大豆苷原代谢的HPLC图谱。图6双酶梭菌CGMCCN0.1995生长曲线。图7双酶梭菌CGMCC N0.1995 pH变化曲线。图8双酶梭菌CGMCC N0.1995大豆苷原生物转化曲线。图9双酶梭菌CGMCC NO. 1995酸耐受结果。图10双酶梭菌CGMCC NO. 1995胆盐耐受结果。图11双酶梭菌CGMCC NO. 1995发酵豆粕中β -葡萄糖苷酶酶活变化及大豆苷 原浓度、雌马酚浓度。图12 SD大鼠体重结果。图13 SD大鼠血液中总胆固醇的浓度。图14 SD大鼠血液中高密度脂蛋白胆固醇的浓度。图15 SD大鼠血液中低密度脂蛋白胆固醇的浓度。图16 SD大鼠血液中(高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇)比值。
具体实施例方式实施例1菌株的分离和鉴定
取健康成年猪新鲜粪样置于无菌、厌氧的BHI-大豆苷原肉汤，旋涡混合仪将其混 勻，于厌氧工作站中进行梯度稀释后，涂布于BHI-大豆苷原琼脂平板上，于厌氧工作站 中37°C培养至菌落形成。挑取形态差异明显的单菌落纯化后分别接种于BHI-大豆苷原 肉汤中，37°C培养后使用HPLC对培养液中大豆苷原和雌马酚含量进行检测(图4和图 5)。筛选出能够降解大豆苷原产生雌马酚的菌株双酶梭菌zx-7 (CGMCC NO. 1995)， 其菌落照片和革兰氏染色照片见图1、图2，Clostridium bifermentans,主要生物 学特性为G+，严格厌氧生长，菌体直或微弯，产芽孢，芽孢卵圆，偏心到次端生，无 芽孢外壁和附属丝，端圆，单个或成对，能形成短链，偶见长链；从葡萄糖、麦芽糖和 半乳糖能氧化产酸。该菌能以大豆苷原为唯一碳源进行生长，将其转化为雌马酚。在 实验室条件下，大豆苷原经该菌剂转化后生成的雌马酚浓度可达到20 μ g/ml以上(图 8)。转化实验方法如下将大豆苷原添加入BHI肉汤培养基，使培养基中大豆苷原浓度 为 200ymol/L，1% 接种 zx_7，37°C厌氧培养，分别于 Oh、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取样用于HPLC测定大豆苷原和雌马酚浓度。
实施例2菌株生长特性实验 2.1生长特征测定将双酶梭菌zx-7 (CGMCCN0.1995)接种入液体发酵培养基，于37 °C厌氧培养， 通过722分光光度计测定细菌培养液在660nm处吸光值绘制出生长曲线(图6)，使用 pH计测定培养液中pH值绘制出pH值变化曲线(图7)。
液体发酵培养基配方为胰蛋白胨20 g/L ；牛肉浸膏10 g/L ；酵母膏6 g/L ； 葡萄糖 4 g/L ； K2HPO4 2 g/L ； KH2PO4 1 g/L ； MgSO4 0.4 g/L ； CaCl2 0.2 g/L ； FeSO4 0.1 g/L ；盐酸半胱氨酸0.5 g/L。
2.2碳源利用实验使用碳源利用培养基(培养基配方(g/L) (NH4) SO4 2.0 ； MgS04.7H20 0.2 ； NaH2PO4 ； CaCl2 · H2O 0.1 ； K2HPO4 0.5 ；蒸馏水 IOOOml ；碳源 10。向培养基中通入 CO2 20min除氧后调pH值至7.2-7.4，115°C, 15 min高压灭菌)检测细菌对葡萄糖、 麦芽糖、蔗 糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖、阿拉伯糖、核糖、松三糖、 果寡糖、异麦芽低聚糖、半乳低聚糖、菊糖、木糖、淀粉、果胶、大豆苷原的利用情 况。以接种后M小时的pH值和OD66c/变化为判别依据，发现双酶梭菌zx-7 (CGMCC N0.1995)能够在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、半乳糖、异麦芽低聚糖、半乳低聚糖及 大豆苷原作为唯一碳源的培养基中充分生长。
实施例3菌株的耐酸和耐胆盐特性实验 3.1 pH值对双酶梭菌zx-7存活的影响将进入对数生长后期的zx-7 (CGMCC N0.1995)菌接种入已经用lmol/L HCL调 pH值分别为1.5、2.5、3.5和7.2的三组培养液(对照组即液体发酵培养基、lOmg/L大 豆黄酮组即液体发酵培养基中加入10mg/L大豆黄酮、50mg/L大豆黄酮组即液体发酵培 养基加入50mg/L大豆黄酮)中，于37 °C厌氧培养，在O和3h时间点取细菌培养液涂板 (BHI琼脂固体培养基)计数(图9)。 结果表明，在pH7.2时，处理3小时后，其活 菌数显著上升，菌株呈正常生长态势；在pH3.5时，处理3小时后，活菌数基本无变化； 在pH值为2.5和1.5时，处理3小时后，双酶梭菌sc-7 (CGMCC NO. 1995)的存活率 分别为53.1%和39.8%，说明对双酶梭菌zx-7 (CGMCC NO. 1995)的存活有不同程度 的抑制，因此双酶梭菌zx-7 (CGMCCN0.1995)可耐受pH2.5以上的条件。而不同浓 度的大豆黄酮对双酶梭菌zx-7 (CGMCC N0.1995)的耐酸特性没有影响。
3.2胆盐对双酶梭菌zx-7存活的影响将进入对数生长后期的双酶梭菌zx-7 (CGMCC N0.1995)菌接种入不同底物浓度 (O、10mg/L大豆黄酮组、50mg/L大豆黄酮组)和不同胆盐浓度(O、lmg/L和3mg/ 1)的液体发酵培养基中，分别在O和30η ι时涂板(BHI琼脂固体培养基)计数(图 10)。结果表明，该菌在lmg/L和3mg/L的胆盐浓度下存活率分别为60%和40%，具 有一定的耐受性；10mg/L大豆黄酮在3mg/L胆盐浓度下一定程度上提高了细菌的存活 率(但差异不显著)。
实施例4.应用双酶梭菌zx-7 (CGMCC N0.1995)发酵豆粕试验将双酶梭菌zx-7 (CGMCC N0.1995)以5%接种于市场购得的普通豆粕，37°C恒温厌氧发酵，分别于Oh，6h，12h，24h，36h，48h，60h, 72h取样测定发酵豆粕中β-葡萄糖苷酶酶活变化及HPLC测定大豆苷原浓度、雌马酚浓度(图11)。同时HPLC测定 市售品牌(普罗宝)发酵豆粕发酵前后豆粕中大豆异黄酮和雌马酚的含量(表1)。结 果表明，双酶梭菌zx-7 (CGMCC NO. 1995)相对于商品发酵豆粕所用菌株，其产雌马 酚能力显著高于后者，双酶梭菌zx-7 (CGMCC NO. 1995)发酵豆粕发酵前后雌马酚含 量分别是16.76ug/g和33.89ug/g，提高了 102%，而普罗宝发酵豆粕发酵前后雌马酚含量 分别是 13.76 和 16.31ug/g，提高了仅 18.53%。说明双酶梭菌 zx_7 (CGMCC NO. 1995) 有很好的应用于豆粕发酵工业的前景。表1市售普罗宝发酵大豆粕发酵前后12种大豆异黄酮和雌马酚含量
权利要求
1.一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌〈Clostridium bifermentans) ζχ-7,2007年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC Ν0.1995。
2.一种双酶梭菌益生菌剂，其特征在于通过如下方法制备(1)将双酶梭菌CGMCCΝ0.1995斜面菌种接种于液体发酵培养基中，振荡试管培 养至对数期；(2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入IOOml液体发酵培养基，37°C培养 至对数生长期，全流程培养时间为24-48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以 上；(3)发酵瓶中的菌液离心，所得菌泥即为本发明双酶梭菌益生菌剂。
3.根据权利要求2所述的双酶梭菌益生菌剂，其特征在于所述的液体发酵培养基配方 为胰蛋白胨20g/L;牛肉浸膏10g/L;酵母膏6g/L;葡萄糖4g/L; K2HPO42 g/L； KH2PO4 1 g/L ； MgSO4 0.4 g/L ； CaCl2 0.2 g/L ； FeSO4 0.1 g/L ；盐酸半胱氨酸 0.5 g/L ； 通入CO2 20min除氧后调pH值至7.2-7.4，分装后高压灭菌。
4.根据权利要求2所述的双酶梭菌益生菌剂，其特征在于所述的离心条件是 3000Xg, 4°C下离心10分钟。
5.权利要求1所述的双酶梭菌CGMCCNO. 1995在制备动物饲料中的应用。
6.权利要求1所述的双酶梭菌CGMCCN0.1995在制备清除胆固醇的制剂中的应用。
7.权利要求1所述的双酶梭菌CGMCCNO. 1995在制备大豆或豆粕发酵剂中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物技术领域，公开了一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用。降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)zx-7，2007年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.1995。该双酶梭菌CGMCCNO.1995可降解大豆苷原产雌马酚，较大程度的降低大鼠血清低密度脂蛋白含量，显著提高高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值，有利于大鼠体内胆固醇的清除，有利于宿主健康，可在制备动物的饲料中应用，也可在制备清除胆固醇的制剂中应用，还可在制备大豆或豆粕的发酵产品中应用。
文档编号C12P17/06GK102021130SQ20101051334
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者姚文, 孙小燕, 张逊, 郑卫江, 黄莎娜 申请人:南京农业大学