专利名称：：棉花的一种bHLH转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程领域。更具体地，本发明涉及棉花的一种bHLH转录因子及其编码基因与应用。
背景技术：
：棉纤维是重要的纺织原料，研究其生长、发育的分子调控机理将有助于棉花产量和品质的遗传改良。棉纤维是由位于子房内的胚珠外珠被上的表皮细胞发育而成的一种单细胞结构。它的形成经历四个时期启动期、伸长期(初生细胞壁的合成)、次生细胞壁的合成期和成熟期[1]。棉花胚珠表皮细胞(除气孔表皮细胞和珠孔细胞外)都具有分化成棉纤维的潜能，但只有30%的表皮细胞最终可形成单细胞的纤维。虽然棉花纤维是由胚珠外珠被的表皮细胞发育分化而成的一种单细胞结构，但是对其形成的分子机制了解甚少。植物发育生物学研究表明，不同植物中类似细胞、组织、器官发育的遗传机制常常具有高度保守性。拟南芥表皮毛的形成目前已知是由一些MTO类的转录因子调控的。转录因子如WD40(AtTTGl)，MYB(GLl或TOR)，以及bHLH蛋白(GL3或EGL3)共同决定拟南芥叶片表皮毛细胞的命运[2，3，4]。也就是说拟南芥表皮毛的启动至少是由三个基因(GLl，GL3/EGL3，TTGl)产物组成的复合体MYB-bHLH_WD40来控制的。棉花纤维的早期发育过程可能类似于拟南芥等植物中表皮毛的形成过程。已经知道，GLl(GLABROUS1)与TOR(WEREWOLF)是控制拟南芥表皮毛分化的主要基因之一。那么，棉纤维作为一种子房胚珠外珠被上的单细胞表皮毛，它的发育启动机制很可能也受MYB-bHLH-WD40复合体调控机制的控制，而且更类似于拟南芥单细胞表皮毛的发育启动调节机制。目前在棉花中已经克隆了一些纤维高或特异表达的MTO基因。最早分离到的R2R3MB基因是GhMYBl-GhMYB6[5]；GaMYB2编码一个R2R3MYB转录因子，在纤维早期发育中显著地表达W]；另外一个MTO基因，GhMYB25和控制金鱼草圆锥细胞和表皮毛分化的基因AmMIXTA/AmMYBMLl同源[7]；最近还发现棉花中存在一个AtCPC同源基因[8]。通过高通量的Microarry和定量基因表达还分离到许多与棉纤维发育相关的基因，其中包括一些棉花MYB基因[7-11]。此外，在棉花中还发现了(ihTTG基因(GhTTGl_GhTTG4)[12]。尽管有些研究者据此推测棉花中可能也存在类似于拟南芥中的bHLH和WD40蛋白和MYB蛋白相互作用形成一个转录因子复合体来控制棉纤维的启动与发育[13]，但至今在棉花中还没有报道。
发明内容本研究克隆了棉花中与拟南芥GL3同源的基因(ihGL3，它是一个含bHLH结构域的蛋白。因此，本发明的目的是提供一种bHLH转录因子及其编码基因。本发明提供的bHLH转录因子名称为(ihGL3，是具有序列表中SEQIDNo2所示氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQIDNo:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNo:2所示氨基酸序列相同活性的由SEQIDNo:2衍生的蛋白质。序列表中SEQIDNo2所示氨基酸序列是由6个氨基酸组成的蛋白质。bHLH转录因子(ihGL3的编码基因(ihGL3，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列；2)与序列表中SEQIDNo1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列由1884个碱基组成，该基因的读码框为自5，端第1个碱基到第1884个碱基。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的(ihGL3基因导入植物细胞，可获得纤维数量和性状得到改变的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。携带有本发明(ihGL3基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对培育纤维植物新品种，特别是培育棉花新品种具有重要意义。当本发明的基因被用于改变棉花纤维数量、质量性状时，可采用以下方法1、将本发明基因(ihGL3通过RNAi方法克隆到植物转化载体中；2、将所构建的植物转化载体转化可再生棉花组织(或器官)并使本发明的基因在转化的组织中表达；3、将被转化的组织(或器官)培养成植株。更具体地，本发明提供以下各项l、bHLH转录因子(ihGL3，其是具有SEQIDNo:2所示氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQIDNo:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNo:2所示氨基酸序列相同转录因子活性的由SEQIDNo:2衍生的蛋白质。2、根据以上1所述的转录因子，其特征在于它是具有序列表中SEQIDNo:2所示氨基酸序列的蛋白质。3、bHLH转录因子(ihGL3的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列；2)与序列表中SEQIDNo1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同转录因子功能的蛋白质的DNA序列。4、根据以上3所述的基因，其特征在于所述bHLH转录因子(ihGL3的编码基因是序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列。5、根据以上4所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自5’端第1个碱基到第1884个碱基。6、含有以上3-4任一项所述基因的表达载体，优选植物表达载体，更优选纤维植物表达载体，最优选棉花表达载体。7、含有以上3-4任一项所述基因的细胞系，优选植物细胞系，更优选纤维植物细胞系，最优选棉花细胞系。8、以上3-4任一项所述基因在培育纤维植物新品种、优选棉花新品种中的应用。9、一种制备转基因细胞系或转基因植物的方法，所述方法包括将根据以上6所述的表达载体导入细胞系或植物以获得转基因细胞系或转基因植物，所述细胞系或植物优选为植物细胞系或植物、更优选纤维植物细胞系或植物、最优选棉花细胞系或植物。10、一种制备转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤1)将以上3-4任一项所述的基因通过RNAi方法克隆到植物转化载体中；2)将所构建的植物转化载体转化可再生植物的组织(或器官)并使所述基因在转化的组织(或器官)中表达；和3)将被转化的组织(或器官)培养成植株，其中优选所述植物是纤维植物，更优选是棉花。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。图1为(ihGL3的表达分析(图中，-3d(天)，0d，3d，8d分别表示来自开花前3天，开花当天，开花后3天和开花后8天的胚珠(PA)；Le表示叶子；Po表示花粉；Pe表示花瓣。胚珠、叶子、花粉均来自野生型棉花徐州142(我国培育的陆地棉品种，广泛用于科学研究材料，商购自中国农业农科院)。下层为(ihUBQ7对照((ihUBQ7是个保守基因，所以我们用它作为对照，GenBankAccessionNo.AAZ83341.1)；图2为GhGL3RNAi载体构建图；图3为GhGL3RNAi转基因棉花Ttl代Southern分析(基因组DNA(20μg/泳道)来自野生型棉花(wt)和(ihGL3RNAi转基因棉花(图中M表示分子量标记；WT表示野生型棉花；i-1至i-10分别表示转基因棉花株系1和10)。分别用EcoRI和HindIII酶切。探针为ΝΡΤΙΙ(ΝΡΤΠ是抗性筛选基因，我们所用的转化载体上带有这个基因，用它作为探针就可以检测携带有目的片段的载体是否转入棉花植物体内，GenBankAccessionNo.ABN59488.1)；图4为GhGL3RNAi的qRT_PCR表达分析(图中的GL3i_2表示GhGL3RNAi转基因棉花(i-2)Tl代；WT表示野生型)；图5为(ihGL3RNAi转基因植株的表型分析((ihGL3RNAi转基因棉花Tl代表型观察。A野生型成熟的棉纤维，标尺2cm；B:GhGL3RNAi(GL3i-2)转基因棉花成熟的棉纤维，标尺:2cm；C=A图放大，标尺=Icm；D=B图放大，标尺:1cm)；图6为GhGL3DNA序列(SEQIDNO1；1884bp,棉属陆地棉种(GossypiumhirsutumL.))；禾口图7为GhGL3氨基酸序列(SEQIDNO2；628a.a.，棉属陆地棉种(GossypiumhirsutumL.))。具体实施例方式实施例中所用的植物材料在棉花(GossypiumhirsutumL.)(野生型棉花徐州142(我国培育的陆地棉品种，广泛用于科学研究材料，商购自中国农业农科院))花期，挂牌观察开花时间，采集花苞、花蕾、花和幼铃于冰浴中带回到实验室中，用灭菌的器具迅速分别采集花前3天的胚珠、花期胚珠和花后1至3天的胚珠于液氮中速冻，_80°C保存备用。实施例1、GhGL3的表达分析为了验证(ihGL3是否为胚珠或纤维特异表达的基因，以各期胚珠、花粉及叶子为材料，我们进行了RT-PCR分析。结果表明，(ihGL3只在花期以前、花期和开花初期的胚珠中表达，而在花粉及叶子中都不表达(图1)，为胚珠特异表达的基因。具体方法用PlantRNeasyKit(QIAGEN)提取棉花(Gossypiumhirsutum)总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA的完整性。sscDNA和dscDNA的合成按照SMARTPCRcDNALibraryConstructionKit(CLONTECH)的方法，合成单链(ss)和双链(ds)cDNA。按以上方法合成徐州142棉花叶子，花粉，-3天胚珠(PA)，O天胚珠(PA)，4天胚珠(PA)，8天胚珠(PA)的sscDNA，稀释10倍后作为RT-PCR的模板。RT-PCR的两对引物根据(ihGL3的cDNA序列设计，棉花(ihUBQ7用来作为内源对照。关于RT-PCR扩增(ihGL3的引物分别为GL3-SmaI5'-CACCCGGGGTCTACTGGAGTTCAACATCAAG-3'(Forward)GL3-BamHI5‘-ACGGATCCCTCAACACTTGCTAGCAATTCTTTGC-3‘(Reverse)GhUBQ7的扩增引物5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3‘(Forward)5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3‘(Reverse)实施例2、GhGL3RNAi载体构建图和转化棉花分别利用PstI/BamHI和&icI/EcoRI两对酶切位点，通过使用以下一对引物PCR扩增，GL3-C015'-AGTCTGCAGGAGCTCCTTGCAGAAAGTCAGAAG-3'(Forward)GL3-C025‘-ATAGGATCCGAATTCTGAGAATGCTTAATGCAT-3‘(Reverse)将(ihGL3的一段序列分别以正向和反向的方向构建进入载体pPZPlll-RNAi中(pPZPlIl-RNAi转化载体的构建利用HindIII和BamHI两个酶切位点，将35Spromoter构建进入载体pPZPlIianvitrogen公司产品)中。RNAi载体中所用intron用棉花Ghsadl基因(NCBI，AJ132636)的intron，利用PstI和SacI两个酶切位点，将Ghsadl-intron构建进入载体PPZP111中，用于构建棉花RNAi转化载体。扩增intron引物为PstI-Intron5'-ATGCTGCAGGTTAGTGTCTTTCTTTCT-3‘SacI-Intron5'-GCCGAGCTCCTGTGTTCAGTAAAAATA-3‘)(图2)。完全测序确定无PCR和克隆错误后，转化到E.coliDH5a感受态细胞(Invitrogen公司产品)中，通过Kan抗性筛选阳性克隆。在大肠杆菌内鉴定连接正确后再将构建的质粒转入农杆菌AGLl(Invitrogen公司产品)中，用棉花5_7天的下胚轴和子叶为材料，农杆菌侵染的方法进行基因转化。具体步骤参考(Li，X.B.，X.P.Fan，X.L.Wang,etal.ThecottonACTINlgeneisfunctionallyexpressedinfibersandparticipatesinfiberelongation.Plant6Cell,2005.17(3):859-875)。实施例3、GhGL3RNAi转基因植株的Southern分析结果棉花基因组DNA的提取按Patersonetal(1993)，genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolecularBiologyR印orter，1993.11O):122-127所述的方法进行。取20μg基因组DNA，分别用EcoRI和HindIII(Takara产品)酶切。酶切产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳(30-50V，0/N)分离，然后用常规方法在摇床上处理电泳胶经0.125NHCl浸洗15min，变性液(1.5MNaCl,0.5NNaOH)浸洗30min,中和液(1.5MNaCl,0.5MTris-HClpH7.2)浸洗30min。最后用20XSSC将DNA印迹到HybondN+尼龙膜(Amersham)上。预杂交、杂交均按常规方法进行(金冬雁.黎孟枫译.分子克隆实验指南M.第2版.北京科学出版社，1996)；HybondN+Hiannual,Amersham)。探针标记用!Iomega公司的I^rimer-a-Gene试剂盒进行，标记过夜。杂交前用Qiagen公司的PCRPurification试剂盒进行探针纯化。将NPTII基因(编码新霉素磷酸转移酶)用作探针(NPTII是抗性筛选基因，我们的转化载体上带有这个基因，用它作为探针就可以检测携带有目的片段的载体是否转入植物体内。NPTII基因的GenBankAccessionNo.:ABN59488.1)。洗膜用高严谨方法进行(HybondNmannual，Amersham):2XSSC,0.1%SDS,15min；IXSSC,0.1%SDS,65°C,15min；2XSSC，0.1%SDS，65°C，15min。保鲜膜包裹杂交膜，_70°C下对X光片曝光。结果如图3所示，从图中可以看出，8个转基因株系中，只有i-2在EcoRI和HindIII的酶切泳道中杂交到一条带，说明(ihGL3基因是以单拷贝插入基因组。为了进一步确定(ihGL3(i-2)是否稳定遗传，我们用Southern检测Tl代(ihGL3(i-2)的拷贝数，结果(ihGL3基因还是以单拷贝插入基因组。因此我们用Tl代(ihGL3(iD转基因材料进行分析。实施例4、GhGL3RNAi转基因植株(i_2)的qRT_PCR表达分析结果为了验证(ihGL3表达在Tl代(ihGL3RNAi(i_2)转基因植物是否受到抑制，分别采集花前3天的胚珠、花期胚珠和花后1至3天的胚珠为材料，用PlantRNeasy试剂盒01IAGEN)提取总RNA，经1%琼脂糖电泳检测RNA的完整性。使用TaqManReverseTranscriptionRegents试剂盒(AppliedBiosystems)进行反转录，所得到cDNA样品稀释为Ing/μ1，取一微升样品进行检测，在实验中每个样品设三次重复。基因特异引物的设计使用PRIMEREXPRESS软件(AppliedBiosystems)。PCR反应及其检测分别使用SYBRGreenMastermix和ABI7900序列检测系统(AppliedBiosystems)。数据的处理采用ComparativeCT方法(UserBulletin#2,ABIPRISM7700序列检测系统)。以18SrRNA作为内对照对数据进行归一化。扩增引物为GHGL35'-TGTCCATGGCGAGAAGGAA-3‘(forward)5'-CTGAACTGAGTGGCAATCCAAA-3‘(reverse)18SrRNA5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3‘(forward)5'-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3‘(reverse)如图4所示，qRT-PCR结果表明，GhGL3的表达在GhGL3RNAi转基因植株(i_2)都受到抑制。实施例5、GhGL3RNAi转基因植株的表型分析为了验证(ihGL3在棉纤维发育过程中的作用，我们对Tl代(ihGL3RNAi转基因棉花进行表型观察(选择单拷贝插入的i_2转基因植株)，发现与野生型相比，转基因植株纤维较短且稀疏(图幻，这说明(ihGL3参与调控棉纤维的正常启动和发育。这些结果表明(ihGL3在棉纤维发育过程中起重要作用，其作用机制类似于GhMYB109。棉纤维是重要的纺织原料，研究者们一直致力于提高其产量和质量。在棉纤维发育的各个时期都有大量的基因对其发育起调控作用。弄清楚棉纤维发育的调控机制对提高棉花产量和品质具有十分重要的意义。(ihGL3能够在棉花的基因工程中得以应用，最终达到棉花遗传改良和提高产量的目的。参考文献1.Basra,Α.S.,C.P.Malik.Developmentofthecottonfiber.Int.Rev.Cytol,1984.89:65-113.2.Ramsay,N.A.,B.J.Glover.MYB-bHLH-ffD40proteincomplexandtheevolutionofcellulardiversity.TrendsPlantSci,2005.10(2):63-70.3.Glover,B.J.Differentiationinplantepidermalcells.JExpBot,2000.51(344):497-505.4.Hiilskamp,M.Planttrichomes:amodelforcelldifferentiation.NatRevMolCellBiol,2004.5(6):471-4805.Loguerico,L.L.,J.Q.Zhang,T.A.ffilkins.DifferentialregulationofsixnovelMYB—domaingenesdefinestwodistinctexpressionpatternsinalIotetrapIoidcotton(GossypiumhirsutumL.).MolGenGenet,1999.261(4-5)660-671.6.Wu,Y.,A.C.Machado,R.G.White,etal.Expressionprofilingidentifiesgenesexpressedearlyduringlintfibreinitiationincotton.PlantCellPhysiol,2006.47(1):107-127.7.Wang,S.,J.W.Wang,N.Yu,etal.ControlofplanttrichomedevelopmentbyacottonfiberMYBgene.PlantCell,2004.16(9):2323-2334.8.Taliercio,E.W.,D.Boykin.Analysisofgeneexpressionincottonfiberinitials.BMCPlantBiol，2007.7:22.9.Yang,S.,Cheung,F.,Wei,N.Ε.,etal.Accumulationofgenome-specifictranscripts,transcriptionfactorsandphytohormonalregulatorsduringearlystagesoffibercelldevelopmentinallotetraploidcotton.PlantJ,2006.47(5)761-775.10.Arpat,A.B.,M.ffaugh,J.P.Sullivan,etal.Functionalgenomicsofcellelongationindevelopingcottonfibers.PlantMolBiol,2004.54(6):911-929.11.Udall,J.A.,J.M.Swanson,K.Haller,etal.AglobalassemblyofcottonESTs.GenomeRes,2006.16(3):441-450.12.Humphries,J.A.,A.R.Walker,J.N.Timmis,etal.TwoWD-repeatgenesfromcottonarefunctionalhomologuesoftheArabidopsisthaiianaTRANSPARENTTESTAGLABRA1(TTGl)gene.PlantMolBiol,2005.57(1):67-81.13.Serna,L.andC.Martin.Trichomesdifferentregulatorynetworksleadtoconvergentstructures.TrendsPlantSci,2006.11(6):274-280权利要求1.bHLH转录因子(ihGL3，其是具有SEQIDNo:2所示氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQIDNo:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNo2所示氨基酸序列相同转录因子活性的由SEQIDNo2衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于它是具有序列表中SEQIDNo:2所示氨基酸序列的蛋白质。3.bHLH转录因子(ihGL3的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列；2)与序列表中SEQIDNo1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同转录因子功能的蛋白质的DNA序列。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述bHLH转录因子(ihGL3的编码基因是序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自5’端第1个碱基到第1884个碱基。6.含有权利要求3-4任一项所述基因的表达载体，优选植物表达载体，更优选纤维植物表达载体，最优选棉花表达载体。7.含有权利要求3-4任一项所述基因的细胞系，优选植物细胞系，更优选纤维植物细胞系，最优选棉花细胞系。8.权利要求3-4任一项所述基因在培育纤维植物新品种、优选棉花新品种中的应用。9.一种制备转基因细胞系或转基因植物的方法，所述方法包括将根据权利要求6所述的表达载体导入细胞系或植物以获得转基因细胞系或转基因植物，所述细胞系或植物优选为植物细胞系或植物、更优选纤维植物细胞系或植物、最优选棉花细胞系或植物。10.一种制备转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤1)将权利要求3-4任一项所述的基因通过RNAi方法克隆到植物转化载体中；2)将所构建的植物转化载体转化可再生植物的组织(或器官)并使所述基因在转化的组织(或器官)中表达；3)将被转化的组织(或器官)培养成植株，其中优选所述植物是纤维植物，更优选是棉花。全文摘要本发明公开了棉花的一种bHLH转录因子及其编码基因与应用。本发明提供的bHLH转录因子名称为GhGL3，是具有序列表中SEQIDNo2所示氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQIDNo2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNo2所示氨基酸序列相同转录因子活性的由SEQIDNo2衍生的蛋白质。bHLH转录因子GhGL3的编码基因GhGL3是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列；2)与序列表中SEQIDNo1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育纤维植物新品种，特别是培育棉花新品种具有重要意义。文档编号C12N15/29GK102533780SQ20101061035公开日2012年7月4日申请日期2010年12月28日优先权日2010年12月28日发明者张玉娥,普莉,李群,薛勇彪申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所