专利名称：一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法
技术领域：
本研究采用Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)测定伪狂犬病活疫苗TCID5tl (半数组织 培养物感染量)的方法，与CEP (单层鸡胚成纤维细胞)测定伪狂犬病活疫苗TCID5tl的方法 相比省时、省力。
背景技术：
伪狂犬病活疫苗效力检验方法是使用鸡胚成纤维细胞进行效力检验，但是使用 SPF鸡胚制备成纤维细胞时，需要将鸡胚孵化至9-10日龄，时间较长，此外制备过程中批 次间差异大，接毒培养数日后，由于对照细胞部分脱落，观察病变时往往受到空白对照的影 响，尤其是倍比稀释度高的接种瓶的细胞病变与空白对照瓶中老化脱落细胞难以判断，影 响了最终判定结果。文献检索披露中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘景利等人进行了伪狂犬强毒 S株TCID5tl与LD5tl毒价对比试验研究方法取伪狂犬强毒S株45代以Hank’ s液10倍递增 稀释至10_8倍，分两组；一组以10_5 10_8等4个稀释度接种已培养好的鸡胚成纤维单层 细胞(20m培养瓶)，每个滴度接种4个小瓶，每瓶接种0. Iml,然后每小瓶加维持液4ml，设 4瓶细胞为对照组；37°C培养，接毒24h后观察产生病变情况，观察96h结束。另一组以同 样稀释度范围(10_5 10_8)接种兔，每个稀释度接种兔，每只兔腿部肌肉接种1ml，每日观 察兔发病死亡情况，观察7天结束；根据初步实验结果得出，S株45代毒的毒价在兔体上与 在鸡胚成纤维细胞上基本一致；结论伪狂犬强毒毒价可用TCID5tl与LD5tl两种方法测定，但 由于在测定LD5tl过程中，需接种实验动物，一方面过程相对比较繁琐，另一方面实验动物的 个体差异及饲养条件等因素均可能会对结果有所影响；而在测定TCID5tl过程中，由于使用 10日龄SPF鸡胚培养的鸡胚成纤维单层细胞的稳定性较好，且试验全过程均在实验室中进 行，试验较容易进行，结果受外界因素影响较小。本研究与上述的相关文献对比分析，两者 伪狂犬病毒疫苗效力的检验方法截然不同。本发明构思是将疫苗接种在VERO细胞、PK-15细胞和CEF三种细胞上，测定的毒 价，其结果表明，采用VERO细胞代替鸡胚成纤维细胞测定伪狂犬病活疫苗的效价是可行 的，准确的，有应用价值的。
发明内容
本发明的目的在于提供的伪狂犬病活疫苗效力检验方法，替代了单层鸡胚成纤 维细胞测定伪狂犬病活疫苗的方法，使效力检验更准确、便于操作。本发明是这样实现的一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法，采用Vero细胞 测定伪狂犬病毒活疫苗TCID5tl的方法，分步如下；
其中Vero细胞的制备
抽取密度为2. OX IO6的Vero冻存细胞1. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解4_5分钟， 在2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入l_3ml细胞培养液，转入培养瓶中，置
3于37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化细胞，再 用细胞营养液稀释成2. OX IO6的Vero细胞悬液，铺到细胞板上，置于37°C、5%的CO2培养 箱中培养，培养24小时成致密单层备用； 其中伪狂犬病活疫苗的接种
抽取1头份伪狂犬病活疫苗，用细胞维持液作10倍的梯度稀释，取10_3-10_7的滴度样， 分别加入上述的致密单层中，每孔lOOul，同时设对照每孔加细胞维持液lOOul，放入37°C、 5%的CO2培养箱中培养，观察3-5天细胞病变，计算TCID5Q/0. Iml效价，每头份病毒含量应 不低于 5X103 °TCID5。。所述的检验方法，所用细胞培养液由5gMEM干粉培养基，90ml注射用水，胎牛血清 IOml配制而成。所述的检验方法，所用细胞维持液由5gMEM干粉培养基，98ml注射用水，胎牛血清 2ml配制而成。所述的检验方法，使用Vero细胞进行伪狂犬病活疫苗效力检验的周期为8天，比 CEP细胞检验缩短7天。本方法选取3个生产批次的伪狂犬病活疫苗同时接种已经制备好的Vero细胞与 鸡胚成纤维细胞(CEP)中，进行TCID5tl测定的对比实验，测定的结果通过T检验三者的差异 性，鸡胚成纤维细胞和Vero细胞的T值为T1=O. 08，鸡胚成纤维细胞和PK-15细胞的T值为 T2=O. 11值。计算得T1和T2所对应WP1, P2值均> 0.05，则说明两组数据差异均不显著， 由于T1 < T2，鸡胚成纤维细胞和Vero细胞的差异呈极不显著，这说明用鸡胚成纤维细胞和 Vero细胞测定伪狂犬弱毒的TCID5tl结果是相同的，与国家规定标准相符。本发明采用Vero细胞测定伪狂犬病毒致病变作用比对CEP细胞的致病变作用快， 病变特点明显，并不再需要孵化SPF鸡胚和制作CEP细胞；同时该方法简化了程序，缩短时 间，降低了污染几率，彰显技术进步。
具体实施例方式下面将结合实施例对发明作进一步说明。检测流程复苏、培养Vero细胞步骤；疫苗稀释、接种、计算TCID5tl步骤；
(1)Vero细胞的制备
抽取密度为2. OX IO6的Vero细胞1. 5ml，置于37°C水浴中，快速晃动溶解5分钟，在 2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入3ml细胞培养液，将细胞轻吹散，转入培养 瓶中，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化 液消化细胞，再用细胞营养液稀释成2. OX IO6的Vero细胞悬液，铺到96孔细胞板上，置于 37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时后成致密单层备用；
(2)伪狂犬病活疫苗的接种
抽取1头份伪狂犬病毒活疫苗，用2%FBS细胞维持液作10倍的梯度稀释，取10_3、 10_4、10-5、10_6、10-7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每个滴度加4孔，每孔IOOul, 同时设正常细胞对照孔4孔，每孔加细胞维持液，放入37°C、5%的CO2培养箱中培养，观 察4天细胞病变，采用Reed-Muench法计算TCID5(1/0. Iml效价，每头份病毒含量应不低于5X103°TCID5。。上述细胞培养液由5gMEM干粉培养基，90ml注射用水，胎牛血清IOml配制而成。上述细胞维持液由5gMEM干粉培养基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成 选用的Vero细胞购自中国兽医药品监察所；MEM培养基为Hyclone公司生产，货号
SH30024. OlB ；胎牛血清为Hyclone公司生产，货号SV30087. 02 ；EDTA-胰酶消化液为兰州 百灵公司生产。试验结果见下表1。(1)三种细胞接种伪狂犬病毒后的病变结果见表1。表1. CEP、Vero细胞和PK-15细胞接种伪狂犬病毒后病变统计
权利要求
1.一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法，其特征在于采用Ver0细胞测定伪狂犬 病毒活疫苗TCID5tl的方法，分步如下；其中Vero细胞的制备抽取密度为2. OX IO6的Vero冻存细胞1. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解4_5分钟， 在2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入l_3ml细胞培养液，转入培养瓶中，置 于37°C、5%的(X)2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化细胞，再 用细胞营养液稀释成2. OX IO6的Vero细胞悬液，铺到细胞板上，置于37°C、5%的(X)2培养 箱中培养，培养M小时成致密单层备用；其中伪狂犬病活疫苗的接种抽取1头份伪狂犬病活疫苗，用细胞维持液作10倍的梯度稀释，取10_3-10_7的滴度样， 分别加入上述的致密单层中，每孔lOOul，同时设对照每孔加细胞维持液lOOul，放入37°C、 5%的(X)2培养箱中培养，观察3-5天细胞病变，计算TCID5Q/0. Iml效价，每头份病毒含量应 不低于 5X103 °TCID5。。
2.按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于所用细胞培养液由5gMEM干粉培养 基，90ml注射用水，胎牛血清IOml配制而成。
3.按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于所用细胞维持液由5gMEM干粉培养 基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成。
4.按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于使用Vero细胞进行伪狂犬病活疫苗 效力检验的周期为8天，比CEP细胞检验缩短7天。
5.按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于选用的Vero细胞购自中国兽医药品 监察所；MEM培养基为Hyclone公司生产，货号SH30024. OlB ；胎牛血清为Hyclone公司生 产，货号SV30087. 02 ；EDTA-胰酶消化液为兰州百灵公司生产。
全文摘要
本发明的一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法，其中Vero细胞的制备抽取密度为2.0×106的Vero细胞1.5ml，置于37℃水浴中，快速晃动溶解4-5分钟，在2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入1-3ml细胞培养液，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化液消化细胞后再用细胞营养液稀释成2.0×106的Vero细胞悬液，铺到细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时后长成致密单层备用；抽取1头份伪狂犬病毒活疫苗，用细胞维持液作10倍的梯度稀释，取样分别加入上述的致密单层的96孔细胞板中，每孔加细胞维持液，放入37℃、5％的CO2培养箱中培养，观察3-5天细胞病变，采用Reed-Muench法计算TCID50/0.1ml效价，每头份病毒含量应不低于5×103.0TCID50。
文档编号C12Q1/02GK102094064SQ20101058832
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刘淑梅, 李延涛, 杜久斌, 贺笋, 赵海源, 赵钦, 黄炯 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司