专利名称：一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可溶性蛋白，它是由人SIRP α的配体⑶47的胞外段，和氨基末端 融合的iTrxHis表达标签组成的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47，属于医 药技术领域。
背景技术：
CD47又叫整合素相关蛋白(integrin-associated protein, IAP)，最初从人胎盘 与整合素α νβ 3共纯化及从血小板与β 3整合素共免疫沉淀而为人们所认识，其功能与整 合素相关，因此称其为IAP[1]。CD47是一种广泛表达的抗原，存在于所有组织的不同细胞 上。它是一个50kD的膜糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。其胞外段即N端为 以IgV样结构域，之后为高度疏水的五次跨膜区，胞浆区即C端为3 36氨基酸长度的四 种不同的剪切体。CD47最初是作为整合素依赖的白细胞对细胞外基质蛋白反应的调节分子 来发挥作用的，但除此之外，CD47还有许多其他的重要功能。红细胞及机体其他正常细胞 上的⑶47与巨噬细胞上的SIRPa结合可调节巨噬细胞的靶向清除作用，从而组织巨噬细 胞对正常细胞的吞噬作用。⑶47与血小板上的αΙΛβ或α νβ 3，黑素瘤细胞和卵巢肿瘤 细胞上的α νβ 3平滑肌细胞和血小板上的α 2 β 1之间存在相对稳定的交互作用，促进血 小板活化、聚集，肿瘤细胞和平滑肌细胞的趋化与扩散。CD47同时也是细胞外基质蛋白血 小板反应素(thrombospondin，TSP)的受体，CD47与单克隆抗体及血小板反映素的结合可 诱导半胱天冬酶依赖的凋亡作用。CD47是T细胞活化的共刺激因子，活化凋亡过程，诱导T 细胞无反应性。CD47作为SIRP α的胞外配体，在巨噬细胞对肿瘤细胞的清除过程中发挥这 重要作用。信号调节蛋白α (SIRPa)是免疫球蛋白超家族成员，胞外区为三个免疫球蛋白 样结构域；胞浆区是酪氨酸磷酸化结合位点。⑶47通过与巨噬细胞上SIRP-a的相互作用， 使SIRPa上的ITIM基序磷酸化，募集包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶至胞膜，抑制细 胞表面肌球蛋白的聚集，从而抑制吞噬作用。包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶包括 SHP-I和SHP-2，均是非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，SHP-I主要表达在造血细胞上，逆向调节许 多细胞功能；SHP-2表达广泛，调节小GTP结合蛋白Ras，Rho的功能，正向调节细胞功能。 最早确定CD47在调节吞噬中的作用的证据是来源于CD47缺陷的小鼠的RBC移植入野生鼠 体内后被迅速清除，RBC表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRP-a结合，传递抑制信号，与巨 噬细胞表面受体与吞噬性配体结合产生的吞噬性信号相冲突，使红细胞不被吞噬。有研究表明，对于白血病来说，巨噬细胞的吞噬作用是肿瘤免疫监视的重要调节 因素，髓系，淋巴系白血病细胞及白血病干细胞上⑶47表达上调，可通过与SIRPa间的相互 作用，阻止白血病细胞被宿主的先天免疫系统清除。这也是白血病耐药、复发的重要原因之 一。通过单克隆抗体阻断⑶47/SIRPa间的作用，可以促进巨噬细胞对白血病细胞及白血 病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要的治疗意义。本发明基于⑶47在调节吞噬中的重要作用，表达了可溶性的⑶47的胞外段蛋白，与白血病细胞上⑶47竞争结合巨噬细胞上的SIRP α，从而促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞 噬作用
发明内容
本发明的目的是提供一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47，该蛋白可 以结合于巨噬细胞细胞表面，有效地增强巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用。本发明的技术方案是一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHi s-h⑶47，其特征 是它是由人⑶47蛋白胞外段和融合的TrxHis表达标签组成；其中h⑶47蛋白胞外段是 h⑶47第1-142位氨基酸。所述的h⑶47第1-142位氨基酸包含负责与SIRP α受体结合的IgV样结构域； 所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由 Νο2的核酸序列编码所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列编码所述氨基末端融合的TrxHis表达标签，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸 序列编码所述白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47是在大肠杆菌BL21中用低 温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯 的 TrxHis-hCD47 蛋白。本发明的特点是TrxHis-h⑶47在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用 于体内时可与巨噬细胞上的抑制性受体SIRP-α (signal regulatory protein alpha)结 合，阻止白血病细胞及白血病干细胞上的⑶47与SIRP-α结合，从而促进巨噬细胞对白血 病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要意义。
图l、hCD47胞外段蛋白的结构、构建和作用模式图2、目的基因(hCD47)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
图3、表达载体pET3^i-hCD47的结构示意图4、表达载体pET3h-hCD47的酶切鉴定图5、TrxHis-hCD47融合蛋白表达的蛋白电泳图6、TrxHis-hCD47融合蛋白的纯化的电泳图；Western blot定性检测
图7、TrxHis-hCD47融合蛋白的活性检测图8、荧光显微镜下计数吞入Jurkat细胞的巨噬细胞数。
具体实施例方式以下通过附图结合实施例对本发明做详尽的说明。1、构建表达载体。图1是融合蛋白的结构、构建和作用模式图。根据h⑶47的序 列设计引物 Pl :5，-GATATCATGTGGCCCCTGGTAGCGG-3‘ ；P2 :5，-GGATCCATTTTCATTTGGAGAAAACC-3’。以人淋巴结cDNA为模板，聚合酶链反应扩增编码hCD47胞外段氨基酸的多核苷酸序 列(图2)，1. 5%琼脂糖电泳回收后与pMDIS-T载体16°C连接2小时，热休克转化大肠杆菌 XL10，扩增后将目的片段亚克隆至表达载体pET3h(+)，构建pET3h-hCD47(图3)，限制性 酶切(图4)、测序鉴定。图l、h⑶47胞外段蛋白的结构、构建和作用模式图。图2、目的基因(h⑶47)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，1道(M)是分子量标 志(DL2000)，箭头所指为扩增片段。图3、表达载体pET3h_hCD47的结构示意图。图4为表达载体pET3h_h⑶47的酶切鉴定图；(质粒分别用限制性内切酶 EcoRV+BamHI双酶切和EcoRI单酶切，琼脂糖凝胶电泳观察结果。M道是marker DL2000, 1-4道分别是不同克隆的酶切结果)2、诱导表达融合蛋白。将表达载体pET3h(+)、pET3h-hCD47分别以热休克法转 化大肠杆菌BL21，涂布含100μ g/ml氨苄青霉素LB平板，37°C培养12小时后挑取单克隆 接种到含100 μ g/ml氨苄青霉素LB液体培养基，200rpm，37°C培养12h，以转接到新鲜 LB (+)培养基中，200rpm，37°C培养汕后，加入终浓度1. OmM的IPTG，200rpm, 25°C培养Mh。3、获得TrxHis_hCD47的包涵体蛋白。离心收集细菌，200 μ 1/ml培养基PBS重悬 细菌，超声裂菌，加入iTrit0n-XlOO,混勻，4°C静置30分钟，4°C离心收集上清和沉淀， SDS-PAGE检测发现，TrxHis-h⑶47蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中(图5)。图5为TrxHi s_hCD47融合蛋白表达的蛋白电泳图。将质粒pET3h (+)、 pET32a-hCD47分别转化大肠杆菌BL21，小体积培养后IPTG诱导融合蛋白的表达，然后取全 细菌裂解物、裂解上清(可溶性组分)和裂解沉淀(即包涵体)分别进行SDS-PAGE分析。 M 是分子量标志(由上到下分别是 170KD，130KD, 100KD, 70KD, 55KD, 40KD, 35KD, 25KD, 15KD, 10KD)4、纯化包涵体蛋白。pET32a(+)空载体蛋白TrxHis从细菌裂解上清中纯化， TrxHis-hCD47以镍离子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)纯化包涵体蛋白，所有纯化步骤 以ftOBondTM纯化手册操作。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，然后用抗His标签抗体进行 Western blot，见在TrxHis_hCD47可检测到大小正确的蛋白条带(图6)。图6为TrxHis_hCD47融合蛋白的纯化及Wfestern blot检测。从转化有质粒 pET3h-h⑶47的转化大肠杆菌BL21的复性上清用镍金属螯合柱纯化含有His标签的蛋白， 进行SDS-PAGE分析。M道是蛋白分子量标志。下图是融合蛋白Western blot检测结果，一 抗是抗Hi s标签抗体。5、蛋白活性测定将小鼠巨噬细胞系7以2 X IO5/孔的密度接种于12孔 板中，贴壁过夜。之后将Dio标记的人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞以2X IO4/孔 的密度添加到预先接种有巨噬细胞的十二孔板中，同时添加CD47胞外段蛋白(6 μ g/ml)， Trx蛋白(6 μ g/ml)作为对照。处理组和对照组分别设三个复孔。蛋白作用2小时后荧光 显微镜下计数吞噬有Jurkat细胞的巨噬细胞数，分别计数十个视野，并对结果进行统计学 分析。(图7、图8)图7为荧光显微镜下观察对照组与处理组巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬情况，箭 头所指为吞噬了 Jurkat细胞的巨噬细胞。
图8为荧光显微镜下计数吞入Jurkat细胞的巨噬细胞数，分别计数十个视野，之 后对数据进行统计学分析的结果，两样本t检验，P < 0. 05，有统计学意义。由以上可制得本发明这种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47，它是由人 ⑶47蛋白胞外段和融合的TrxHis表达标签组成；其中h⑶47蛋白胞外段是h⑶47第1-142
位氨基酸。所述的h⑶47第1-142位氨基酸包含负责与SIRP α受体结合的IgV样结构域；所 述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并 由No2的核酸序列编码所述的白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47具有No3的氨基酸序列， 并由No4的核酸序列编码所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序 列编码所述白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47是在大肠杆菌BL21中用低 温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯 的 TrxHis-hCD47 蛋白。本发明的一种白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47在体外 可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可与巨噬细胞上的抑制性受体 SIRP-α (signalregulatory protein alpha)结合，阻止白血病细胞及白血病干细胞上的 ⑶47与SIRP-α结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于 白血病的治疗有着重要意义。
权利要求
1.一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白 χΗ4-Μ047，其特征是它是由人CD47胞外 段和融合的fTrxHis表达标签组成；其中⑶47胞外段是指⑶47第1 142位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白fTrxHis-hCD47，其特 征是所述的hCD47第1 142位氨基酸包含与SIRP α结合的IgV样结构域及上游序列； 所述的融合的fTrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端，其中，氨基酸序列是Nol，并由 No2的核酸序列编码Nol TrxHi s-hCD47的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygi rgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadimwplvaalllgsaccgsaqlIfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspne ngsefelrrgacgrtrappppplrsgcNo2 TrxHis-hCD47 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcaggg caaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactc tgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacg ctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggt atgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccat ggctgatatcatgtggcccctggtagcggcgctgttgctgggctcggcgtgctgcggatcagctcagctactatttaa 3.3.3.3. C 3.3.3.atctgtagaattcacgttttgtaatgacactgtcgtcattccatgctttgttactaatatggaggcacaaaac actactgaagtatacgtaaagtggaaatttaaaggaagagatatttacacctttgatggagctctaaacaagtccactgtccccac tgactttagtagtgcaaaaattgaagtctcacaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggataagagtgatgctgtct cacacacaggaaactacacttgtgaagtaacagaattaaccagagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgt ttcatggttttctccaaatgaaaatggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccac caccact
3.根据权利要求1所述的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征 是所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47具有No3的氨基酸序列，并由No4 的核酸序列编码No3 :h⑶47胞外段的氨基酸序列mwplvaalllgsaccgsaqlIfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgaln kstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnen No4 :h⑶47胞外段的核酸序列atgtggcccctggtagcggcgctgttgctgggctcggcgtgctgcggatcagctcagctactatttaataaaa caaaatctgtagaattcacgttttgtaatgacactgtcgtcattccatgctttgttactaatatggaggcacaaaacactac tgaagtatacgtaaagtggaaatttaaaggaagagatatttacacctttgatggagctctaaacaagtccactgtccccactgac tttagtagtgcaaaaattgaagtctcacaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggataagagtgatgctgtctcaca cacaggaaactacacttgtgaagtaacagaattaaccagagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgtttea tggttttctcc3.3.3. 3.3.3. ο
4.根据权利要求2所述的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白 χΗ4-Μ047，其特征 是所述氨基末端融合fTrxHis表达标签，包含Νο5的氨基酸序列，并由Νο6的核酸序列编 码Νο5 TrxHi s的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygir giptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmds pdlgtddddkamadi No6 TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcaggg caaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactc tgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacg ctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccat ggctgatatc 。
5.根据权利要求1所述的一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其 特征是所述白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47是在大肠杆菌BL21中用低温 诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的 TrxHis-hCD47 蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，它是由人CD47蛋白胞外段即第1~142位氨基酸和TrxHis表达标签组成，表达载体是pET32a。转化大肠杆菌BL21后采取25℃低温诱导24h实现与TrxHis可溶性融合表达，用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hCD47蛋白。TrxHis-hCD47在体外可通过基因工程进行大量合成，应用于体内时可与巨噬细胞上的抑制性受体SIRP-α(signal regulatory protein alpha)结合，阻止白血病干细胞上的CD47与SIRP-α结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要意义。
文档编号C12N15/62GK102070719SQ201010557999
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者严学倩, 梁英民, 韩骅 申请人:中国人民解放军第四军医大学