专利名称：分离四聚体尿酸氧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种从尿酸氧化酶溶液中分离四聚体尿酸氧化酶的方法，以及由该方法获得的分离四聚体尿酸氧化酶。本发明涉及用化学方法修饰蛋白，以延长蛋白的循环生命期并降低其免疫原性。 更具体而言，本发明涉及将聚乙二醇或聚环氧乙烷缀合到尿酸氧化酶上，这样的缀合基本上消除了尿酸氧化酶的免疫原性，而尿酸氧化酶分解尿酸的活性并不受影响。
背景技术：
背景部分的陈述并不是对现有技术的全盘接受，相反，它反映了发明人员对进行此项发明时的技术情况的主观评价和解释。这些解释可能包括发明人员自己的、迄今为止尚未透露的对现有技术的洞悉。而这些洞悉本身并不是现有技术的一部分。尿酸氧化酶(尿酸酶；E. C. 1. 7. 3. 3)是一类酶，这类酶催化尿酸氧化，氧化产物是更易于溶解的尿囊素。尿囊素属嘌呤类代谢物，更易于排泄。因为在高等灵长类动物进化过程中，使尿酸氧化酶具有活性的基因已发生数次突变，所以人类自身并不产生具有酶活性的尿酸酶。mi，X等(1992)J Mol Evol 34:78-84。其结果是，在那些易受影响的人的体内，血液(血尿酸过多症)及尿液(hyperuricosuria)中过高的尿酸浓度可能会导致关节疼痛(痛风)、损伤性尿酸沉淀(结节瘤)和肾衰的发生。对于有些易受影响个人，现可买到的药物，如别嘌呤醇(尿酸合成抑制剂)，会产生治疗允许范围内的副作用或不能充分缓解病情。Hande, KR 等(1984) Am J Med76 :47-56 ；Fam, AG(1990)Bailliere，s Clin Rheumatol 4:177-192。注射尿酸氧化酶可以降低血液及尿液中的尿酸浓度，至少是暂时性降低。但是，由于对于人体来说尿酸氧化酶属外源蛋白，因此，即使是第一次注射来源于黄曲霉(Aspergillus flavus)的未经修饰的尿酸氧化酶，也有百分之几接受治疗的病人发生过敏反应(Pui，C-H等(1997) Leukemia 11 :1813-1816)，免疫反应制约了尿酸氧化酶在长期治疗和间断性治疗方面的应用。Donadio，D等(1981)Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic，M 等(1983)Rev Rhum Mal Osteoartic 50 :553_554。现在可行的、治疗高尿酸血的亚优选方法已被接受好几十年了。Kissel，P等 (1968)Nature 217:72-74。类似地，一些患有严重痛风病的病人可以获得安全有效的注射尿酸氧化酶的可能性早已既成事实数年了。Davis，FF等(1978) in GB Broun等，(Eds.)Enzyme Engineering,Vol 4(pp. 169-173)New York,Plenum Press ；Nishimura,H等(1979) Enzyme 24 :261-264 ；Nishimura，H 等(1981)Enzyme 26 :49-53 ；Davis,S 等(1981)Lancet 2(8241) :281-283 ;Abuchowski，A 等(1981)J Pharmacol Exp Ther 219 :352-354 ；Chen, RH-L等(1981)Biochim Biophys Acta 660 :293-298 ；Chua，CC等(1988)Ann Int Med 109 114-117 ;Greenberg，ML 等(1989)Anal Biochem 176:290-293。来源于动物器官的尿酸氧化酶在安全注射量的溶剂中几乎是不可溶的。美国专利3，616，231。特定的来源于植物或微生物的尿酸氧化酶在医学上可接受的溶剂中易溶些。但是，注射来源于微生物的尿酸氧化酶会很快引发免疫反应，从而可能导致威胁生命的过敏反应的发生，或者导致循环中的尿酸氧化酶失活和/或尿酸氧化酶从体内清除的速度加快。Donadio，D等(1981) ；Leaustic, M等(198 。根据源于哺乳动物，包括猪和狒狒，或源于昆虫，如黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)或假暗腹果蠅(Drosophila pseudoobscura) (ffallrath, LL 等，(1990)Mol Cell Biol 10 :5114-5127)的尿酸氧化酶的氨基酸序列而制备的酶，由于免疫原性和在生理PH条件下的不可溶等问题，至今还不能用于临床。用聚乙二醇或聚环氧乙烷(都以PEG来表示)对蛋白进行共价修饰，这种方法已被用来延长蛋白的半寿期和降低蛋白的免疫原性。美国专禾IJ 4，179，337,4, 766，106和 4，847，325 ;Saifer，MGP等(1994)Adv Exp Med Biol 366 :377_387。高分子量的PEG与蛋白缀合后生成的缀合物，循环生命期延长和/或免疫原性下降，并且仍保持着蛋白的功能。这一结论已在另一种酶，超氧化物歧化酶(Somack，R等(1991)Free Rad Res Commun 12-13 553-562;美国专利5，283，317和5，468，478)以及其他类型的蛋白，如细胞因子(Saifer, MGP 等(1997)Polym Preprints 38 :576-577 ；Sherman, MR 等(1997) in JM Harris 等 (Eds.) Poly (ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 155-169) Washington, DC =American Chemical Society)中得到证实。除 PEG以外的多聚体与尿酸氧化酶的缀合物在美国专利4，460，683也有陈述。在几乎所有报导过的将尿酸氧化酶PEG化(如将PEG共价偶联到尿酸氧化酶上)的尝试中，PEG总是最先与氨基缀合，包括氨基末端残基和可用的赖氨酸残基。常用的尿酸氧化酶，四个单独的亚基中每个亚基的赖氨酸的总数为25-29(黄曲霉(美国专利 5，382，518))(猪，Wu，X 等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416))。在天然尿酸氧化酶的结构中，有些赖氨酸残基不参与PEG化。降低尿酸氧化酶免疫原性的最常用的方法是大量缀合由低分子量PEG组成的PEG链。但是，由这种方法得到的缀合物，其酶活性也总是大大下降。先前的研究人员曾在离体条件下注射尿酸氧化酶以催化尿酸转化成尿囊素(见 Pui等(1997))。这为法国和意大利应用来源于真菌黄曲霉的尿酸氧化酶⑴ricozyme ) 防治或暂时缓解由细胞毒素治疗坏血病而引起的高尿酸血，以及暂时降低痛风病人血液中严重超量的尿酸提供了理论基础。Potaux，L等(1975)Nouv Presse Med 4:1109-1112; Legoux，R 等(1992)J Biol Chem 267 :8565-8570 ；美国专利 s 5，382，518 和 5，541，098。 由于toicozyme 的循环生命期很短，所以需要每天注射。更进一步，由于toicozyme 具有免疫原性，所以它并不适用于长期治疗。将来源于单假丝酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶与分子量为5KD的PEG缀合，制备物单次静脉注射到五名实验者身上，这五名实验者在注射前血清中尿酸的平均浓度为6. ang/dL，属正常水平。注射后，实验者血清中的尿酸浓度降低到了检测不出的水平。 Davis等(1981)。四星期后再次注射。文章中没有报导他们的反应。第二次(也是最后一次)注射后，用灵敏度相对不高的凝胶扩散分析方法没有检测到尿酸氧化酶的抗体。该文献没有报导接受长期治疗或次长期治疗的病人或实验动物的结果。将来源于球节细菌(Arthrobacter protoformiae)的尿酸氧化酶与分子量为5KD 的PEG缀合，制备物用来暂时性控制一名淋巴瘤患者血液中的尿酸高浓度，该患者在注射前血清中的尿酸浓度为15mg/mL。Chua等(1988)。由于病人病情的危急以及治疗期之短 (14天注射四次)，不可能评估缀合物治疗的长期效果或安全性。在本申请中，术语“免疫原性”指的是由注射经PEG修饰的或未经修饰的尿酸氧化酶(抗原)制备物而引起的免疫反应。“抗原性”指的是抗原与已存在抗体的反应。抗原性和免疫反应统称为“免疫反应性”。在先前有关PEG-尿酸氧化酶的研究中，评价免疫反应性的方法有很多种，包括1)离体条件下，PEG-尿酸氧化酶与预先存在的抗体的反应；2)检测经诱导而产生的抗体的合成；幻重复注射后加快了的清除速率。通过用不同的连接物缀合不同数量的PEG链到尿酸氧化酶上，以消除不同来源尿酸氧化酶的免疫原性的尝试已取得了一定的成功。第一次将PEG-尿酸氧化酶公诸于众的是FF Davis和Y Inada以及他们的同事们。Davis等(1978)；美国专利4，179，337 ； Nishimura等(1979)；日本专利55-99189和62-55079。美国专利4，179，337中所述的缀合物是这样合成的将Imol非特异来源的尿酸氧化酶与2000倍过量摩尔量的分子量为750D 的PEG反应，这意味着个尿酸氧化酶亚基都可能缀合大量的多聚分子。美国专利4，179，337 揭示了各种多肽类激素和酶，包括氧化还原酶(其中尿酸氧化酶是三个例子中的一个)缀合分子量为500D-20，000D，优选分子量为500D-5，OOOD的PEG或聚丙二醇后，可以产生有活性的、水溶性的，没有免疫原性的缀合物。另外，美国专利4，179，337还强调每个酶分子缀合10-100个多聚链而使得至少40%的酶活性得以保留。专利文献中没有关于尿酸氧化酶中可用的氨基末端PEG缀合的程度、缀合产物水解尿酸的活性或缀合物免疫反应性的检测结果。与PEG化尿酸氧化酶有关的十三个引证中的数据都列在表1中。这些结果中有一些也以图的形式出现在
图1A-2B中。这些引证中，有七篇文章都写明将不同数量的PEG链与来源于单假丝酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶偶联后，离体检测的缀合物水解尿酸的活性都有很大程度的降低。将大量的分子量为5KD的PEG与猪肝脏尿酸氧化酶偶联也得到了类似的结果，这在Chen发表的文章和他们的讨论报告上都有记载。参见Chen等(1981)； Davis 等(1978)。在表1总结的研究中，有七项研究报导PEG化的尿酸氧化酶的免疫反应性降低， 五项报导免疫反应性消除。后五项研究中有三项，免疫反应性消除的同时也伴随着水解尿酸活性显著降低——至多达到最初活性的15%、观％或45%。参见Nishimura等(1979) (15%活性)；Chen 等(1981)( %活性)；Nishimura 等(1981) (45%活性)。第四项研究报导PEG与61 %的可用赖氨酸残基缀合，但没有关于剩余酶活性的陈述。参见Abuchowski 等(1981)。然而，一支包括这同样两名科学家的研究小组，用同样的方法，在另一刊物上报导以这种程度缀合，剩余的活性只能达到23_观％。参见Chen等(1981)。从Abuchowski 等和Chen等在1981年发表的文章可以看出，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫原性，PEG必须与将近60%的可用赖氨酸残基缀合(表1)。在报导尿酸氧化酶的活性已被消除的第五项研究中，PEG缀合的程度、剩余的水解尿酸的活性或PEG-蛋白连接的本质都没有说明。 参见 Veronese，FM 等(1997) in JM Harris 等(Eds.), Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications.ACS Symposium Series 680(pp. 182-192)Washington,DC American Chemical Society。研究表明，尿酸氧化酶中缀合PEG的赖氨酸残基低于60%时，在实验动物体内，缀合物的免疫反应性降低但并没有消除。参见Tsuji，J等(1985Πη J Immunopharmacol 7 :725-730(28-45 % 的氨基被缀合)；Yasuda, Y 等(1990)Chem Pharm Bull 38 2053-2056 (38%的氨基被缀合)。相应化合物的剩余水解尿酸的活性范围从小于33% (Tsuji，J等)到60% (Yasuda，Y等)不等，此值相对于它们的最初活性值而言。Tsuji，J 等合成PEG-尿酸氧化酶用的PEG除5KD的外，还有7. 5KD和10KD的PEG。所有的连接产物都有一定程度的免疫原性和抗原性，同时酶活大大降低(表1 ；图1A-1B)。将来源于单假丝酵母的尿酸氧化酶PEG化后的制备物，给五人每人安全施药两次。这种制备物据报导只保留了其最初活性的11%。Davis等(1981)。几年后，经PEG修饰的来源于球节细菌的尿酸氧化酶被四次用于同一病人，该病人患有严重的淋巴瘤和高尿酸血。参见Chua等(1988)。Chua等没有检测酶制备物剩余的活性，但是他们用酶连免疫吸附测定法(ELISA)证实了在第一次注射PEG化尿酸酶后的沈天，病人血清中的抗-尿酸氧化酶抗体不见了。如在表1中所总结的，先前的关于PEG化尿酸酶的研究表明，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫反应性，需要缀合足量的PEG链，但这又会大大降低其水解尿酸的活性。更进一步，最先合成PEG-尿酸氧化酶是用氰尿酰氯，一种三嗪衍生物(2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪) 来活化PEG的。已证实在兔子体内，氰尿酰氯会引起新的抗原因子的产生，并会诱导新的抗体的形成。参见Tsuji，J等(1985)。表1先前研究中PEG-尿酸氧化酶的特征
权利要求
1.一种缀合物，包含与聚乙二醇缀合的尿酸氧化酶，其中聚乙二醇的平均分子量为 10000-100000道尔顿，并且其中该缀合物相对于未缀合的尿酸氧化酶仍保留至少约75% 的裂解尿酸的活性，而且该尿酸氧化酶的免疫原性显著降低。
2.权利要求1的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约20000道尔顿。
3.权利要求1的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约10000道尔顿。
4.权利要求1的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约30000道尔顿。
5.权利要求1的缀合物，其中尿酸氧化酶是四聚体。
6.权利要求1的缀合物，其中所述尿酸氧化酶缀合物由含不超过约10%非四聚体凝聚的尿酸氧化酶的尿酸氧化酶制备。
7.权利要求1的缀合物，其中缀合物含有少于约10%的尿酸氧化酶凝聚物。
8.权利要求1的缀合物，其中聚乙二醇的分子量为约10KD-约100KD。
9.权利要求1的缀合物，其中每个尿酸氧化酶亚基上共价缀合的聚乙二醇链的数目为 2-10 个。
10.权利要求9的缀合物，其中聚乙二醇的分子量不超过约IOKD且小于约100KD。
11.权利要求1的缀合物，其中尿酸氧化酶是哺乳动物尿酸氧化酶。
12.权利要求1的缀合物，其中尿酸氧化酶是猪肝、牛肝或绵羊肝的尿酸氧化酶。
13.权利要求1的缀合物，其中尿酸氧化酶是重组的。
14.权利要求1的缀合物，其中尿酸氧化酶基本上含有猪肝、牛肝、绵羊肝或狒狒肝的尿酸氧化酶序列。
15.权利要求1的缀合物，其中尿酸氧化酶是嵌合体。
16.权利要求15的缀合物，其中嵌合尿酸氧化酶含有猪肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
17.一种用来降低体液或组织中尿酸水平的药物组合物，包括权利要求1的缀合物和药学上可接受的载体。
18.一种分离的重组的四聚体哺乳动物尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶基本为四聚体形式，其中少于10%的所述尿酸氧化酶为非四聚体聚合物形式，并且所述尿酸氧化酶是嵌合的。
19.权利要求18的分离的四聚体尿酸氧化酶，其中嵌合尿酸氧化酶含有猪肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
20.权利要求19的分离的四聚体尿酸氧化酶，其中所述嵌合的尿酸氧化酶是猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶。
21.一种分离的重组的四聚体哺乳动物尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶为重组猪尿酸氧化酶，其含有替代序列SEQ ID NO :1中四1位精氨酸残基的赖氨酸残基和替代序列SEQ ID NO :1中301位苏氨酸的丝氨酸。
22.—种分离的重组的四聚体哺乳动物尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶具有狒狒肝脏尿酸氧化酶的序列，其中序列SEQ ID NO 2中97位酪氨酸被组氨酸代替。
23.权利要求18的分离的四聚体尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或两端是平截形式的。
24.权利要求21的分离的四聚体尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或两端是平截形式的。
25.权利要求22的分离的四聚体尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或两端是平截形式的。
26.一种尿酸氧化酶的缀合物，该缀合物相对于未缀合的尿酸氧化酶保留了裂解尿酸的活性并具有延长的体内半寿期，所述缀合物包含与聚乙二醇缀合的纯化尿酸氧化酶，其中超过90%的尿酸氧化酶为四聚体形式。
27.权利要求沈的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约10000-约60000道尔顿。
28.权利要求27的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约10000道尔顿。
29.权利要求27的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约20000道尔顿。
30.权利要求27的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约30000道尔顿。
31.权利要求沈的缀合物，其中每个尿酸氧化酶亚基上共价偶联的聚乙二醇链的平均数目为2-10个。
32.权利要求沈的缀合物，其中尿酸氧化酶是哺乳动物尿酸氧化酶。
33.权利要求32的缀合物，其中尿酸氧化酶是猪肝、牛肝或绵羊肝的尿酸氧化酶。
34.权利要求沈的缀合物，其中尿酸氧化酶是重组的。
35.权利要求34的缀合物，其中尿酸氧化酶含有猪肝、牛肝、绵羊肝或狒狒肝的尿酸氧化酶序列。
36.权利要求34的缀合物，其中尿酸氧化酶是嵌合的。
37.权利要求36的缀合物，其中嵌合尿酸氧化酶含有猪肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
38.权利要求37的缀合物，其中所述嵌合尿酸氧化酶是猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶(PBC 尿酸氧化酶)。
39.权利要求37的缀合物，其中所述嵌合尿酸氧化酶为猪尿酸氧化酶(PKS酸氧化酶)，其中序列SEQ ID NO :1中291位精氨酸残基被赖氨酸残基替代(R291K)并且序列SEQ ID NO :1中301位苏氨酸被丝氨酸替代(T301S)。
40.权利要求34的缀合物，其中所述重组尿酸氧化酶具有狒狒肝脏尿酸氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，其中97位酪氨酸被组氨酸代替(Y97H)。
41.权利要求34的缀合物，其中所述重组尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或两端是平截形式的。
42.权利要求31的缀合物，其中每个尿酸氧化酶亚基上共价偶联的聚乙二醇链的平均数目为3-8个。
43.权利要求42的缀合物，其中每个尿酸氧化酶亚基上共价偶联的聚乙二醇链的平均数目为4-6个。
44.权利要求37的缀合物，其中PEG链通过选自氨酯键，仲胺键，和酰胺键共价偶联到尿酸氧化酶上。
45.权利要求沈的缀合物，其中所述聚乙二醇是线形的。
46.权利要求沈的缀合物，其中所述聚乙二醇是分支的。
47.权利要求沈的缀合物，其中超过95%的尿酸氧化酶为四聚体形式。
48.权利要求41的缀合物，其中所述尿酸氧化酶通过至少去除氨基端前6个氨基酸从而在氨基端是平截形式的。
49.一种用来降低体液或组织中尿酸水平的药物组合物，包括与聚乙二醇缀合的纯化尿酸氧化酶和一种药学上可接受的载体，其中超过90%的尿酸氧化酶为四聚体形式。
50.权利要求49的药物组合物，其中所述组合物经冷冻干燥而稳定化，并在重建时迅速溶解，以提供适用于不经肠胃的溶液。
全文摘要
一种从尿酸氧化酶溶液中分离四聚体尿酸氧化酶的方法，所述溶液包含四聚体尿酸氧化酶和尿酸氧化酶凝集物，包括步骤将所述溶液加到至少一个分离柱上，分离柱的pH介于约9-10.5；从所述柱子上收集一份或多份洗脱级分，级分含有分离的四聚体尿酸氧化酶，其中所述一份或多份的级分基本不含尿酸氧化酶凝集物。
文档编号C12N9/96GK102161984SQ201010565549
公开日2011年8月24日 申请日期1999年8月2日 优先权日1998年8月6日
发明者L·D·威廉斯, M·G·P·塞菲尔, M·R·舍尔曼, M·S·赫尔斯菲尔德, S·J·凯利 申请人:山景药品公司, 杜克大学