专利名称：利用MutS蛋白在基因组范围内检测单核苷酸多态性或小的插入和缺失的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种识别检测DNA中突变位点的方法。
背景技术：
错配修复系统MMR维护着遗传物质的稳定性。错配识别蛋白MutS是错配修复系 统行使修复功能的第一个蛋白，具有识别结合错配碱基对的能力。由于MutS蛋白特异性结 合错配的特殊功能，特异性结合错配的特殊功能使其在检测突变和SNP的研究中具有很大 的应用潜力。目前细菌的错配修复系统已经研究得比较透彻。在大肠杆菌错配修复系统中 包含十多种蛋白，即MutS、MutL、MutH，DNA解旋酶II (DNA helicasell)、单链结合蛋白 核酸外切酶I ( exonuclease I)、核酸外切酶VII ( exonuclease VII)、核酸外切酶X ( exonuclease X )、RecJ、DNA 聚合酶 III 全酶(DNA polymeraseIII holoenzyme)、DNA 连
接酶等。整个修复过程是由错配识别蛋白MutS 二聚体识别并结合错配起始的，随后MutL 蛋白与MutS结合，这个过程受ATP调节，然后MutL-MutS-错配复合物激活MutH蛋白的内 切酶活性，在尚未甲基化的DNA链识别GATC序列(直到结合位点上游11Λ左右)并切开一 个缺口，DNA解旋酶II从缺口向错配方向解开双链，几种核酸外切酶将解开的单链降解， DNA聚合酶III负责重新合成这条片断，最后由连接酶将缺口封闭起来完成修复。大肠杆菌错配识别蛋白MutS大小约97kD，在体外大肠杆菌MutS能够识别并结 合全部八种错配，以及由碱基修饰引起的误配，还能识别结合1-4个核苷酸插入或缺失形 成的loop环结构，其中G:T，A:C，A:A，G:G结合效率较其它错配高。近年来已有一些研究探索MutS蛋白在检测和富集突变以及检测SNP方面的应 用，相比其他的技术如变性梯度胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)，及其派生的方法以及如异源双链分析(hetero-duplex analysisHA)和单链构象多 态性分析(single—stranded conformational polymorphism analysis SSCP)等，更力口简 便更加灵敏。Wagner等报道过将大肠杆菌MutS蛋白结合在硝酸纤维素膜上精确快速检测 点突变的方法，Pawel等报道过一种利用耐高温MutS酶切保护来检测突变的方法。以上方法大都是研究单基因已知或未知突变位点的检测，由于不能解决基因组酶 切片段间的特异性杂交问题，从而限制了它们进一步更广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在针对现有技术的不足，提供一种利用MutS蛋白在基因组范围内 检测单核苷酸多态性或小的插入和缺失的方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的
发明将待检测DNA分子和野生型DNA分子混合后进行变性和复性，实现待检测的DNA分子与野生型DNA分子相应片段特异性的杂交，再加入生物素标记MutS蛋白，回收该蛋白 即可完成突变位点的识别和提取。将提取所得的物质进行PCR扩增和测序，即可检测分析
突变基因。发明的原理在于若待检测DNA分子含有变异位点(单核苷酸变异或小片段的插 入和缺失)，则该片段因为有相同或相似的迁移率而使得野生型片段与突变体相应片段进 行杂交，从而形成含有错配碱基的异源双链DNA分子，而MutS蛋白能够特异地识别并结合 这些单链区域，由于该MutS蛋白已被生物素标记，所以可以被链霉亲和素磁珠所吸附分
1 O上述待检测DNA分子和野生型DNA分子在混合前，均先经过限制性内切酶完全消 化，并且均连接以下接头
SEQ ID NO 1 ( 5 ‘ -CATGCTTGTAGACTCACA-3 ‘)禾口 SEQ ID NO 2 (3， -ACGAACATCTGAGTGTGC-5，)。所述的限制性内切酶是识别4或6碱基的，并且能够产生粘性末端的限制性内切 酶，以便于连接接头序列。可采用Taq I限制性内切酶。待检测DNA分子和野生型DNA分子的变性和复性，是采用琼脂糖凝胶电泳法、聚丙 烯酰胺凝胶电泳法、毛细管电泳法、或液相色谱法来实现。优选采用琼脂糖凝胶电泳法，方 法如下
(1)电泳在2. 0-2. 5%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为20-30V，至溴酚蓝指示线到达凝胶 中前部；(2)杂交切取含有DNA的凝胶部分，放置在变性液(0. 5M NaOH, 0. 6M NaCL)中， 室温下变性30-40分钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗2次，放置于复性缓 冲液(50% (W/V)甲酰胺，25mM 磷酸钠缓冲液(PH6. 8)，IM NaCL, 5mM EDTA, 10% (W/V)聚 乙二醇PEG8000)内，室温下复性20-30分钟，重复复性3次，每次均为20-30分钟，并用新 鲜的缓冲液，最后凝胶块放置在复性缓冲液中M-36小时，温度为45°C，最后用TE缓冲液冲 洗2-3次。实现待检测的DNA分子与野生型DNA分子相应片段特异性的杂交后，再加入生 物素标记MutS蛋白时，每5-10 μ g的待检测DNA加入0. 1-0. 5 μ g的生物素标记MutS，加 入1. 0—2.0μ 1 IOxMutS反应缓冲液，加水补至10μ 1，成为混合液，在；35 — 60°C下培育 30-60分钟。可采用如下体系每10 μ g的待检测DNA加入0. 5 μ g的生物素标记MutS，反 应体系一般为 20 μ 1，含有 1. OxMutS 反应缓冲液[50mM Tris-HCl (PH 7.5)，100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM β-巯基乙醇，10% (V/V)甘油，20 mM MgCl]，加水补至 20 μ 1，成为混 合液。加入MutS蛋白后在35-60°C下培育30分钟，然后利用链霉亲和素磁珠吸附回收目的 DNA。所加入生物素标记MutS蛋白，可以是是大肠杆菌MutS蛋白或嗜热栖热菌MutS蛋 白或嗜血流感菌MutS蛋白。回收MutS蛋白时采用链霉亲和素磁珠吸附回收。可以采用以下优选方法进行检测
1、提取野生型和突变体基因组DNA；
2、取等量的野生型基因组DNA和突变体基因组DNA(5-10 μ g)，作为研究对象；
3、利用适量的TaqI限制性内切酶完全消化上述基因组DNA ；
4、连接接头，接头序列为SEQ ID N0:1 5’ -CATGCTTGTAGACTCACA-3’ SEQ ID NO:2 3’ -ACGAACATCTGAGTGTGC-5’ 接头的下链要利用T4多核苷酸激酶，反应体系根据不同公司的产品进行确定，连 接反应时间在10小时以上；
5、混合将经过上述处理的野生型基因组DNA和突变体基因组DNA等量混合；
6、电泳在2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为20-30V，至溴酚蓝指示线到达凝胶中前
部；
7、杂交切取含有DNA的凝胶部分，放置在变性液(0.5M NaOH, 0. 6M NaCL)中，室温下 变性30分钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗2次，放置于复性缓冲液(50% 甲酰胺，25mM 磷酸钠缓冲液(PH6. 8)，IM NaCL, 5mM EDTA, 10% (W/V)聚乙二醇PEG8000) 内，室温下复性20分钟，重复复性3次，每次均为20分钟，并用新鲜的缓冲液，最后凝胶块 放置在复性缓冲液中M小时，温度为45°C，最后用TE缓冲液冲洗两次。8、DNA片段的回收利用凝胶回收试剂盒回收DNA片段，并将DNA浓度调整为
0.5 μ g/ μ 1 ；
9、生物素标记MutS的结合取上述DNA溶液10 μ 1，1. 0 μ 1生物素标记MutS(6pmol)，
1.OxMutS 反应缓冲液[50mM Tris-HCl (PH 7.5)，100 mM KCl, 0. 1 mM EDTA, 5 mM β-巯 基乙醇，10% (V/V)甘油，20 mM MgCl]，加水补足20 μ 1，加入MutS蛋白后在35或60°C下培 育30分钟，然后利用链霉亲和素磁珠吸附回收目的DNA。10、连霉亲和素磁珠吸附利用过量的磁珠吸附回收生物素标记的片段，并重复吸 附回收2-3次；
11、PCR扩增以上述吸附回收后的溶液为模板，进行PCR扩增，退火温度为55°C，延伸 时间为1. 0分钟；电泳检测电泳结果，并回收扩增片段，进行测序；
12、生物信息学分析测序结果，分析与突变分子机理。本发明方法中，最关键的一步在于能够实现两个相似的基因组DNA限制性消化片 段特异性的杂交，其原理是根据序列一致或相似的DNA片段在凝胶的电泳迁移率相同或基 本相同，变性并复性后能够特异性地形成含有错配单链区域的异源双链DNA分子，该错配 单链区域能够被Mut S蛋白特异性地识别并结合，进而通过生物素进行亲和吸附。本发明 采用的杂交条件是在多次试验摸索下总结出来的优化选择，在该条件下可进行充分杂交， 再结合生物素标记MutS蛋白的提取，可以提高突变位点的识别检测的准确率高，准确率达 到80%以上。本发明的创造性在于克服了现有突变检测技术仅仅能够检测单基因已知或未知 的突变，实现了全基因范围内对变异位点的准确而又快速的扫描。现有能够克隆自发突变基因的技术有图位克隆法，但是该方法需要建立一个比较 大的杂交群体，以靠无性繁殖的苹果为例，建立一个F2代杂交群体需要20年的时间，香蕉 也需要4-5年，癌症也是一种自发突变，克隆原癌基因对于人类健康尤其重要，但是由于伦 理的原因，不能够建立人的F2代群体，另外该方法还要求研究对象的基因组比较小、重复 序列少、有高密度的遗传图谱等，因此现有条件限制了该方法高效地克隆自发突变基因，本 发明方法可以有效地解决以上方法的局限性，仅仅需要3-5天的时间，就能对突变体基因 组DNA实现完全扫描，找到突变的SNP或INDEL位点。
具体实施例方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例1突变位点的识别检测。1、从香蕉叶片中提取天宝高脚和抗枯1号香蕉的基因组DNA ；
2、取等量的野生型基因组DNA和突变体基因组DNA(5-10 μ g)，作为研究对象；
3、利用适量的TaqI限制性内切酶完全消化上述基因组DNA ；
4、连接接头，接头序列为
SEQ ID N0:1 5’ -CATGCTTGTAGACTCACA-3’ SEQ ID NO:2 3’ -ACGAACATCTGAGTGTGC-5’ 接头的下链利用T4多核苷酸激酶，连接反应时间在10小时；
5、混合将两者等量混合；
6、电泳在2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为20-30V，至溴酚蓝指示线到达凝胶中前
部；
7、杂交切取含有DNA的凝胶部分，放置在变性液(0.5M NaOH, 0. 6M NaCL)中，室温下 变性30分钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗2次，放置于复性缓冲液(50% 甲酰胺，25mM 磷酸钠缓冲液(PH6. 8)，IM NaCL, 5mM EDTA, 10% (W/V)聚乙二醇PEG8000) 内，室温下复性20分钟，重复复性3次，每次均为20分钟，并用新鲜的缓冲液，最后凝胶块 放置在复性缓冲液中M小时，温度为45°C，最后用TE缓冲液冲洗两次；
8、DNA片段的回收利用凝胶回收试剂盒回收DNA片段，并将DNA浓度调整为0.5 μ g/
μ ；
9、生物素标记MutS的结合取上述DNA溶液10μ 1，1. 0 μ 1生物素标记MutS(6pmol)， 1. OxMutS 反应缓冲液[50mM Tris-HCl (PH 7.5)，100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM β-巯基乙醇，10% (V/V)甘油，20 mM MgCl]，加水补足20 μ 1，加入MutS蛋白后在60°C下 培育30分钟；
10、连霉亲和素磁珠吸附利用过量的磁珠吸附回收生物素标记的片段，并重复吸附回 收2次。试验结果按照上述步骤进行操作，分离得到5个DNA片段。实施例2突变位点测序
1、PCR扩增以实施例1吸附回收后的溶液为模板，进行PCR扩增，引物序列为SEQ ID NO: 3 :CATGCTTGTAGACTCACA,退火温度为55°C，延伸时间为1. 0分钟；电泳检测电泳结果，并 回收扩增片段，进行测序。测序结果扩增结果进行测序并进行比对，发现一个NBS-LRR类的抗病基因片段 存在变异，序列如下(其中带下划线碱基代表变异位点)
^ζ^Μ ΡSEQ ID NO:4 gttactcgga gagttaattc ggtgcgcatc taacaaatct gaaggagGtg aagccaaaca
Jfctt 1 SEQ ID NO:5 gttactcgga gagttaattc ggtgcgcatc taacaaatct gaaggagCtg aagccaaaca
^ζ^Μ Ρ SEQ ID NO :6 agaatctttc gagggacaaa gcaaatcaga attggaaatc aaacttgcctctctcctcac
抗枯1号 SEQ ID NO:7 agaatctttc gagggacaaa gcaaatcaga attggaaatc aaacttgcct ctctcctcac
突变位点的识别检测和突变位点测序过程所需总时间仅5天。经3次验证结果准确无误。
权利要求
1.利用MutS蛋白在基因组范围内检测单核苷酸多态性或小的插入和缺失的方法，其 特征在于将待检测DNA分子和野生型DNA分子混合后进行变性和复性，实现待检测的DNA 分子与野生型DNA分子相应片段特异性的杂交，再加入生物素标记MutS蛋白，回收该蛋白 即可完成突变位点的识别和提取。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于将提取所得的物质进行PCR扩增和测序，检测 分析突变基因。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的待检测DNA分子和野生型DNA分子在 混合前，先经过限制性内切酶完全消化，并连接接头SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2;混合为等量混合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶是识别4或6碱基的，并 且能够产生粘性末端的限制性内切酶。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶是TaqI限制性内切酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待检测DNA分子和野生型DNA分子的变 性和复性，是采用琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、毛细管电泳法、或液相色谱 法来实现。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述琼脂糖凝胶电泳法的步骤为(1)电泳 在2. 0-2. 5%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为20-30V，至溴酚蓝指示线到达凝胶中前部；(2) 杂交切取含有DNA的凝胶部分，放置在氢氧化钠-氯化钠变性液中，室温下变性30-40分 钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗2次，放置于复性缓冲液内，室温下复性 20-30分钟，用新鲜复性缓冲液重复复性3次，每次均为20-30分钟，最后凝胶块放置在复 性缓冲液中M-36小时，温度为45°C，最后用TE缓冲液冲洗2-3次。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的杂交后的DNA中加入生物素标记 MutS蛋白时，每5-10 μ g的待检测DNA加入0. 1-0. 5 μ g的生物素标记MutS，加入1. 0— 2.0 μ IlOxMutS反应缓冲液，加水补至10_20μ 1，成为混合液，在35-60°C下培育30-60分 钟。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的MutS蛋白是大肠杆菌MutS蛋白或 嗜热栖热菌MutS蛋白或嗜血流感菌MutS蛋白。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的回收是采用链霉亲和素磁珠吸附 回收。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用MutS蛋白在基因组范围内检测单核苷酸多态性或小的插入和缺失的方法，包括以下步骤将待检测DNA分子和野生型DNA分子混合后进行变性和复性，实现待检测的DNA分子与野生型DNA分子相应片段特异性的杂交，再加入生物素标记MutS蛋白，回收该蛋白即可完成突变位点的识别和提取。将提取所得的物质进行PCR扩增和测序，即可检测分析突变基因。本发明方法相对于现有方法更加简便而灵敏，可以准确识别检测突变位点，可靠性强。
文档编号C12Q1/68GK102102129SQ201010589819
公开日2011年6月22日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者孙清明, 易干军, 李春雨 申请人:广东省农业科学院果树研究所