专利名称：一种受高温诱导的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种分离和利用核酸的启动子片段及其应用。
背景技术：
启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列， 通常位于基因上游。一个典型的启动子包括CAAT2box和TATA2box，它们分别是依赖DNA 的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。在核心启 动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活 或抑制基因的转录。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启 动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子 的相互作用是启动子调控基因转录的实质。根据启动子的转录模式可将其分为3类组 成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子[路静等，2004，自然科学进展14 (8) 856-862]。在基因工程领域中，诱导型启动子的应用具有重要作用。与组成型启动子与组织 器官特异性启动子相比，诱导型启动子有着独特的优点它可根据需要在植物特定的发 育阶段、组织器官或生长环境下，快速诱导基因转录的开与关[路静等，2004，自然科学 进展14 (8):856-862]。按诱导因素不同分为化学诱导启动子，对激素响应的启动子，受发 育信号和环境因子调控的启动子等。根据目的基因的特点和研究目的不同，采用与之相适 应的启动子类型。高温胁迫在自然条件下广泛存在，很多生物在长期的进化过程中形成了应对 高温胁迫的一套防护机制，通常将这种现象称之为热激响应。热激响应的特点是 在体内合成一些特殊的“热激蛋白”，通过稳定膜结构和一些生物大分子以及协
助变性蛋白质降解来执行保护功能。一些小分子热激蛋白的启动子已经被广泛的 应用在一些领域中，如拟南芥私X^Gmhsp 17. 4的启动子，被用来调 控植物细胞或器官中次级代谢产物的表达[Shinmyo Aet al. (1998) Metabolic engineering of cultured tobacco cells. Biotechnology and Bioengineering 58:329 -332 ；Yoshida, K. et al. (1995) Heat-inducible expression system for a foreign gene in cultured tobacco cells using the HSP18. 2 promoter of Arabidopsis thaiiana. Applied Microbiology and Biotechnology 44:466—472]禾口/]、#〒 RNAi 白勺 研究(Masclaux, F. et al. (2004) Gene silencing using a heat-inducible RNAi system in Arabidopsis. Biochemical and Biophysical Research Communications 321:364-369)以及 FLP 的热诱导剪切(Lyznik, L. A. et al. (1995) Heat-inducible expression of FLP gene in maize cells. Plant J. 8:177-186)等。拟南芥hsp70s 由 16个成员组成，其中5个成员在细胞质中，2个在叶绿体内，3个在内质网，2个成员在 线粒体中，另外2个在质体间质中，还有2个至今未知其具体定位。J幼SP7你是细胞质内HSP70家族的成员之一，已经有大量的文献集中在HSP70的功能上，即在热激响应中充当 分子伴侣。Simg在2001年用RT-PCR的方式研究HSP70家族每个成员的表达模式[Sung et al. (2001) Comprehensive Expression Profile Analysis of the Arabidopsis Hsp70 Gene Family. Plant Physiology 126: 789 - 800]，其中成员之一的 Ji^SPZ泌的表 达只受热诱导，而不受低温诱导，且与发育阶段无关。此外，来源于果蝇的hsp70启动子可 以驱动GUS在烟草中表达[Spena, A. et al. (1985) Construction of A Heat-Inducible Gene for Plants Demonstration of Heat-Inducible Activity of the Drosophila Hsp70 Promoter in Plants. Embo Journal 4:2739-2743; Spena, A. and Schel1， J. (1987) The Expression of A Heat-Inducible Chimeric Gene in Transgenic Tobacco Plants. Molecular & General Genetics 206:436-440]。由于热激现象的普遍存在、热激响应元件的序列保守性和你启动子表达 的专一性，本发明分离了一组你DNA启动子片段。这些启动子片段被用于建立一套 高温诱导基因表达的系统，并在转基因植物中调控外源基因的表达。
发明内容
本发明的目的在于应用适当的高温诱导控制转基因植物和植物组织中基因的选 择性表达，并由此提供一种受高温诱导的启动子及其应用。本发明提供的受高温诱导的启动子，来源于拟南芥中对高温敏感的基 因,AtHSP70b。将编码所希望的目的产物基因的核酸序列和一个上述启动子片段融合得到 重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中 的目的基因的表达受合适的高温诱导调控。本发明提供的源于拟南芥且对高温敏感的核酸启动子片段，在用适当的高温诱导 后，具有启动子片段的转基因植物中与该启动子片段连接的编码特定蛋白的基因的表达水 平将会上升。本发明提供核酸启动子片段，它调控SEQID No:l cDNA表达的基因，其核苷酸序列 如 SEQID No:2,SEQID No:3,SEQID No:4,SEQID No:5,SEQID No:6 或 SEQID No:7 所示。这 些序列包含受高温诱导的调控元件和不同的组织特异性表达元件等。本发明还提供一重组DNA载体。该载体含有上述核苷酸序列作为启动子。该载 体可转化植物，包含本发明中的一个核酸启动子片段、与该启动子相连编码特定基因的DNA 顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在适当的高温诱导下，特定基因产 物水平上升。本发明的还包括用本发明的重组DNA结构转化植物，这种转基因植物用适当的高 温诱导后可引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述 启动子片段的3’端。这样的转基因植物的种子同样认定为该发明的体现。这个发明的最后一方面包括在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，它 有几个步骤组成a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；b)用适当的高温处理转基因植 物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。
图1 pCAMBIA1301你系列载体构建示意图。图2 经PCR分析农杆菌LBA4404中A tHSP70b启动子各构建物的转化。图3 洋葱表皮上pCAMBIA1301 — 1431GUS的瞬时分析。图4 PCR鉴定转基因BY2细胞中的⑶S基因。图5各启动子片段转基因BY2细胞热激诱导后GUS基因的转录本分析。
具体实施例方式实施例\AtHSP70b分段启动子的载体构建及农杆菌转化 1. 1 PCR对应的引物序列 PCAMBIA1301-1431 Fl AGTGAGACCACAACCAGCA Rl CGTCGCCATTGTTGCTAA PCAMBIA1301-992 F2 ATCGAGCTCAAAGTACTGGA R2 TACCCATGGATTGTTGCTAA PCAMBIA1301-504 F3 ATCGAGCTCCACATAAACAGC R2
PCAMBIA1301-375 F4 ATCGAGCTCGAAGACGTAAA R2
PCAMBIA1301-218 F5 ATCGAGCTCAACTCTCTTGTA R2
PCAMBIA1301-125 F6 ATCGAGCTCTCGGATTCG R2
PCAMBIA1301
Ygus CAGGAAGTATGGAGCATCAG ^gus TCGTGCACCATCAGCACGTTA (SEQ ID NO: 14)； 1. 2 PCR程序
拟南芥中 JiW/你启动子 1431bp 的克隆94°C，5min ;94°C，30 sec, 53 "C, 30 sec，72°C，l min 30 sec ；30 个循环；72°C，5 min。PCR 扩增产物通过 1.5% 琼 脂糖电泳进行检测。拟南芥中Jifi5P々％ 18.2 启动子 685bp 的克隆94°C，5min ;94°C，30 sec,52°C,45 sec,72°C,l min ；30个循环；72°C，5 min。PCR扩增产物通过1. 5%琼脂糖电泳进行检测。以构建好的T载体-1431为模板进行系列启动子缺失时的PCR反应程序 94°C，5min ;94°C，30 sec，55°C，30 sec，72°C，l min ；30 个循环；72°C，5 min。PCR 扩增产
(SEQID NO:8)
(SEQID NO:9)
(SEQID NO:10)
(SEQID NO:11)
(SEQID NO:12)
(SEQID NO:13)物通过1. 5%琼脂糖电泳进行检测。构建好的启动子转入农杆菌后的鉴定农杆菌菌液为模板时，先100°C裂解5分 钟。PCR程序同上。转化后抗性烟草BY2克隆鉴定GUS的PCR反应程序94°C，5min -MV, 30 sec，52°C，30 sec，72°C，l min ；30 个循环；72°C，5 min。PCR 扩增产
物通过1.5%琼脂糖电泳进行检测。转化后烟草植株鉴定^依的的PCR反应程序同 BY2细胞。图2是各个转化子的鉴定结果，说明各片断已经插入到PCAMBIA1301载体的相应
位置上。实施例2利用洋葱表皮分析pCAMBIA1301 — 1431中GUS的瞬时表达 构建好的PCAMBIA1301-1431的载体首先用基因枪的方法在洋葱表皮上做启 动子活性分析，同时阳性质粒PCAMBIA1301作为正对照。粒子轰击过的洋葱表
皮在室温下暗培养一天之后，在37°C下处理2小时，同时设置室温条件下培养的洋葱 表皮作为负对照。如图3所示，热激条件下，所构建的pCAMBIA1301-1431中插入的1431bp 能够驱动⑶S表达，而在室温条件下培养的洋葱表皮上没有⑶S表
达。因此，HSP70b的启动子1431bp在热激下有基本的启动子活性。实施例3烟草BY2细胞的转化及抗性克隆的筛选。3. 1农杆菌准备
菌种在添加抗生素的YEB平板上划线，挑单克隆在相应的液体YEB培养 基上少量制备(根据需要)，281，225印111，2天。收集农杆菌菌液，lml，5000rpm，lOmin， 弃去培养基。等体积的IOmM MgS04(过滤灭菌)重悬菌体沉淀，同上述条件离心，收集菌体， 重复一次。将IM的acetosyringone加入到上述重悬的菌体溶液中至终浓度200 μ Μ,培养 2h。3. 2 BY2细胞和农杆菌共培养
收集继代后3天的BY2细胞悬浮物，约4毫升体积，同上述制备好的农杆 菌IOOlOOyL混勻，27°C，暗，静置培养2天。3.3共培养后的洗脱和筛选
共培养后的BY2细胞转入到50毫升的无菌离心管中，加细胞继代的液体 培养基至总体积25毫升，室温，lOOOrpm，离心5分钟。收集菌体沉淀，加入25毫升 液体培养基重悬，离心；菌体沉淀用含抗生素的液体培养基(25mg/L hygromycin+250mg/L cefotaxime)重悬，离心。菌体沉淀用10毫升含上述抗生素的液体培养基重悬，加入等体 积无菌的2%的低熔点琼脂糖(约40°C左右)，混勻。将上述琼脂糖包被的BY2细胞混合物 倒入固体筛选培养基上(含相同抗生素的液体培养基+0. 9%琼脂)，至上层培养基凝固，封培 养皿，在27°C，暗培养。三周后可见抗性克隆。3.4 BY2细胞抗性克隆的PCR鉴定
在25mg/L hygromycin的抗性筛选培养基上生长30天左右，含有你基 因6个启动子片断和pCAMBIA1301转化的BY2细胞逐渐形成，每个不同的转化事件 中挑选10个独立的系，用w·说(⑶S)的一对引物Fgus/Rgus进行PCR鉴定。PCR结果表 明所有的克隆均是阳性的(图4a)。在此实验中，设置pCAMBIA1301为正对照，目的在于检测整个转化体系的有效性。实施例4 RT-PCR检测热激处理的不同片段转基因烟草BY2细胞中⑶S基因的 转录本。4. 1 BY2细胞的热激处理
挑选经PCR鉴定为阳性的BY2细胞，在含有抗生素的液体培养基中培养，取 继代5天的悬浮培养物，迅速转移至37° C的水浴摇床中热激处理2小时，对照保 持在25° C的培养条件，转速130转/分钟。4. 2 RNA 提取
取材料约0. lg。液氮充分研磨后，转移到1. 5ml离心管，加Iml TRI .ol# ( irwitrogen公司)，混勻后，室温放置15分钟，加0. 2ml氯仿异戊醇 (24:1)，剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。取上清液并加入 等体积异丙醇，小心混勻，室温放置15分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。70%乙醇洗涤沉 淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0. 1% DEPC处理过的ddH20水中，贮存于_80°C备 用。4.3 cDNA第一条链的合成
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作 指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2ug制备的总RNA，0.5ul Rnase inhibitor，力口 DEPC 处理过的去离子水至 8. 5ul，2ul 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C，5min,室温放置 lOmin，13000rpm 简短离心5s。再依次加入4μ1 5XFirst-Strand buffer,0.5 μ 1 RNase Inhibitor,2 μ 1 IOOmM DTT, 2μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase ο小心混勻；37°C反转录1小时，90°C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离 心5秒钟，存放于-20°C待用。4. 4 RT-PCR
根据BY2细胞actin的亮度，调整PCR的模板浓度。⑶S基因PCR反应程序94° C， 5min; 94° C (30 s), 55° C (45 s)，72° C (60 s)，各 26 和 30 循环；72° C，5min。如图4b所示，AtHSP70b启动子最小的125bp片断在30循环数下也有转录， 375bp以上的启动子有较高的活性。
权利要求
一基因组DNA分子序列，其特征在于，它调控SEQID No:1 cDNA表达的基因，其核苷酸序列如SEQID No:2、SEQID No:3、SEQID No:4、SEQID No:5、SEQID No:6或SEQID No:7所示；这些序列包含受高温诱导的调控元件和不同的组织特异性表达元件。
2.如权利要求1所述的DNA分子序列在转基因植物中的应用。
3.一组载体，其特征在于它们含有权利要求1所述的DNA分子序列作为启动子。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于该载体可转化植物，它包含一个核酸启动 子片段、与该启动子相连编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载 体后的植物在适当的高温诱导下，特定基因产物水平上升；选择的基因为编码GUS的基因。
5.一种转基因植物，其特征在于用权利要求所述4的载体转化的植物，该转基因植物 用高温处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述 启动子片段的3’端。
6.一种由权利要求5所述的转基因植物获得的种子。
7.—种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，其特征在于具体如步骤如下a)用权利要求所述4的载体转化的植物；b)适当的高温处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。
全文摘要
本发明属基因工程技术领域，具体为一种受高温胁迫诱导的启动子及其应用。本发明包括一种分离和利用核酸的启动子片段,该启动子来源于拟南芥对高温敏感的一个基因,AtHSP70b。将编码所希望的目的产物基因的核酸序列和一个上述启动子片段融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受高温诱导调控。
文档编号C12N15/63GK101979559SQ201010524219
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者宋贺玲, 梁宁菁, 蒯本科, 魏强 申请人:复旦大学