专利名称：一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种分离和利用核酸的启动子片段及其应用。
背景技术：
启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列， 通常位于基因上游。一个典型的启动子包括CAAT2box和TATA2box，它们分别是依赖DNA 的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。在核心启 动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活 或抑制基因的转录。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启 动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子 的相互作用是启动子调控基因转录的实质。根据启动子的转录模式可将其分为3类组 成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子[路静等，2004，自然科学进展14 (8) 856-862]。与组成型启动子与组织器官特异性启动子相比，诱导型启动子有着独特的优 点它可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，快速诱导基因转录 的开与关。根据来源，可将诱导型启动子分为天然的诱导型启动子和人工构建的诱导型 启动子[路静等，2004，自然科学进展14 (8):856-862]。天然诱导型的启动子包括光、 温度、激素，干旱，高盐胁迫，病原菌应答启动子等[路静等，2004，自然科学进展14 (8) 856—862；Narusaka Y， et al. Int eraction between two cis2acting element s，ABRE and DREj in ABA2dependent expression of Arabidopsis rd29A gene in response to dehydrat ion and high2salin ity stresses. Plant Jj 2003, 34 ( 2) : 137 ； Song F Mj et al. Cloning and identificat ion of the promot er of the tobacco Sar8. 2b gene, a gene involved in syst emic acquired resistance. Gene, 2002， 290: 115]。目前研究最多、最深入的人工可诱导表达系统是化学诱导表达系统，如四 环素诱导的TetR系统，地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的 EcR 系统(Gatz C，et al. TnlO encoded Tet repressor can regulate an operator containing plant promoter. Proc Nalt Acad Sci USA, 1988，85:1394; Aoyama T，et al. A glucocorticoid mediated transcriptional induction system in transgenic plant s. Plant J， 1999，11: 605 ； Zuo J，et al. An estrogen receptor based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants. Plant J，2000，24: 265 ； Unger E，et al. A chimeric ecdyson receptor facilitates methoxyfe nozidedependent restoration of male fertility in ms45 maize. Transgenic Res, 2002， 11: 455)。为了满足应用需要，人们开始研究便于在大田使用的诱导表达系统，杀虫剂诱 导的EcR系统就是一个很好的范例.Unger等利用欧洲玉米螟的蜕皮激素配基结合结构域(EcR LBD)、玉米Cl激活域(AD)和GAL4 DNA结合结构域(DBD)构建化学诱导激 活子，把它与玉米ms45最小启动子相连，构建成可受杀虫剂诱导的人工启动子诱导系 统.他们利用该系统在玉米雄性不育突变株ms45中成功地诱导了育性恢复基因MS45的 表达。但是迄今为止，还没有较成熟的在大田中可操作的外源控制植物基因表达的手段 [路静等，2004，自然科学进展 14 (8):856-862;Unger Ε, et al. A chimeric ecdyson receptor facilitates methoxyfe nozidedependent restoration of male fertility in ms45 maize. Transgenic Res, 2002, 11: 455]。本发明集中在来源于植物中受PBZ或其活性代谢物BIT诱导的DNA启动子片段。 这些启动子片段被用于建立一套PBZ或其活性代谢物BIT诱导基因的系统，并在转基因植 物中调控外源基因的表达。它的优势包括这些启动子片段在用合适的化学诱导物处理后 表现出的高活性，在所有实验的植物组织中都有明显的表达，以及没有用化学物质处理后 产生的多效性等。PBZ是日本明治制果公司于1975年注册的主要用于防治水稻稻瘟病的 杀菌剂，是目前日本生产量最大的一种生物保护剂。在离体实验中，PBZ稍有抗微生物活 性。对无致病性的微生物和温血动物低毒、安全，属于一种对环境友好的农药[Yi X.H.，Lu Y. T. Residues and dynamics of probenazole in rice field ecosystem. Chemosphere, 2006，65(4): 639-643]。PBZ 是一种防治稻瘟病{Magnaporthe grisea)的高效抗病性诱 导剂，已经成为东南亚稻区防治稻瘟病使用面积最大的抗病诱导剂。而且该药剂对植物的 正常生长发育无明显影响，对病原菌也没有直接毒性，不易引起抗药性(Kessmarm H. et al. Induction of systemic acquired disease resistance in plants by chemicals. Annu. ReV. Phytopathol. 1994，32:439-459)。因此，这一诱导表达系统可用于在大田中 生长的转基因植物中外源性调控目的基因的表达。
发明内容
本发明的目的在于应用化学物质控制转基因植物和植物组织中基因的选择性表 达，并由此提供一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的启动子及其应用。本发明提供的受化学物质烯丙异噻唑诱导的启动子，来源于拟南芥中对防治 稻瘟病的优良药剂烯丙异噻唑 probenazole (3-allyloxy-l, 2-benzisothiazole-l, l-dioXide，PBZ，商品名Oryzemate)及其相关化合物敏感的基因。将编码所希望的 目的产物基因的核酸序列和一个上述启动子片段融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化 植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受合适的化 学诱导物调控。本发明提供的受化学物质烯丙异噻唑诱导的启动子，它调控SEQID No:l cDNA表 达的基因，其核苷酸序列如 SEQID No:2, SEQID No:3, SEQID No:4、SEQID No:5、或 SEQID No:6所示。这些序列包含受化学物质烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT诱导的调控元 件和不同的组织特异性表达元件等。本发明的源于拟南芥且对PBZ或其活性代谢物BIT的诱导作出应答的核酸启动子 片段，在用化合物诱导后，具有启动子片段的转基因植物中与该启动子片段连接的编码特 定蛋白的基因的表达水平将会上升。本发明的另一方面还提供一重组DNA载体。该载体含有上述核苷酸序列作为启动子。该载体可转化植物，包含本发明中的一个核酸启动子片段、与该启动子相连编码特定基 因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在有化合物PBZ或其活性 代谢物BIT的作用下，特定基因产物水平上升。本发明的另一方面包括用本发明的重组DNA结构转化植物，这种转基因植物用化 合物PBZ或其活性代谢物BIT处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA 顺序经操作连接在所述启动子片段的3’端。这样的转基因植物的种子同样认定为该发明 的体现。这个发明的最后一方面包括在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，它 有几个步骤组成a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；b)用化合物PBZ或其活性代谢 物BIT处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。
图1在线分析似項7基因部分启动子的上游顺式调控元件。图2PCAMBIA1301TV/^7系列载体构建示意图。图3经PCR分析农杆菌GV3101中NPRl启动子各构建物的转化。图4不同启动子片段在转基因烟草中受PBZ诱导的GUS酶活分析。图5洋葱表皮上pCAMBIA1301-1228载体⑶S的瞬时表达分析。
具体实施例方式实施例IAtNPRl基因上游启动子片段的元件分析
我们通 il AGRIS(http//arabidopsis. med. ohio-state.edu/RGNet/)禾口 PlantCARE (http //bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)两个在 线分析工具对所克隆的启动子最长片段做顺式元件分析。根据预测结果，ATG上游-243bp 处为可能的TATA-box区域。根据PlantCARE的分析结果，所克隆的1228bp启动子序列中共 有30多种顺式调控元件(图1)，其中主要包括光响应元件(如G-box，I-box, LAMP-e Iement 等)，W-box (与病原反应有关)、WUN-motif (与伤害响应有关)、AuxRE (与生长素应答有关)， EIRE (激发子响应元件)、ERE (与乙烯响应有关)、HSE (与热激响应有关)与GA (GARE-motif) 和SA (TCA-element)有关的响应元件、DRE (与干旱有关)等。实施例2 NPRl分段启动子的载体构建及农杆菌转化 2. 1 PCR对应的引物序列
NPR1/R1是启动子克隆中3’端的公用反义引物，其余引物均为5’端的正义引物， 分铋与NPRl组成一个引物对，扩增不同长度的基因启动子片段。其中P252、P479、 P615、P936、P1228对应的产物长度依次为252bp、479bp、615bp、936bp和1228bp。引物后括 号内所标数字表示将M^V基因翻译起始位点ATG中的A设为+ 1时此引物两端对应的序 列号码，“ _”表示此碱基位于翻译起始位点上游。2. 2 NPRl基因不同长度片段启动子的载体构建
用上述各引物对，以拟南芥野生型Col-O的基因组DNA为模板，扩增对应长度片段的启 动子，将PCR产物接入T载体，测序正确后，用EcoRI和NcoI将其从T载体上切下，与同样 经过EcoRI和NcoI双酶切的pCAMBIA1301双元载体进行连接并转化大肠杆菌，挑选阳性克 隆，抽提质粒后，用电击法将阳性克隆质粒转化农杆菌(GV3101)，并鉴定阳性转化子，挑选 阳性转化子在三抗(Rif+Gent+Kan)的YEB液体培养基中摇菌，用30%的甘油以体积比1 1进行保菌，存放于-80°C备用。图2是各个转化子的鉴定结果，说明各片断已经插入到 PCAMBIA1301载体的相应位置上。2.3载体构建中常用实验方法。2. 3. 1 DNA限制性内切酶酶切
(1)20μ 1酶切体系，2μ 1 DNA，适量的酶切缓冲液(参见Takara目录)，酶量(0. 2μ 1 酶用于酶切鉴定，0. 5μ 1酶用于酶切克隆)。体系扩大，按比例增大各成分体积；
(2)按以下次序添加水，buffer，DNA，酶，混勻，37 °C反应1. 5-3 h。(最后添加内 切酶)。2. 3. 2玻璃粉制作以及玻璃粉回收DNA片断 玻璃粉制作
(1)用干净的研钵将石英砂磨到足够细，用筛子筛取大小合适的玻璃粉颗粒；
(2)用一倍体积的无菌水悬浮玻璃粉，静置片刻；
(3)当出现分层时，吸取上层混浊液到新的离心管，下层沉淀重复2，3操作；
(4)2000-3000rpm, Imin 离心，去掉上清；(5)无菌水清洗除菌后，以1 1比例用无菌水悬浮玻璃粉 玻璃粉回收DNA片断
(1)称空离心管重量，切胶后，再称重，计算胶的重量；
(2)以Img胶中加入3ul体积6mol/LNaI比例加入Nal，55度烘箱或者水浴中充分溶
解；
(3)加入5-lOul玻璃粉，充分悬浮混勻；
(4)冰浴15min，中间每隔5min轻弹离心管，使沉淀的玻璃粉悬浮起来；
(5)7OOOrpm, Imin 离心，弃上清；
(6)50倍玻璃粉体积加入Rince buffer充分吹打洗涤；
(7)5000印111，11^11离心，再重复6，7两次;
(8)去尽buffer，55度水浴或者烘箱中挥发乙醇5-lOmin;
(9)10-20ulMili-Q水吹打悬浮，Votex充分振荡；
(10)55度烘箱或者水浴中溶解DNA15min，每隔5min轻轻混勻；
(11)13000rpm，2min离心后，取上清
New wash stock solution: 20Xrince buffer:H20: 乙酉享=1 9 10 20Xrince buffer: 0. 2mol/L Tris-Cl (pH7. 5), lmol/L NaCl, 20mmol/L EDTA。乙醇沉淀回收DNA片断
(1)加入1/10体积的3MNaAc ;(酶切体系先用等体积酚氯仿抽提蛋白)
(2)加入2V -20°C预冷乙醇，置于冰上30 min ；
(3)12，000 rpm,离心 10 min ；
(4)1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，55 °C烘干，溶于TE。2. 3. 3载体与基因片段连接 连接缓冲液5.5μ1
插入片段3.0μ1
Τ4连接酶Ι.ΟμΙ
酶切后载体0. 5 μ 1
16 °C连接过夜。2. 3. 4感受态细胞制备以及转化 大管制备感受态细胞
(1)以1:100的比例转接前晚活化的菌种，在37度摇床中280转培养到OD值0. 3，本 实验采用的是大肠杆菌ToplO株系；
(2)将培养液倒入50ml离心管，冰上稍微预冷，4000rpm，IOmin离心；
(3)倒掉上清，加入IOml0. lmol/L CaC12的氯化钙，轻轻打散菌块;
(4)冰上放置30min，2500rpm,IOmin离心(离心后沉淀出现环状为佳)；
(5)倒掉上清，快速放置到冰上，加入2ml0. lmol/L CaC12，轻轻悬浮菌体；
(6)放置在冰上，2小时后即可用来转化。转化
(1)准备42°C水浴；
(2)将200ul感受态细胞和连接液(5-10ul)或者质粒(Iul)加入到离心管中，混勻；(3)冰浴30min后，42°C热激90s，放置在冰上5min ；
(4)转化质粒直接涂板；
(5)转化连接液加入2倍细胞体积的SOC培养液，37°C摇床50-100转预培养(Amp抗 性1小时，Kan, Cm抗性2小时)，本实验采用的是Kan抗性平板；
(6)取200ul混合物涂在含一定量抗生素的LB平板上。37°C倒置培养过夜；
(7)次日早上通过抗性筛选获得阳性克隆。2. 3. 5质粒抽提
(1)挑单菌落到含一定量抗生素的LB液体培养基中37°C摇菌过夜；
(2)取Iml菌液，12000rpm30秒收集菌体，收集两次；
(3)加IOOul冰预冷的溶液I悬浮菌体，加入200ul溶液II，上下颠倒混勻，再加入 150ul预冷的溶液III，上下颠倒混勻，置于冰上5分钟；
(4)12000rpm离心3分钟，转移上清到新的1. 5ml离心管中；
(5)加等体积酚氯仿抽提一次，12000rpm,3分钟，取上相；
(6)加2倍体积冰预冷的无水乙醇，混勻后置于冰上30分钟；
(7)12000rpm离心5分钟，去上清，用70%乙醇洗涤沉淀；
(8)55°C烘干 5 分钟，溶解于 50ul TE (pH 8. 0)，加 0. 5ugRNase, 37°C 消化 30 分 钟。_20°C保存。溶液I:50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl, pH 8. 0 ； 10 mmol/L EDTA, pH 8.0，高压灭菌)
溶液II: 0.2 mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用，不可置于冰上)
溶液III:每100 ml, 60 ml 5 mol/L乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28. 5 ml去离子水。
农杆菌感受态制备及电转化。2. 4. 1农杆菌感受态制备
(1)在Gent (25ug/ml), Rif (20ug/ml)平板上划线，28 度培养；
(2)挑单菌落于同上抗生素YEB液体培养基中，28度培养到0D600=0.5 ；
(3)冰上冷却，5000rpm，4度，IOmin收集菌体；
(4)lmmol/L Hepes ρΗ7· 0 洗涤三次；
(5)10%甘油洗涤一次，悬浮菌体于3ml 10%甘油中；
(6)分装于离心管中，每管40ul。2 XHepes (0. 04mol/L):每 20ml 加入氯化钠 0. 32g，氯化钾 0. 0148g, 12 水磷酸氢 二钠0. 0543g，葡聚糖0. 04g, Hepes 0. 2g，调节pH到7. 05，过滤除菌
利福平甲醇溶解。2. 4. 2 电转化
(1)200ng质粒DNA，40ul感受态细胞，混勻加入电转杯中；
(2)在U (1. 8KV), R (200 Ω ), C (25uF)条件下电转化;
(3)800ul SOC冲洗电转化杯，将洗涤液转移到新的离心管，28度培养1小时；
(4)4000rpm, IOmin 收集菌体；
(5)洗掉上清，留200ul悬浮菌体；
(6)将菌体悬浊液涂在加相应抗生素LB平板，28度培养。
8
实施例3转基因烟草的获得。3.1农杆菌培养1)从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB液 体培养基中(Gent 25 μ g/ml、Rif 20 μ g/ml、Kan 50 yg/ml)于恒温摇床上 28°C，220 rpm摇培过夜至OD 600为0.6-0.8。2)摇培过夜的菌液按1%_2%的比例，转入新配置 的同上抗生素的YEB液体培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，当0D600为 0.4-0.6时将菌液离心收集至管底后即用V2MS液体培养基(pH 5. 4-5. 8)悬浮至0D600 为0.4，用于转化。3.2侵染于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具 Kan抗性的野生型烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5 cm2的小块，放 入菌液中，浸泡适当时间(一般5-10 min)。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
<注 > 同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照，以下步骤同。3. 3共培养将侵染后 的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基(Tl)上，用封口膜封好培养皿， 280C黑暗中培养2-3天。3.4选择培养将黑暗中共培养2-3天的烟草叶片转移到筛选 培养基(T2)中，用封口膜封好培养皿，在光照为2，000-10，000 lux、25-28°C、16/8 hd_l 光暗条件下选择培养。〈注 >:叶盘边缘轻压入培养基中，以增加选择压力。3.5生根培 养及移苗约2-3周后，待不定芽长到1 cm左右时，切下不定芽并转移到生根培养基(T3) 上进行生根培养，5-10天后长出不定根。待植株长到一定大小后，将其移至盆钵中继续生 长。3.6转基因植株的鉴定。3. 6. 1 CTAB小管抽取植物DNA
(1)取样，液氮保存，CTAB65度预热；
(2)研磨棒研磨植物材料，加CTAB600ul，混勻；
(3)65度水浴10-15min，中间轻摇数次；
(4)13000rpm, IOmin离心，转移上清到新的离心管；
(5)等体积酚氯仿异戊醇，约500ul，混勻；
(6)13000rpm, IOmin离心，转移上清到新的离心管；
(7)2/3体积的异丙醇，约400ul，混勻，静置IOmin ；
(8)13000rpm, IOmin 离心，弃上清；
(9)70%乙醇洗涤1-2次，约400ul ；
(10)干燥，加50ulTE，lulRNA酶溶解沉淀。3. 6. 2转基因植物的PCR检测
采用各片段启动子的正向引物和位于GUS基因编码区上的反向引物以各候选转基 因植株的基因组DNA为模板进行扩增。鉴定引物F 各启动子片段的正向引物
R 5' CTTCGCGCTGATACCAGACGTTG 3’ SEQ ID NO: 13 PCR反应的退火温度为58°C 实施例4转基因植株GUS酶活测定 4. 1 PBZ处理方式
将生长于盆钵中的转基因烟草植株用0. 5mM的PBZ溶液以浇灌后根吸收的方式进行处 理，对照用水做平行处理。
4. 2转基因烟草⑶S酶活测定(MUG法)
GUS基因编码β -葡糖苷酸酶，其能将MUG分解为MU，MU在激发波长365nm能产生荧 光，通过检测荧光可以了解MU的生成量，从而对总蛋白中GUS的总酶活进行相对定量。定量
植物于液氮中研磨成粉，加入3倍体积的0. 1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)(含Na2EDTA 10 mmol/L,0. 1% (V/V) Triton X-100,0. 1% (V/V) Sarcosyl, β-巯基乙醇 10 mmol/ L)，制成勻浆。3900Xg离心10 min，收集上清液即为⑶S粗酶液。⑶S活性检测参照 Jefferson (1987)方法进行。酶活力单位定义为每分钟水解4-MUG生成4_MU 1 nmol/L的 酶量为一个单位。GUS表达活性以每毫克蛋白的酶活力表示。蛋白质含量使用BCA蛋白定 量法进行测定。4. 2. 2蛋白定量BCA法
参照上海捷瑞生物工程公司的操作方法 4. 2. 3⑶S酶活测定 操作步骤
(1)将待测植物材料的叶片在液氮中预冷后用研磨棒磨碎，按1 :3的重量体积比加入 GUS抽提缓冲液(50 mM NaPO4, pH 7.0，10 mM dithiothreitol (DTT)，1 mM Na2EDTA, 0. 1% Sodium Lauryl Sarcosine, 0. 1% Triton X 100)。(2)冰浴lOmin，以8000rpm离心5min，收集上清液，根据经验进行相应的稀释后得 到待测酶抽提液。(3)取相应数量小管，加入112. 5 μ 1的MUG于37°C水浴5min预热，同时准备三倍 相应数量小管加入Iml终止缓冲液(0. 2mol/L的Na2CO3)
(4)加入2步骤中得到的酶抽提液75μ 1于MUG中，混勻，立即取出45 μ 1于终止缓冲 液中，作为零点反应，并开始计时。(5)在15min、45min时各取45反应液加入终止缓冲液中。(6)用荧光分光光度计测定lOOnmol/L到Ιμπιο /L的MU标准液，在激发波长 365nm,发射波长为455nm时的荧光值，以MU的浓度为横坐标，以测定的荧光值为纵坐标，作 图得到标准曲线。(7)由此标准曲线和测定的样品的荧光值确定待测酶抽提液的总的GUS酶活，将 其与前面得到的相应的总蛋白，即得到单位重量蛋白的GUS酶活，并换算成以pmol MU/ min/mg蛋白为单位的酶活。对每一个启动子片段载体而言，挑选3至5个单独的转基因株系用于PBZ诱导 前后的GUS酶活测定，每个株系测定两次。各转基因株系经PBZ以根灌的方式处理3天 后检测植株叶片组织中的⑶S酶活，结果显示pCAMBIA1301-1228，pCAMBIA1301-936, PCAMBIA1301-615, pCAMBIA1301-479,pCAMBIA1301-252 这五个不同长度的启动子片段都能 受PBZ处理后诱导G依基因上调表达，最大诱导倍数约4. 5倍左右(图4)。实施例5在洋葱表皮细胞中AtNPRl启动子驱动⑶S的瞬时表达情况分析
将构建好的PCAMBIA1301-1228载体首先用基因枪轰击的方法在洋葱表皮上做启动子 的诱导活性分析，同时以阳性质粒PCAMBIA1301作为实验条件的正对照。粒子轰击过的洋 葱表皮放置于加有0. 5mM PBZ的MS固体培养基上，并于28度下暗培养3天后染色，同时以
10不加PBZ的MS固体培养基上培养的洋葱表皮作为负对照。如图5所示，在有PBZ存在的MS 培养基中，所构建的PCAMBIA1301-1228中插入的1228bp NPRl启动子片段能够驱动⑶S表 达，而在不加PBZ的MS培养基上培养的洋葱表皮上几乎看不见⑶S的表达。因此，基因枪 瞬时转化实验结果表明1228bp长度的启动子在0. 5mM PBZ处理下表现出一定的诱 导活性。
1权利要求
一基因组DNA分子序列，其特征在于，它调控SEQID No:1 cDNA表达的基因，其核苷酸序列如SEQID No:2、SEQID No:3、SEQID No:4、SEQID No:5或SEQID No:6所示，这些序列包含受化学物质烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT诱导的调控元件和不同的组织特异性表达元件。
2.如权利要求1所述的一基因组DNA分子序列在转基因植物中的应用。
3.一组载体，其特征在于它们含有权利要求1所述的一基因组DNA分子序列作为启动子。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于该载体可转化植物，它包含一个核酸启动 子片段、与该启动子相连编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载 体后的植物在有化合物烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT的作用下，特定基因产物水 平上升；选择的基因为编码GUS的基因。
5.一种转基因植物，其特征在于用权利要求4所述的载体转化的植物，该转基因植物 用化合物烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序 表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述启动子片段的3’端。
6.一种由权利要求5所述的转基因植物获得的种子。
7.—种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，其特征在于具体如步骤如下a)用权利要求4所述的载体转化的植物；b)用化合物PBZ处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。
全文摘要
本发明本发明属基因工程技术领域，具体为一种受烯丙异噻唑化合物诱导的启动子及其应用。本发明包括一种分离和利用核酸的启动子片段,该启动子来源于拟南芥对PBZ及其相关化合物敏感的一个基因,AtNPR1。将编码所希望的目的产物基因的核酸序列和一个上述启动子片段融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受PBZ的化学诱导调控。
文档编号C12N15/63GK101979560SQ201010524220
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者余进, 梁宁菁, 蒯本科, 魏强 申请人:复旦大学