专利名称：重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，是一种重型肝炎相关基因启动子甲基化状态信息及其应 用。具体地说是检测与重型肝炎相关的基因启动子甲基化状态的方法和试剂盒。
背景技术：
慢加急性重型肝炎(ACHBLF)是在慢性肝病的基础上，由多种因素引起的严重肝 损害，导致肝脏的合成、排泄、生物转化和解毒等功能发生严重障碍，出现以黄疸、凝血功能 障碍、肝性脑病、以及腹水等为主要表现的一组临床症候群。我国是乙型病毒性肝炎的高发 区，其乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率达10%，现患者约3000多万，其中60%以上为慢 性乙型病毒性肝炎(CHB)。这些携带者和慢性肝炎患者常有恶化或发展成重型肝炎的可能， 因此，在我国，乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起慢加急性重型肝炎的主要病因。据统计，由 乙型肝炎病毒致重型肝炎占重型肝炎的81 %。在乙型肝炎病毒感染基础上发生的慢加急性 重型肝炎常称为慢加急性重型乙型病毒性肝炎。在我国，慢加急性肝衰竭不仅发病率高，而 且病情复杂，病情凶险，发展迅速，预后不良，常出现各种并发症，严重危及患者的生命。所 以研究慢乙肝的防治及防止慢乙肝向慢重肝、肝硬化甚至肝癌转变具有十分重要的意义。慢加急性肝衰竭的发病机制非常复杂，迄今为止还远远未能阐明。目前与HBV相 关性疾病研究的有关的疾病主要有HBV相关性肝炎、肝硬化和肝癌。随着基因启动子区甲 基化与各种肿瘤包括肝癌的相关性研究增多，甲基化成与HBV相关性疾病研究的有关的疾 病主要有HBV相关性肝炎、肝硬化和肝癌。随着基因启动子区甲基化与各种肿瘤包括肝癌 的相关性研究增多，甲基化成为研究的越来越多的表观遗传学内容。有研究指出，HBV感染 机体导致相关性肝脏疾病的发生可能与某些基因的过甲基化有关。HBV是一种嗜肝病毒，感染肝细胞后，HBV-DNA可与宿主肝细胞发生整合，从而使 宿主的基因组发生广泛的改变，包括缺失、易位、转录产物的融合和广泛的基因组不稳定。 病毒进入机体诱导宿主甲基化转移酶(DNMT)活性增加，可催化病毒脱氧核糖核酸(DNA)启 动子甲基化。在病毒基因被甲基化的同时，由于活性增加的甲基化转移酶同时也可对宿主 的基因发挥甲基化修饰作用，因此人体正常DNA也可能被甲基化修饰，从而使宿主本身的 基因启动子区也发生过甲基化。DNA甲基化是表观遗传学上研究最深入的一种机制，它是一种酶介导的化学修饰 过程。DNA甲基化是指5-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基化转移酶的作用下，将 胞嘧啶核苷酸的嘧啶环第5位碳原子甲基化，并与其3’端的鸟嘌呤形成甲基化的CpG岛。 CpG岛是基因组中长度为300 3000碱基对(bp)的富含CpG 二核苷酸的一些区域，主要存 在于基因的5'区域。正常情况下，启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需 的，基因组中绝大多数位点的甲基化状态恒定不变，只有少数位点的甲基化状态可以发生 改变，当基因组DNA的甲基化状态发生改变时，会造成机体染色体不稳定或基因表达异常， 可导致基因转录被抑制。因此研究HBV导致的宿主基因甲基化对于减轻HBV导致的肝细胞损伤、减少慢性肝炎向重症肝炎转化、降低HBV相关性肝癌的发生具有重要意义。为研究HBV相关性肝炎、 肝硬化、肝癌提供了新的思路。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种能够保护肝脏细胞免受各种因素损伤的重要的酶。 还原型谷胱甘肽具有清除自由基、抗氧化、抗炎、解毒、促进胆酸代谢、保护细胞膜、改善肝 脏功能、减轻组织损伤和促进组织修复等功能。还原型谷胱甘肽广泛存在于正常细胞内，尤 其在肝细胞内含量最为丰富。它参与体内三羧酸循环及糖代谢，能激活多种酶类，从而促使 糖、脂及蛋白质的代谢，并直接影响肝细胞的代谢过程。能对抗脂质过氧化，是人体抗氧化 系统的重要组成部分，具有保护肝细胞膜、促进肝脏酶活性、清除氧自由基和促进肝脏合成 功能等作用。慢性乙型病毒性肝炎肝细胞受损可引起还原型谷胱甘肽缺乏，使肝细胞对氧 自由基及其他内外源性物资的清除能力降低，加重肝细胞损伤。临床上常通过补充外源性 还原型谷胱甘肽而保护肝脏合成，解毒，灭活激素等功能。还原型谷胱甘肽发挥上述保护肝 细胞的作用时要依赖于谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的催化作用，谷胱甘肽巯基转移酶属代 谢解毒酶系，主要催化谷胱甘肽和亲电性物质之间的反应。谷胱甘肽巯基转移酶是一种二 聚体同工酶，具有强有力的催化作用，能催化底物分子，亲电子中心与还原型谷胱甘肽的轭 合，促进其代谢、失活，是体内生物转化最重要的II相代谢酶之一。谷胱甘肽巯基转移酶超 家族按其染色体定位和序列同源性，主要分为α、μ、π、θ 4个亚家族。谷胱甘肽巯基转 移酶亚家族分别参与不同化学物质的代谢，但彼此间底物选择范围可发生部分重叠。其中 GSTy、π、θ的作用尤为突出。谷胱甘肽硫转移酶Pl (GSTPl)属于GST-π亚家族。GSTPl 基因表达降低时会影响到对谷胱甘肽的催化作用，而GSTPl基因启动子区的CpG岛甲基化 即可使GSTPl的表达降低。病毒诱导细胞内DNA启动子甲基化可能是病毒重要的致病机制 从而可能使保护肝脏免受损伤的基因如GSTPl表达降低，使GSH功能受损。Wang等的研究 发现提示，肝癌组织中GSTPl基因启动子区的甲基化并不是只在肝癌阶段才出现的，而是 在肝脏疾病发生的长期演变以及HBV不断作用下发生的。国内外研究表明，HBV相关性肝癌中存在谷胱甘肽巯基转移酶(GSTPl)基因启动 子的超甲基化，但是否在慢性乙型病毒性肝炎和重症肝炎患者中是否也存在甲基化以及是 否影响了病情的进展和预后，还未有研究。有关GSTPl启动子的甲基化的既往的文献研究 主要与肿瘤的发生有关，比如说肝癌、肺癌和前列腺癌等。有研究发现了肝硬化患者血浆中 存在GSTPl启动子区的甲基化。基于以上研究，本发明人首次提出了 GSTPl启动子的甲基 化与慢加急肝衰竭有关。考虑到GSTPl是一种抗氧化损伤的酶，那么通过启动子区甲基化 GSTPl被抑制后，可能会促进氧化应激对肝脏的损伤，而氧化应激与慢加急性肝衰竭相关。 这一遗传学改变是一个长期的过程，它可能存在于肝炎到肝硬化肝癌的各个过程中，因此 甲基化的异常可能在从慢乙肝到重肝的发病过程中起到一定的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便适用的检测重型乙型病毒性肝炎慢加急性肝衰 竭相关基因启动子甲基化状态的试剂盒，以及简便可行检测方法，其检测结果为重型肝炎 的临床诊治提供科学依据。本发明是这样实现的，本试剂盒内设有使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂， 2XTaq PCR MasterMix，以及针对人谷胱甘肽硫转移酶Pl (GSTPl)基因的启动子GpG岛甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对。为了方便使用，本试剂盒内还可以设有外周血单个核DNA提取试剂，这样，用一个 试剂盒就可以做由采血到重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的全过程。为了便于对比，本试剂盒内还可以设有阳性对照和/或阴性对照。本试剂盒中所述的启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对选自 下组为
权利要求
1.重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的试剂盒，其特征在于盒内设有使非甲 基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，2XTaq PCR MasterMix,以及针对人谷胱甘肽硫转移酶 Pl基因的启动子甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对。
2.根据权利要求1所述的重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的试剂盒，其特征 在于盒内还设有外周血单个核DNA提取试剂。
3.根据权利要求1所述的重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测试剂盒，其特征在 于盒内还设有阳性对照和/或阴性对照。
4.根据权利要求1所述的重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的试剂盒，其特征 在于盒内启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对选自下组为名称序列编号GSTPl M-上游引物TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC1M-下游引物GCCCCAATACTAAATCACGACG 2U-上游引物GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT 3U-下游引物CCACCCCAATACTAAATCACAACA 4
5.根据权利要求1所述的重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的试剂盒，其特征 在于所述盒内设有的启动子甲基化特异性引物的长度为15-40bp。
6.根据权利要求1所述的重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的试剂盒，其特征 在于盒内设有的使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂为亚硫酸氢盐，联苯二酚和氢氧 化钠。
7.根据权利要求2所述的重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的试剂盒，其特 征在于所述的盒内的外周血单个核DNA提取试剂为柠檬酸钠，氢氧化钠，苯酚，异硫氢酸 胍，三氯甲烷，十二烷基肌氨酸钠，乙醇，醋酸钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸 (EDTA)和N- (2-羟乙基)哌嗪-N' -2-乙烷磺酸(HEPES)。
8.重型肝炎相关基因启动子甲基化状态的检测方法，其特征在于使非甲基化胞嘧 啶转化为尿嘧啶的试剂将提取的外周血单个核细胞DNA进行修饰；将修饰后的外周血 单个核细胞DNA与启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物、2XTaq PCR MasterMix、双蒸馏水进行混合，使其产生甲基化特异性聚合酶链式反应，甲基化特异性聚 合酶链式反应后所扩增出的扩增产物长度为90-100bp，最后检测各基因启动子甲基化状 态，得出检测结果。
全文摘要
本发明涉及一种重型肝炎相关基因启动子甲基化状的检测的方法和试剂盒。它设有使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，2×Taq PCR MasterMix，以及针对人谷胱甘肽硫转移酶P1基因的启动子甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对。将提取的外周血单个核细胞DNA进行修饰后，使其与启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物、2×Taq PCR MasterMix、双蒸馏水进行混合，并产生甲基化特异性聚合酶链式反应，得到扩增产物，检测其甲基化状态，有助于临床医生判定重型肝炎患者的病情和进行治疗。
文档编号C12Q1/68GK102134610SQ20101058982
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者张建军, 李涛, 王丽媛, 王凯, 范玉琛, 韩婕 申请人:山东大学齐鲁医院