专利名称：一种水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa;Pht1;4的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa; Phtl ；4的应用。
背景技术：
1、转基因粮食存在安全性问题植物转基因是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转 移到植物基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优 质等。但是对于转基因粮食的安全性在全球一直存在激烈分歧。在我国更是如此，特别是 自去年11月农业部批准两种转基因水稻的安全证书以来，就转基因水稻转基因玉米商业 化问题的质疑就没有间断过。总之，到目前为止转基因安全性问题并没有解决。2、培育籽粒中没有转基因成份可放心食用的转基因作物具有重要意义转基因安全性问题包括食用安全和环境安全两大方面，人们更关心的是食用安 全。在这方面各个国家还是比较“谨慎”的，例如，种植比较多的转基因玉米和大豆在美国 主要是用于饲料、生物燃料、食品工业等，美国人直接食用的比例非常小。目前，转基因育种基本都是利用强启动子35S或WDiqitin启动功能基因，这样使 得植物各个组织器官组成型表达，其中也包括食用部分。在这种情况下，培育出食用部分， 如籽粒中没有转基因成份将会消除人们对转基因产品的种种顾虑，放心食用。水稻是全世界一半以上人口的主食，显而易见培育大米中没有转基因成份可放心 食用的转基因水稻具有重要意义。3、提高作物磷利用效率迫在眉睫磷素是作物生长发育必需的大量营养元素之一，也是作物体内许多重要有机化合 物的组成成份。然而，一方面土壤中有效磷的浓度只有1-10 μ M，再加上植物对有效磷的吸 收利用效率的限制，已远不能满足植物生长发育对磷的需要；另一方面大量使用磷肥已经 造成严重的环境污染。经过十几年的研究，人们发现植物基因组中存在的高亲合力Witl家族磷酸盐转 运蛋白担负着低磷条件下根系吸磷重任。水稻中有多个磷酸盐转运蛋白。其中本申请 ORYsa ；Phtl ；4是高亲和磷转运蛋白OsWitl家族中的一个重要成员。
发明内容
本发明的目的在于针对转基因植物安全性的问题，提供水稻磷酸盐转运蛋白基因 ORYsa ；Phtl ；4在开发水稻籽粒中没有转基因成份、可放心食用的转基因水稻品种中的应用。本发明的另一目的是提供水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在提高土壤中 有效磷利用效率方面的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现
水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在开发水稻籽粒中没有转基因成份、可 放心食用的转基因水稻品种中的应用。其中，所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4的核苷酸序列登录号为 AF536964，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4编码区扩增的特异上下游引物序 列分别为:SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4启动子区域扩增的特异上下游引 物序列分别为SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在提高土壤中有效磷利用效率方面的应用。其中，所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4的核苷酸序列登录号为 AF536964，其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0. 2。所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4编码区扩增的特异上下游引物序 列分别为:SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4启动子区域扩增的特异上下游引 物序列分别为SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在开发水稻籽粒中没有转基因成份同时 提高土壤中有效磷利用效率的水稻品种中的应用。有益效果1、本发明通过大量的实验研究，发现ORYsa ；Phtl ；4具有在根部特异表达这一特 点。基于这一发现，用其本身启动子超表达该基因，这样获得的转基因水稻籽粒中没有转基 因成份、磷素利用效率也大大提高，为培育安全、放心食用、高磷素利用效率的水稻品种提 供新思路。2、ORYsa ；Phtl ；4具有根部特异表达特性，其转基因水稻中只有根部具有转基因 成份，为开发水稻籽粒中没有转基因成份可放心食用的转基因水稻提供保障。3,ORYsa ；Phtl ；4基因启动子+编码区的转基因水稻植株根长度显著增加，表明转 基因水稻磷吸收效率显著增强，适于贫瘠土壤条件下种植。4、本发明首次提供了水稻ORYsa ；Phtl ；4蛋白的磷酸盐吸收转运功能，异源表达 系统研究表明ORYsa ；Phtl ；4为双亲和磷酸盐转运蛋白。5、本发明首次提供了水稻根部特异表达的基因ORYsa ；Phtl ；4的磷酸盐转运蛋白 的工程应用。ORYsa ；Phtl ；4基因所编码的蛋白质对磷双亲合力，将其作为目的基因导入植 物，有望应用于单子叶植物的遗传改良。6、本发明提供的ORYsa ；Phtl ；4基因的编码区及其启动子来自水稻，其基因工程 受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶 植物。
图1两种磷处理条件下ORYsa ；Phtl ；4在水稻不同部位(根，叶片)表达特征。示 ORYsa ；Phtl ；4根部特异表达。
图20RYsa ；Phtl ；4本身启动子+ORYsa ；Phtl ；4编码区+GUS转基因植株的组织染 色。示ORYsa ；Phtl ；4根部特异表达。左上四图为在低磷(-P)和正常供磷(+P)条件下根尖的组织染色结果；右上四图 为在低磷(-P)和正常供磷(+P)条件下支根发生区的组织染色结果；左下四图为在低磷 (-P)和正常供磷(+P)条件下根茎结合部的组织染色结果；右下四图为在低磷(-P)和正常 供磷(+P)条件下叶片的组织染色结果。图3 转基因株系在正常供磷条件下的磷含量4-T-6表示获得的转基因ORYsa ；Phtl ；4株系6 ；4-T-7表示获得的转基因ORYsa ； Phtl ；4株系7 ;WT表示日本晴野生型。图4 酵母异源表达ORYsa ；Phtl ；4蛋白的功能验证，A 酸性磷酸酶强度检测ORYsa ；Phtl ；4基因对缺失内源高亲和磷转运蛋白的酵 母突变体MB192磷素吸收功能的互补，其中a 磷含量为20 μ M的YNB培养基；b 磷含量为 40 μ M的YNB培养基；c 磷含量为60 μ M的YNB培养基；d 磷含量为100 μ M的YNB培养基； B 用同位素33Ρ测定酵母Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4对磷素吸收的速率(pH 6. 0)。图5 双元植物表达载体pSlaG-3图谱。图6 酵母异源表达载体P112A1NE图谱。
具体实施例方式实施例1.(基因)序列的获得1、ORYsa ；Phtl ；4基因编码区序列的获得申请人:在NCBI网站(www. ncbi. nlm. nih. gov)上输入0sPT4得到序列号为 AF536964的一段编码水稻高亲和磷转运蛋白基因的DNA序列。根据植物分子生物学国际植 物基因命名法委员会，Commission for Plant Gene Nomenclature of the International Society for PlantMolecular Biology)的要求，我们将该DNA序列命名为ORYsa ;Phtl ；4。 分析表明该基因全长编码区(即开放阅读框，0RF)序列为SEQ ID N0. 1，总长1617bp，编码 539个氨基酸。该基因没有内含子。2、ORYsa ；Phtl ；4基因启动子序列的获得根据获得的ORYsa ；Phtl ；4 编码区序列，在 NCBI 网站(www. ncbi. nlm. nih. gov)上 查找并获得其启动子区序列(SEQ ID N0. 7)。实施例2.利用RT-PCR鉴定水稻ORYsa ；Phtl ；4基因的时空表达模式1、总RNA的提取选用水稻品种“日本晴”，待水稻幼苗长至10天后，进行正常供磷(300μΜ KH2PO4) 和低磷(10 μ M KH2PO4)处理，3周后采集叶片和根部，分别采用TriZol试剂抽提总RNA，用 甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。2、ORYsa ；Phtl ；4基因的时空表达模式鉴定根据水稻ORYsa ；Phtl ；4基因的编码序列，设计以下ORYsa ；Phtl ；4基因特异引物 Ρ1、Ρ2扩增长度为772bp片度鉴定ORYsa ；Phtl ；4基因的时空表达模式。Pl ATCGTGGAGGAGCAGGAGAAGG(SEQ ID N0. 10)P2 CATCGTCATCGTCCTCGTTCTC(SEQ ID NO. 11)
具体步骤为以步骤1获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后进行PCR 扩增，PCR反应体系为25μ 1 :PCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP Mix 2 μ 1，正向和反向引物(PI、 P2)各1 μ 1，模板1 μ 1，DNA聚合酶0. 5 μ 1，双蒸水17 μ 1 ；PCR程序如下94°C预变性4分 钟，94°C变性30s，56°C复性lmin，72°C延伸1. 5min，33个循环后，72°C 5min。PCR产物凝胶 电泳鉴定ORYsa ；Phtl ；4基因的时空表达模式，结果见图1。委托上海生工公司测序确定序 列为 ORYsa ；Phtl ；4 片段。有图1可以看出，ORYsa ；Phtl ；4基因在低磷与供磷处理条件下，根部表达强烈，且 不受磷素营养调节。而叶片中没有表达，说明ORYsa ；Phtl ；4基因在根部特异表达。实施例3.利用ORYsa ；Phtl ；4启动子+编码区+GUS转基因水稻植株研究ORYsa ； Phtl ；4的应用前景本发明利用ORYsa ；Phtl ；4本身启动子序列启动该基因编码区序列。1、ORYsa ；Phtl ；4完整编码区序列的克隆选用水稻品种“日本晴”，待水稻幼苗长至10天后，进行正常供磷(300μΜ KH2PO4) 和低磷(10 μ M KH2PO4)处理，3周后取材(根尖、支根发生区、根茎结合部及叶片)，分别采 用TriZol试剂抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定 RNA含量。根据水稻ORYsa ；Phtl ；4基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引 物，并在上游和下游引物(SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)上分别引入限制性内切酶位点)(ho I。以获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真Tag酶进行PCR扩 增，PCR反应体系为25 μ 1 =PCR Buffer 2. 5 μ 1，dNTP Mix 2 μ 1，上游和下游引物各1 μ 1， 模板1 μ 1，DNA聚合酶0. 5 μ 1，双蒸水17 μ 1 ；PCR程序如下94°C预变性4分钟，94°C变性 30s，56°C复性lmin，72°C延伸1. 5min，33个循环后，72°C 5min。PCR产物克隆至克隆载体 PUC18。委托上海生工公司测序确定获得序列为水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4的 完整编码区序列。2、ORYsa ；Phtl ；4启动子序列的克隆选用水稻品种“日本晴”，发芽后在正常供磷条件下生长，3周后抽提总DNA用于 ORYsa ；Phtl ；4启动子序列的克隆。根据获得的ORYsa ；Phtl ；4启动子区序列(SEQ ID NO. 7)，设计带有Asc I和Pac I酶切位点和保护碱基的PCR扩增反应引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 5，下游引物序列 为 SEQ IDN0. 6。取Iyl以上获得的总DNA(约50ng)为模板，在25 μ L体系中进行目的序列的扩 增，所用PCR反应体系同上；扩增条件为94°C预变性4分钟，然后以94°C变性45s，55°C复 性45s，72°C延伸2. 5min，进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。通过凝胶电泳回收扩增 片段，与PUC18中间载体连接，委托上海生工公司测序确定获得水稻磷酸盐转运蛋白基因 ORYsa ；Phtl ;4 启动子 DNA 序列。3、ORYsa ；Phtl ；4植物表达载体的构建与转化植物双元表达载体pSlaG-3，其中含有报告基因β-葡糖醛酸糖苷酶 GUS(β -Iucuronidase, β-GUS)其图谱见图 5。
(1)编码区克隆至pSlaG-3 用限制性内切酶BioI分别切开以上克隆在pUC18T载 体上的ORYsa ；Phtl ；4编码区序列和表达载体pSlaG_3，回收后利用T-4连接酶将ORYsa ； Witl ;4基因编码区克隆到双元表达载体pSlaG-3。酶切鉴定表达载体准确无误。注表达 载体pSlaG-3中含有报告基因β -葡糖醛酸糖苷酶⑶S。(2)基因本身启动子序列克隆至已含有编码区的pSlaG-3 以上克隆在pUC18T载 体上的ORYsa ;Phtl ;4启动子片段，用稀有限制性内切酶Asc I和I^c I双酶切下。电泳 回收后，与同样用Asc I和I^c I双酶切的以上含有目的基因编码区序列的pSlaG-3载体 (含有⑶S报告基因)连接。然后转化至农杆菌EHA105(上海invitrigen公司)中。(3)采用根癌农杆菌介导方法将构建的表达载体转入水稻日本晴品种。诱导水稻 成熟胚愈伤。将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟(愈伤 量没过50ml离心管锥形部位即可，不停的摇动)；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上浙干 30-40分钟；愈伤组织置于共培养基上，28°C暗培养2. 5天。然后愈伤转入含250mg/L羧苄 青霉素(Car)和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行筛选。挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入 装有分化培养基的培养皿或分化罐中，放入恒温培养室分化成苗。再放入生根培养基中壮 苗一到两周。4、获得转基因水稻材料的鉴定(1)利用报告基因检测ORYsa ；Phtl ；4基因的时空表达谱⑶S染色检测将染色的组织放入含有⑶S染液的1.5ml离心管中，37°C过夜， 显现蓝色的样品为阳性植株，没有颜色的为假阳性苗。图2为ORYsa ;Phtl ；4本身启动子 +ORYsa ；Phtl ；4编码区+GUS转基因水稻植株的组织染色结果。结果(图2)显示，在正常 供磷(300 μ M)或低磷(10 μ Μ)两种磷处理条件下，生长21天的转基因苗中β-葡糖醛酸 糖苷酶⑶S表达的部位不同。与阳性对照(Ubi-GUS)相比，ORYsa ；Phtl ；4(0sPT4)无论在 低磷(10 μ M)还是在正常供磷(300 μ Μ)条件下只在根部表达，而在根茎连接部及叶片中没 有表达，这与RT-PCR结果相吻合(图1)。(2)转基因植株磷素的利用效率分别取水稻地下部(根部)和地上部作为植株样品，用钼锑抗比色法测定植株样 品(处理同上)中磷含量。105°C杀青30min，7(TC烘箱中烘烤两天，磨碎。称取约0. Ig植 株干样，用浓KSO4-H2A混合消煮。冷却定容后，用钼锑抗比色法，在722紫外-可见分光光 度计700nm处比色测定(鲍士旦，2000)。结果(图3)表明，该转基因材料培养生长三周后 其吸磷总量地下部(根部)全磷量增加33. 43%，地上部增加40. 80%，大大提高了磷素的 利用效率。综上所述，本发明人提供的ORYsa ；Phtl ；4的工程应用为水稻中首次报道。实验发 现该基因蛋白在水稻中只在根部表达，而在其他部位不表达。转基因植株还大大提高了水 稻磷吸收能力。由此可见，ORYsa ;Phtl ；4本身启动子+0RYsa;Phtl ；4编码区导入植物，可 获得根部特异表达、水稻籽粒中没有转基因成份可放心食用的、磷利用效率大大提高的转 基因材料。实施例4.酵母异源系统鉴定水稻ORYsa ；Phtl ；4功能1、构建酵母异源表达载体酵母突变体菌株MB192、酵母表达载体ρ112Α1ΝΕ (均见明凤等.水稻磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及功能分析.中国科学C辑，2006，36 :385-389)。以cDNA为模板(实 施例3步骤1)，以含有Eco R I，BamH I酶切位点引物(上游引物序列为SEQ ID NO. 8，下 游引物序列为SEQ IDN0. 9)扩增ORYsa ；Phtl ；4编码区后，与表达载体ρ112Α1ΝΕ载体(图 6)连接，构建酵母表达重组载体pll2AlNE-0RYsa ；Phtl ；4。ρ112Α1ΝΕ载体包含氨基酸选择 标记。2、酵母的转化挑取酵母突变体MB192单克隆于YEPD液体培养基中，于30°C下，250r/min培养至 OD600约为1. 0-1. 3时，收集细胞沉淀，等量体积预冷的无菌水重新悬浮、离心；1/2体积的预 冷的无菌水悬浮离心；最后悬浮于1/25体积的预冷的lmol/L的山梨醇中。为了获得好的 转化效果，加入25mmol/L的二硫苏糖醇在室温下处理lOmin，再用适量的lmol/L的山梨醇 洗涤酵母细胞，最终悬浮于1/200体积的预冷的山梨醇溶液中。取5μ L酵母重组表达载 体pll2AlNE-0RYsa ；Phtl ；4加入到50 μ L感受态酵母悬浮液中，混勻，迅速转移至电转化 杯中，以1. 5kV，200 Ω, 25 μ F进行电转化。加入ImLYEPD液体培养基温育Ih,重新用Imol/ L的山梨醇悬浮，平铺于YNB平板上，转化后的酵母称为酵母转化子Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4 ； 含有PH084基因的阳性对照为野生型酵母(见明凤等.水稻磷酸盐转运蛋白基因的克隆、 表达及功能分析.中国科学C辑，2006，36 :385-389)；阴性对照为突变株MB192。3、酵母互补实验将阳性对照野生型酵母、酵母转化子Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4以及阴性对照磷转运 蛋白基因突变体MB192培养于YNB固体培养基(不含磷素)上，挑取单菌落接种于液体不 含磷素的YNB培养基中，使其0D600为1. 0。取2ml培养物经3%葡萄糖溶液洗涤后分别接 种于含有不同磷素浓度(20 μ Μ、40 μ Μ、60 μ Μ、100 μ Μ)的YNB培养基中(试管)，在30°C恒 温箱中培养使其0D600为1. 0，然后加入2滴溴甲酚紫作为指示剂，观察不同磷浓度的培养 中颜色的变化，指示剂颜色的变化能够反应培养基的酸化程度，颜色为黄色为正常生长，颜 色越深(红或黑)表明酵母的生长状态不好。结果显示突变体MB192细胞只有在Pi浓度 100 μ M生长良好，具有酸性反应；而在20 μ Μ、40 μ M和60 μ M细胞生长显著受抑，无酸性反 应。而含有pll2-0RYsa ；Phtl ；4的细胞可以在Pi为60 μ M及以上的培养基上生长良好，并 具有酸性反应(图4)。根据功能互补实验，得出结论是ORYsa ；Phtl ；4所编码蛋白介导了 酵母细胞膜的磷酸盐转运。4、酵母生长过程中磷吸收量的测定采用同位素标记的方法测定酵母转化子Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4和突变株MB192 对磷素的吸收速率实验，方法参照P.Martinez and Persson(Martinez P, Persson B L.Identification, cloning and characterization of a derepressible Na+-coupled phosphate transporter inSaccharomyces cerevisiae.Mol Gen Genet,1998,258 628-638)。并通过SigmaPlotlO.O计算发现该磷转运蛋白的Km为189 μ M，最大吸收速率 为 0. 91noml Pi (mg yeast cells · min广1 (图 4)。由此我们认为 ORYsa ;Phtl ;4 为双亲和 磷转运蛋白体，这与报告基因GUS的鉴定结果(图2) —致。为了简单起见，本发明中ORYsa ；Phtl ；4有时标注为0sPT4。
权利要求
1.水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa；Phtl ；4在开发水稻籽粒中没有转基因成份、可放 心食用的转基因水稻品种中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa； Phtl ；4的核苷酸序列登录号为AF536964，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa； Phtl ；4编码区扩增的特异上、下游引物序列分别为=SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa； Phtl ；4启动子区域扩增的特异上、下游引物序列分别为=SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。
5.水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa;Phtl ；4在提高土壤中有效磷利用效率方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa； Phtl ；4的核苷酸序列登录号为AF536964，其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0. 2。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa； Phtl ；4编码区扩增的特异上下游引物序列分别为=SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa； Phtl ；4启动子区域扩增的特异上下游引物序列分别为=SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6。
9.水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa；Phtl ；4在开发水稻籽粒中没有转基因成份同时提 高土壤中有效磷利用效率的水稻品种中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa；Pht1；4的应用。水稻磷酸盐转运蛋白基因ORYsa；Pht1；4根部特异表达，为水稻中第一次发现的根部特异表达基因。该基因可在开发水稻籽粒中没有转基因成份放心食用同时提高土壤中有效磷利用效率的水稻品种中应用。
文档编号C12N15/82GK102115754SQ20101059199
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者吴娜, 孙淑斌, 徐国华, 范晓荣 申请人:南京农业大学