专利名称：：前体流加发酵生产l-色氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及L-色氨酸，尤其是涉及一种前体流加发酵生产L-色氨酸的方法。
背景技术：
：L-色氨酸(L-Trp)是一种含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，是人和动物生命活动中不可缺少的必需氨基酸之一。由于L-色氨酸及其代谢产物对机体的广泛作用，其在医药领域的用途一度成为医学界的研究热门，到目前为止，L-色氨酸作为治疗癞皮病、精神分裂症、营养药剂、人工膳食和必需氨基酸片的用途已经得到了广泛的承认(李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用[J]氨基酸和生物资源，2005，27(3):58-62)。L-色氨酸在食品工业的应用价值主要在于它被广泛地用作食品添加剂、调味剂和抗氧化防腐剂。近年来，由于在配合饲料中大量使用合成的蛋氨酸和赖氨酸，使得L-色氨酸成为饲料中主要的限制性氨基酸，是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加剂(张炳荣.氨基酸工业大全[M].北京轻工业出版社，1991)。早期的L-色氨酸的生产方法主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是由于这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂、产品成分复杂等缺点，因而在上世纪90年代逐渐被淘汰，随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上又可以分为酶法、微生物转化法和微生物发酵法(张克旭.氨基酸发酵工艺学[M].北京中国轻工业出版社.1992:712-722)。酶法和微生物转化法的高成本已困扰研究工作者多年，进展不大，难以实现大规模低成本生产L-色氨酸。而微生物发酵法具有产酸高、成本低、质量好等优势，将是未来大规模生产L-色氨酸的首选技术。目前，微生物发酵产L-色氨酸主要使用到的菌种为谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌°在谷氨酸棒杆菌方面，Katsumata等(KatsumataR,IkedaM.HyperproductiionoftryptophaninCorynebacteriumglutamicumbypathwayengineering.NatureBioechnology,1993，11921-925)将带有7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸(DAHP)合成酶和色氨酸合成酶的质粒引入产色氨酸的谷氨酸棒杆菌KY10894，发酵80h使得L-色氨酸的产量比原始菌株提高了54%，达到43g/L;Ikeda等(IkedaM，NakanishiK,KinoK,etal.FermentativeproductionoftryptophanbyastablerecombinantstrainofCorynebacteriumglutamicumwithamodifiedserine-biosyntheticpathway[J]BiosciBiotechnolBiochem，1994，58(4):674_678)又将丝氨酸代谢途径中的磷酸甘油酸脱氢酶的基因克隆岛表达aroG基因与色氨酸合成酶基因的质粒pWK99中，构建出重组质粒PWK9901，并将后者转入色氨酸生产菌KY10894，解决了发酵过程中丝氨酸供给量较少而积累副产物吲哚等问题，发酵80h后，产量达50g/L。Ikeda等(IkedaM,KatsumataR.HyperproductionoftryptophanbyCorynebacteriumglutamicumwiththemodifiedpentosephosphatepathway[J]Appliedandenvironmentalmicrobiology,1999,51(2)201-206)通过代谢途径分析，发现在产色氨酸的谷氨酸棒杆菌PIK9960中过表达tktA可增加磷酸戊糖途径中E4P的量，从而提高芳香族氨基酸生物合成产率，最终发酵80h色氨酸的产量可达到58g/L。在大肠杆菌方面，日本三乐公司从大肠杆菌K12中取出色氨酸操纵子，组合于载体质粒后，导入大肠杆菌3110，转化株经NTG诱变，得到质粒稳定的6-FT抗性株，再附加8-氮鸟嘌呤抗性，成功选育出L-色氨酸高产株，菌体以葡萄糖和邻氨基苯甲酸为原料进行发酵，培养120h后，产量可达40.3g/L；Berry(BerryA.ImprovingproductionofaromaticcompoundsinEscherichiacolibymetabolicengineering[J]TrendsBiotechnol，1996，14(7)250-256)克隆了编码DAHP合成酶的aroG基因以及整个色氨酸操纵子，并对aroG和trpE基因进一步改构，在大肠杆菌中进行高表达，发酵50h后，产量达45g/L;Park等(ParkYH,LimSJ,KimBH,etal.Ε.colimutantcontainingmutantgenesrelatedwithtryptophanbiosynthesisandproductionmethodoftryptophanbyusingthesame[P].U.S.2008:N0.0299644)通过诱变色氨酸合成途径中的多个基因，成功选育出L-色氨酸的高产株CJ285，发酵61h后，L-色氨酸产量达28.2g/L，糖酸转化率为11.6%。尽管在前人的研究基础上L-色氨酸的产量已有所提高，但还存在发酵周期长、糖酸转化率低等问题，若要满足工业化生产的需求，还需要进一步提高L-色氨酸的产量和糖酸转化率，缩短发酵时间，从而降低生产成本。
发明内容本发明的目的在于提供一种前体流加发酵生产L-色氨酸的方法。本发明的技术方案包括以下步骤1)菌种筛选取大肠杆菌基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325菌液(可购自美国菌种保藏中心)，用已灭过菌的pH为68的磷酸盐缓冲液稀释IO3IO6倍后涂布于LB平板，于3537°C培养1830h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，于3537°C再培养1830h，将得到的单菌落用pH为68的磷酸盐缓冲液振荡稀释，然后涂布于新的LB平板，于3537°C培养1830h后得到菌层，用LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到无菌保种管，按11比例加入40%的无菌甘油后于-20°C保存备用；2)一级摇瓶种子将步骤1)得到的菌液以0.的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于3537°C，以150250rpm培养1020h；3)二级发酵罐种子将步骤2)得到的一级摇瓶种子以10%的接种量接种于装有二级种子培养基的种子罐中，控制风量612L/min，转速300500rpm，温度35370C，罐压0.050.08MPa,pH值通过氨水控制在6.57.0，培养1020h；4)发酵培养将步骤3)得到的二级发酵罐种子以10%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，控制风量1530L/min，转速300700rpm，温度3537°C，罐压0.050.08MPa,pH值通过氨水控制在6.57.0；流加葡萄糖浓度为500600g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10%30%，同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200300g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.10.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.60.8g/L/h，发酵周期3040h，产物L-色氨酸产量4050g/L，邻氨基苯甲酸转化量68g/L，糖酸转化率20%22%。在步骤1)中，所述LB培养基的组成可为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂1520g/L,盐酸四环素10100mg/L,灭菌前pH值7.27.5。在步骤2)中，所述一级种子培养基的组成可为磷酸氢二钾1530g/L，酵母粉1020g/L，磷酸二氢钾618g/L，硫酸铵210g/L，七水硫酸镁15g/L，葡萄糖2040g/L，盐酸四环素10100mg/L，灭菌前pH值7.27.5。在步骤3)中，所述二级种子培养基的组成可为磷酸氢二钾28g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸镁15g/L，硫酸铵15g/L，柠檬酸三钠二水物15g/L，葡萄糖2050g/L。在步骤4)中，所述发酵培养基的组成可为磷酸氢二钾515g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸镁15g/L，硫酸铵15g/L，柠檬酸15g/L，硫酸亚铁50200mg/L，葡萄糖1030g/L。本发明通过大肠杆菌基因工程菌(Ε.coliK12W3110)ATCC27325发酵生产L-色氨酸，采用前体流加的发酵工艺，有效地提高了L-色氨酸的产量和糖酸转化率，能够在较短发酵周期内实现L-色氨酸的高产量积累，最终L-色氨酸产量可达4050g/L，糖酸转化率20%22%(接近理论转化值22.7%)，同时发酵周期短，生产成本低，生产工艺简单，可满足工业化生产L-色氨酸的要求，具有很大的应用前景。图1为实施例1中L-色氨酸基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325在发酵培养基中生产L-色氨酸的过程曲线。在图1中，横坐标为时间Cultivationtime(h)，左纵坐标为菌体OD值OD66tl(〇)和L-色氨酸产量L-Trp(g/L)(★)，第一右纵坐标为残糖量RG(g/L)()，第二右纵坐标为溶氧DO(%)(-)。图2为实施例2中L-色氨酸基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325在发酵培养基中流加前体生产L-色氨酸的过程曲线。在图2中，横坐标为时间Cultivationtime(h)，左纵坐标为菌体OD值OD66tl(〇)和L-色氨酸产量L-Trp(g/L)(★)，第一右纵坐标为残糖量RG(g/L)()，第二右纵坐标为溶氧DO(%)(-)。图3为实施例3中L-色氨酸基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325在发酵培养基中流加前体生产L-色氨酸的过程曲线。在图3中，横坐标为时间Cultivationtime(h)，左纵坐标为菌体OD值OD66tl(〇)和L-色氨酸产量L-Trp(g/L)(★)，第一右纵坐标为残糖量RG(g/L)()，第二右纵坐标为溶氧DO(%)(-)。具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。实施例11)菌种筛选打开冷冻甘油管，取15yL的大肠杆菌基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325菌液，用已灭过菌的pH为7的磷酸盐缓冲液稀释IO4倍；取200μL稀释液涂布于LB平板，于37°C培养20h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的单菌落，于37°C培养20h；将最终得到的单菌落用pH为7的磷酸盐缓冲液ImL振荡稀释，取200μL稀释液涂布于新的LB平板以便得到菌层，于37°C培养20h；最后用3mL的LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到空的无菌保种管，按11比例加入40%的无菌甘油；甘油管-20°C保存备用。LB平板培养基组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。2)一级摇瓶种子将步骤1)中的甘油管，以0.的接种量接种于装有75mL—级种子培养基的500mL摇瓶中，于37°C，以150rpm培养12h。一级摇瓶种子培养基组成为磷酸氢二钾20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸铵4g/L，七水硫酸镁3g/L，葡萄糖20g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。3)二级发酵罐种子将步骤2)的一级摇瓶种子，以1%的接种量接种于装有6L二级种子培养基的IOL种子罐中，培养过程中，风量控制在6L/min，转速控制在300rpm，温度控制在37°C，罐压保持在0.05MPa,pH值通过氨水控制在7.0,培养12h。二级发酵罐种子培养基组成为磷酸氢二钾4g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸三钠二水物4g/L，葡萄糖50g/L。4)发酵培养将步骤3)的二级发酵罐种子，以5%的接种量接种于装有15L发酵培养基的30L发酵罐中发酵，发酵过程中，风量控制在15L/min，转速控制在300600rpm，温度控制在37°C，罐压保持在0.05MPa,pH值通过氨水控制在7.0；流加葡萄糖浓度为500g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在1030%;发酵周期36h。发酵培养基组成为磷酸氢二钾5g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸镁4g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸lg/L，硫酸亚铁50mg/L，葡萄糖20g/L。采用液相色谱对产物进行测定，HPLC流动相按体积比，0.15%磷酸二氢钠甲醇=8515。色谱条件为色谱柱C180DS；柱温36°C；检测器DAD(HP1200)；检测波长:278nm；流速lmL/min；进样量20μL。由图1的发酵过程曲线可知，通过发酵罐培养36h，最终L-色氨酸的产量积累可达30g/L，而糖酸转化率为14%。实施例21)菌种筛选打开冷冻甘油管，取15μL的ATCC27325菌液，用已灭过菌的pH为7的磷酸盐缓冲液稀释IO4倍；取200μL稀释液涂布于LB平板，于37°C培养20h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的单菌落，于37°C培养20h；将最终得到的单菌落用PH为7的磷酸盐缓冲液ImL振荡稀释，取200μL稀释液涂布于新的LB平板以便得到菌层，于37°C培养20h；最后用3mL的LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到空的无菌保种管，按11比例加入40%的无菌甘油；甘油管-20°C保存备用。LB平板培养基组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。2)一级摇瓶种子将步骤1)中的甘油管，以0.的接种量接种于装有75mL—级种子培养基的500mL摇瓶中，于37°C，以150rpm培养12h。一级摇瓶种子培养基组成为磷酸氢二钾20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸铵4g/L，七水硫酸镁3g/L，葡萄糖20g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。3)二级发酵罐种子将步骤2)的一级摇瓶种子，以1%的接种量接种于装有6L二级种子培养基的10L种子罐中，培养过程中，风量控制在6L/min，转速控制在300rpm，温度控制在37°C，罐压保持在0.05MPa,pH值通过氨水控制在7.0,培养12h。二级发酵罐种子培养基组成为磷酸氢二钾4g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸三钠二水物4g/L，葡萄糖50g/L。4)发酵培养将步骤3)的二级发酵罐种子，以5%的接种量接种于装有15L发酵培养基的30L发酵罐中发酵，发酵过程中，风量控制在15L/min，转速控制在300600rpm，温度控制在37°C，罐压保持在0.05MPa,pH值通过氨水控制在7.0；流加葡萄糖浓度为500g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10%30%;同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.8g/L/h。发酵周期36h。发酵培养基组成为磷酸氢二钾5g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸镁4g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸lg/L，硫酸亚铁50mg/L，葡萄糖20g/L。液相色谱的测定条件同实施例1，由图2发酵过程曲线可知，通过发酵罐培养36h，最终L-色氨酸的产量积累可达40g/L，糖酸转化率为20%。而L-色氨酸产量和糖酸转化率相对于实施例1中没有流加前体的结果分别提高了33.3%和42.9%。实施例31)菌种筛选打开冷冻甘油管，取15μL的ATCC27325菌液，用已灭过菌的pH为7的磷酸盐缓冲液稀释IO4倍；取200μL稀释液涂布于LB平板，于37°C培养24h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的单菌落，于37°C培养24h；将最终得到的单菌落用PH为7的磷酸盐缓冲液ImL振荡稀释，取200μL稀释液涂布于新的LB平板以便得到菌层，于37°C培养24h；最后用3mL的LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到空的无菌保种管，按11比例加入40%的无菌甘油；甘油管-20°C保存备用。LB平板培养基组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。2)一级摇瓶种子将步骤1)中的甘油管，以0.的接种量接种于装有75mL—级种子培养基的500mL摇瓶中，于37°C，以150rpm培养15h。一级摇瓶种子培养基组成为磷酸氢二钾20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸铵4g/L，七水硫酸镁3g/L，葡萄糖20g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。3)二级发酵罐种子将步骤2)的一级摇瓶种子，以1%的接种量接种于装有6L二级种子培养基的IOL种子罐中，培养过程中，风量控制在8L/min，转速控制在400rpm，温度控制在37°C，罐压保持在0.05MPa,pH值通过氨水控制在7.0,培养12h。二级发酵罐种子培养基组成为磷酸氢二钾4g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸三钠二水物4g/L，葡萄糖50g/L。4)发酵培养将步骤3)的二级发酵罐种子，以10%的接种量接种于装有15L发酵培养基的30L发酵罐中发酵，发酵过程中，风量控制在20L/min，转速控制在400700rpm，温度控制在37°C，罐压保持在0.05MPa,pH值通过氨水控制在7.0；流加葡萄糖浓度为500g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10%30%;同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.8g/L/h。发酵周期36h。发酵培养基组成为磷酸氢二钾5g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸镁4g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸lg/L，硫酸亚铁50mg/L，葡萄糖20g/L。液相色谱的测定条件同实施例1，由图3发酵过程曲线可知，通过发酵罐培养36h，最终L-色氨酸的产量积累可达47g/L，糖酸转化率为22%。而L-色氨酸产量和糖酸转化率相对于实施例1中没有流加前体的结果分别提高了56.7%和57.1%。权利要求前体流加发酵生产L色氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤1)菌种筛选取大肠杆菌基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325菌液，用已灭过菌的pH为6～8的磷酸盐缓冲液稀释103～106倍后涂布于LB平板，于35～37℃培养18～30h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，于35～37℃再培养18～30h，将得到的单菌落用pH为6～8的磷酸盐缓冲液振荡稀释，然后涂布于新的LB平板，于35～37℃培养18～30h后得到菌层，用LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到无菌保种管，按1∶1比例加入40％的无菌甘油后于20℃保存备用；2)一级摇瓶种子将步骤1)得到的菌液以0.1％～1％的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于35～37℃，以150～250rpm培养10～20h；3)二级发酵罐种子将步骤2)得到的一级摇瓶种子以1％～10％的接种量接种于装有二级种子培养基的种子罐中，控制风量6～12L/min，转速300～500rpm，温度35～37℃，罐压0.05～0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5～7.0，培养10～20h；4)发酵培养将步骤3)得到的二级发酵罐种子以1％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，控制风量15～30L/min，转速300～700rpm，温度35～37℃，罐压0.05～0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5～7.0；流加葡萄糖浓度为500～600g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10％～30％，同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200～300g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.1～0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.6～0.8g/L/h，发酵周期30～40h，产物L色氨酸产量40～50g/L，邻氨基苯甲酸转化量6～8g/L，糖酸转化率20％～22％。2.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤1)中，所述LB培养基的组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂1520g/L，盐酸四环素10100mg/L，灭菌前pH值7.27.5。3.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤2)中，所述一级种子培养基的组成为磷酸氢二钾1530g/L，酵母粉1020g/L，磷酸二氢钾618g/L，硫酸铵210g/L，七水硫酸镁15g/L，葡萄糖2040g/L，盐酸四环素10100mg/L,灭菌前pH值7.27.5。4.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤3)中，所述发酵培养基的组成为磷酸氢二钾28g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸镁15g/L，硫酸铵15g/L，柠檬酸三钠二水物15g/L，葡萄糖2050g/L。5.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤4)中，所述发酵培养基的组成为磷酸氢二钾515g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸镁15g/L，硫酸铵15g/L，柠檬酸15g/L，硫酸亚铁50200mg/L，葡萄糖1030g/L。全文摘要前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，涉及L-色氨酸。先对ATCC27325进行筛选，制作成冷冻甘油管，然后接种于一级摇瓶种子培养基培养成一级种子，再接种于种子罐中培养成二级种子，最后接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵采用在菌体进入对数期时开始流加浓度为200～300g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.1～0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.6～0.8g/L/h。采用发酵法生产的L-色氨酸的产量可达40～50g/L，糖酸转化率20％～22％，且发酵周期短，生产工艺简单，生产成本低，可满足工业化生产L-色氨酸的要求，具有很大的应用前景。文档编号C12P13/22GK101985638SQ201010579428公开日2011年3月16日申请日期2010年12月1日优先权日2010年12月1日发明者凌雪萍,卢英华,姚传义,敬科举,谢友坪申请人:厦门大学