专利名称：非共价结合的白蛋白和酰化胰岛素的药物溶液的制作方法
技术领域：
本发明涉及酰化胰岛素的可注射药物溶液，其在皮下注射后不沉淀或仅以较低或较少量沉淀。
背景技术：
糖尿病是一种部分或完全丧失利用葡萄糖的能力的代谢性疾病(分别命名为糖尿病2和糖尿病I)。世界范围内约5 %的人罹患糖尿病，该疾病接近流行病比例。自从1920年代早期采用胰岛素以来，一直在努力改进糖尿病的治疗。因为罹患糖尿病的很多人几十年接受长期治疗，因此非常需要改进胰岛素制剂的安全性、方便性和寿命性质。
在糖尿病治疗中，已经提出和使用了很多不同的胰岛素制剂，例如普通胰岛素、低精蛋白锌胰岛素(定名为NPH)、胰岛素锌混悬液(例如Semilente 、Lente 和Ultralente )和双相低精蛋白锌胰岛素。一些市购胰岛素制剂的特征为快速开始作用，而其它制剂开始相对慢，但显示或多或少的延长作用。快速作用胰岛素制剂通常为胰岛素溶液，而缓慢作用的胰岛素制剂可能为混悬液，其含有通过仅加入锌盐或通过加入鱼精蛋白或通过二者组合沉淀的结晶和/或无定形形式的胰岛素。最近，亦已经将也可溶的延长作用胰岛素制剂投放市场，在所述制剂中，胰岛素可为酰化胰岛素。由于类似物设计，用对白蛋白具高亲和力的脂肪酸链酰化的一些先前发明的胰岛素和胰岛素类似物具有高疏水性或改变的Pl值(与人胰岛素的比较)。皮下注射所述酰化胰岛素可通过酰化胰岛素的盐析或寡聚体形成产生沉淀。遗憾的是，沉淀的酰化胰岛素仅部分溶解于皮下组织。其一个缺点是当注射这些胰岛素时生物利用度受限，因此，难以控制胰岛素给药。事实证明，对于糖尿病患者而言，尽可能控制血糖水平极其重要。除了控制糖尿病夕卜，血糖水平的良好控制还将降低并发症例如心血管病、腿截肢和失明的风险。在J. Histochem. Cytochem. 36 (1988), 359-65 中，研究了用牛血清白蛋白稳定的金-胰岛素复合物的受体动力学。其中未提及药物制剂。US 2，789，080中的权利要求涉及包含胰岛素和酯化动物白蛋白的水性组合物。或者，可使白蛋白酰胺化。因为该专利要求自1953年的优先权，所以涉及的胰岛素可能是猪或牛胰岛素。US 4，492，684中的权利要求I涉及包含部分交联的白蛋白和胰岛素的基质的组合物，所述交联通过使用戊二醛产生共价键来实现。US 4，963，526中的权利要求I涉及可用作胰岛素的口服剂型的组合物，所述组合物源自两相液态凝聚层组合物。根据其中的权利要求3，所述组合物可例如含有白蛋白。显然其中未提及酰化胰岛素。US 6，051，551中的权利要求I涉及治疗糖尿病的方法，所述方法包括通过吸入给予脂肪酸-酰化人胰岛素或胰岛素类似物。按照其中的第11和12栏，适合用于喷洒器或喷雾器的制剂可亦包括用于稳定脂肪酸-酰化胰岛素蛋白的作用剂，例如主体蛋白(bulkprotein)。主体蛋白包括例如白蛋白。在其中的任何工作实施例中未使用白蛋白。
WO 92/19260中的权利要求I涉及肽激素溶液，所述溶液以能够稳定激素以防止其沉淀的量含有血清白蛋白。在所述申请的唯一实验实施例中，使用未知物种的激素胰岛素。
WO 02/064115中的权利要求20涉及粉末胰岛素制剂，其通过冻干权利要求I的液体胰岛素制剂的分散体来制备，向其中加入了冷冻保护剂，例如白蛋白。其中未提及酰化胰岛素。WO 2008/013938中的权利要求I涉及包含胰岛素衍生物的可雾化制剂。在其中的第34页，提及白蛋白为可雾化制剂中很多可能的成分之一。WO 2008/034881中的权利要求I涉及新型的耐受蛋白酶的胰岛素类似物，其被开发用于优选ロ服给药途径的患者ロ服给予。其中在第31-34页阐述ロ服制剂的制备，并在第34页提及白蛋白为ロ服制剂中很多可能的成分之一。发明目的本发明目的是克服或减轻现有技术的至少ー个缺点或提供有用的备选品。本发明另一方面涉及提供可溶的水性药物制剂，其可用于治疗糖尿病，并可容易地用于控制或预防糖尿病。本发明另一方面涉及提供含有酰化胰岛素的可溶的水性药物制剂，其在皮下注射后不沉淀或仅以较低量或较少量沉淀。本发明另一方面涉及提供含有酰化胰岛素的可溶的水性药物制剂，其在皮下注射后不在注射位点与白蛋白寡聚而形成具高分子量(例如440kDa的分子量)的寡聚体，或仅以较低量或较少量寡聚。本发明另一方面涉及提供含有酰化胰岛素的可溶的水性药物制剂，所述药物制剂与具相对高含量的白蛋白的类似制剂的曲线相比具有更延长的药物曲线。本发明另ー方面涉及提供促进对延长程度调控的制剂。本发明另一方面涉及提供其中可比在不含白蛋白的相应制剂中更方便地调控延长程度的制剂。本发明另一方面涉及提供胰岛素制剂，所述胰岛素制剂比已知胰岛素制剂更易于预知延长程度。本发明另一方面涉及提供酰化胰岛素制剂，所述酰化胰岛素制剂比已知胰岛素制剂更易于预知延长(protraction)程度。定义简言之，术语酰化胰岛素涵盖天然存在的胰岛素及其类似物，其中含有酰基的部分业已与赖氨酸残基中的氨基连接。通常所述酰基来源于脂肪酸，既可以是单脂肪酸也可以是双脂肪酸，其含有至少16个碳原子，优选含有至多38个碳原子，更优选至多24个碳原子，更优选至多22个碳原子，更优选至多20个碳原子。所述含有酰基的部分亦可含有其它基团，例如亚烷基ニ醇部分。优选天然存在的胰岛素或其被酰化的类似物仅含有单个赖氨酸残基。所述赖氨酸残基可例如在赖氨酸残基在A22位的情况下与A21氨基酸连接。最近十年来阐述了很多酰化胰岛素，酰化胰岛素是本领域技术人员已知的一类胰岛素。与胰岛素或其类似物连接的酰基部分的通式为-X-C0-(CH2)n-R,其中η为介于14-24的整数，R为甲基或羧基，-(CH2)n-R为直链，X为键或接头。在一个实施方案中，术语“酰化胰岛素”涵盖WO 2009/022005和WO 2009/022013中阐述的酰化胰岛素，这二者都通过引用并入。因此，酰化胰岛素例如通过这些出版物每ー种中的权利要求I来涵盖。WO 2009/022005中的权利要求I如下“酰化胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包含与A21氨基酸残基C-末端连接的赖氨酸残基，或包含包含赖氨酸残基的多达4个氨基酸残基的肽残基，所述肽残基与A21氨基酸残基C-末端连接，其特征在于，包含亚烷基ニ醇部分的酰基部分与A22位的赖氨酸残基连接，或与在与A21氨基酸残基的C末端连接的肽残基中存在的赖氨酸残基连接，其中胰岛素类似物中仅有ー个赖氨酸(K，Lys) ”。所述酰化胰岛素的更详细的说明可在最后提及的两个PCT申请中找到，其通过引用并入。在一个实施方案中，术语“酰化胰岛素”涵盖WO 2007/096431例如在权利要求I连同权利要求3所述的酰化胰岛素。因此，在这种情况下，术语“酰化胰岛素”涵盖包含母本胰岛素及取代基的胰岛素衍生物，其中，取代基与母本胰岛素 A-链的 A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、A22、A23 或 A24 位存在的 Lys 残基的ε -氨基连接，或与母本胰岛素B-链的Β1、Β2、Β3、Β4、Β20、Β21或Β22位的Lys残基的ε -氨基连接，其中取代基包含具有6-40个碳原子的酰基，优选，取代基具有通式CH3- (CH2)n-C0-，其中η为介于4-38的整数，其中术语“母本胰岛素”为在A-链和/或B-链中仅含有ー个Lys残基的胰岛素类似物。所述酰化胰岛素的更详细说明可在最后提及的PCT申请中找到，其通过引用并入。在另ー实施方案中，术语“酰化胰岛素”涵盖在ΕΡ1，991，576Β I中特别是在其权利要求I中所述的酰化胰岛素，所述酰化胰岛素的更详细说明可在最后提及的EP专利中找到，其通过引用并入。本文术语“天然存在的胰岛素的类似物”和“胰岛素类似物”涵盖以下人胰岛素其中人胰岛素的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代，和/或其中ー个或多个氨基酸残基可自胰岛素缺失，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加和/或被插入到胰岛素中。本发明涉及的氨基酸优选为可由核苷酸三联体("密码子")编码的氨基酸，请參阅genetic engineering (遗传工程)。本文氨基酸通过其常用三个字母代码给出，优选为Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser和Thr。在一个实施方案中，胰岛素类似物相对于母本胰岛素包含不到8处修饰(取代、缺失、添加(包括插入)及其任意组合)，或者相对于母本胰岛素不到7处修饰，或者相对于母本胰岛素不到6处修饰，或者相对于母本胰岛素不到5处修饰，或者相对于母本胰岛素不到4处修饰，或者相对于母本胰岛素不到3处修饰，或者相对于母本胰岛素不到2处修饰。本文使用以下縮写“0EG”为8-氨基-3,6- ニ氧杂辛酸;“gGlu，，(或“ yGIu”或“ Y-Glu”)为Y-谷氨酸和“ HSA”为人血清白蛋白。“Milli-Q”指通过MilliporeCorporation生产的水纯化系统高度纯化和去离子化的水。该系统通过测量水的电阻率来监测离子浓度。大部分Milli-Q系统通过O. 22 μ m的膜过滤器来分发水。本文术语胰岛素ニ聚体常数(insulin dimeric constant)用于其中超过90%胰岛素呈ニ聚体形式的胰岛素浓度。低于该浓度増加呈单体形式的胰岛素。发明简述业已发现本发明阐述的某些酰化胰岛素在皮下注射具低离子强度(例如低于50mM NaCl)的可溶制剂后，沉淀于皮下组织。沉淀很可能是由皮下组织中离子强度増加到150mM NaCl引起，并与低生物利用度有夫。出人意料地发现，将白蛋白例如血清白蛋白加入到胰岛素制剂(在给予前)中，可防止本发明酰化胰岛素制剂在皮下注射后沉淀。本发明获得的出人意料的作用的原因，可能是意欲给患者注射的溶液中的白蛋白和酰化胰岛素酰基链的相互作用防止酰化胰岛素沉淀，并在进行注射后恢复酰化胰岛素的生物利用度(但本发明对于观察到的本发明作用不限于该原因)。此外，业已发现可利用制剂中白蛋白对酰化胰岛素的化学计量来控制制剂中胰岛素-白蛋白复合物的聚集状态，因此在皮下注射后控制延长程度。在一个实施方案中，本发明讨论了酰化胰岛素以至少ImM的结合常数与白蛋白相互作用，然后在皮下注射后沉淀或聚集。酰化胰岛素包括例如在A22K氨基酸中酰化的胰岛素(A22K酰化胰岛素)，其如本文所述。发明详述简言之，本发明涉及含有白蛋白和盐析酰化胰岛素的制剂，其中白蛋白不与盐析酰化胰岛素共价结合。可将盐析酰化胰岛素分为酰化胰岛素的三个亚组。在每6个胰岛素 分子中含有3个锌离子的150mM NaCl溶液中具有低溶解性即溶解性低于30%的酰化胰岛素(其如以下测试A中具体确定)，为盐析酰化胰岛素。此外，形成分子量高于440，000的胰岛素-白蛋白-寡聚体的酰化胰岛素(其如以下测试B中具体确定)亦为盐析酰化胰岛素。此外，在不含锌的150mM NaCl溶液中具有低溶解性即溶解性低于50%的酰化胰岛素(其如以下测试C中具体确定)，亦为盐析酰化胰岛素。业已发现对于某些酰化胰岛素，尤其是如本文定义的在含或不含锌离子的150mMNaCl溶液中具有低溶解性的酰化胰岛素，很难在皮下给予后满意地预测患者的血糖曲线。已知在日夜期间血糖曲线变化不是非常大是极为重要的，否则可产生晚期糖尿病并发症，例如失明、腿截肢和其它严重疾病。现在出人意料地发现，若所述酰化胰岛素制剂含有白蛋白，则预测患者的血糖水平更加容易。同样，业已发现对于某些其它酰化胰岛素，尤其是如本文定义的与白蛋白形成具高于440，000的分子量的寡聚体的酰化胰岛素，亦很难在皮下给予后满意地预测患者的血糖曲线。现在出人意料地发现，若所述酰化胰岛素制剂含有白蛋白，则预测患者的血糖水平更加容易。本发明新型制剂为含有白蛋白和盐析酰化胰岛素的水性药物溶液，其中在通过注射将制剂给予患者后白蛋白不与盐析酰化胰岛素共价结合。若将不含有白蛋白的本文所定义的酰化胰岛素制剂注射给患者，则可发生酰化胰岛素沉淀，该沉淀可能是由于组织液的离子强度联合胰岛素(例如胰岛素六聚体)表面上存在酰基链而产生。出人意外的是，当给患者注射含有白蛋白的酰化胰岛素制剂时可避免该反应。以下是假定发生的相互作用的解释。然而，本发明不限于完全如下所概述而发生的相互作用。本发明药物制剂含有酰化胰岛素和白蛋白。此外，本发明制剂可含有以下组分缓冲液、防腐剂、等渗剂、乙酸锌和/或物理和/或化学稳定剂。白蛋白具有多达7个不同的脂质结合位点，其视脂质的大小和结构而定。酰化胰岛素可经由酰基链与一个或多个白蛋白脂质结合位点与白蛋白结合。本发明出人意外地发现，含白蛋白的共制剂可导致酰化胰岛素的酰基链稳定，藉此防止或降低不想要的反应，如酰化胰岛素的沉淀和聚集。
在为患者注射不含有白蛋白的酰化胰岛素制剂后，酰化胰岛素可因制剂中的离子強度或皮下组织中的离子强度而沉淀和/或聚集。皮下组织中的离子强度为约150mM氯化钠，其确定了等渗溶液的浓度。皮下组织中酰化胰岛素的沉淀可导致酰化胰岛素的作用时间的可预见性降低，并降低酰化胰岛素的生物利用度。一个技术难题和制药的艰巨工作，是配制具可预见的生物利用度和作用时间并导致糖尿病患者可重复性地产生降低血糖的曲线的酰化胰岛素药物制剂。此外，被设计为在高离子强度中含有可溶的酰化胰岛素的药物制剂，可能由于制剂中酰化胰岛素的物理沉淀而具有有限的保存期限。第二个技术难题是以高离子強度制备含有酰化胰岛素的物理上稳定的药物制剂。这两个问题的技术解决方法是制剂中存在的白蛋白防止酰化胰岛素在注射后沉淀，这很可能是由于例如通过注射増加了皮下组织中的离子强度。 通过将白蛋白以化学计量量加入到制剂中来避免150mM氯化钠中酰化胰岛素的沉淀，化学计量量介于每摩尔白蛋白约I-约10摩尔酰化胰岛素，优选介于每摩尔白蛋白约
I-约6摩尔酰化胰岛素。胰岛素ニ聚体形成常数是呈微摩尔浓度范围的人胰岛素。具与人胰岛素相同的范围内的ニ聚体形成常数的酰化胰岛素形成ニ聚体，酰化胰岛素的酰基链与以两摩尔酰化胰岛素对两摩尔白蛋白复合物比率的白蛋白分子相互作用。当锌原子存在于制剂中时，可形成酰化胰岛素锌六聚体，这些六聚体的酰基链可与胰岛素六聚体-白蛋白复合物形式中的不同白蛋白分子相互作用。因此，具白蛋白和酰化胰岛素锌六聚体的制剂的药物曲线将视白蛋白和酰化胰岛素之间的化学计量比率和获得的含白蛋白分子的酰化胰岛素六聚体的寡聚体的存在情况而定。制剂中酰化胰岛素的化学和物理稳定性，可在很大程度上视R6六聚体的形成而定。因此，期需每摩尔酰化胰岛素中存在至少两个锌离子、至少两个氯离子和至少六个苯酚或甲酚分子。因此，所述制剂将含有过量的こ酸锌、氯化钠、苯酚和甲酚。因为白蛋白可结合锌，所以含白蛋白的化学稳定制剂优选每6个酰化胰岛素分子含有约3-约7个锌离子，这可确保酰化胰岛素R6六聚体的形成和锌白蛋白相互作用。白蛋白的化学稳定性受到白蛋白共价ニ聚体形成的限制。例如，加入稳定剂例如癸酸钠和/或去污剂例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，降低白蛋白ニ聚体形成。因此，联合酰化胰岛素/白蛋白的制剂除锌、苯酚、甲酚和氯化钠外，还可含有癸酸钠和聚山梨醇酷。此外，出人意料地发现，若将烟酰胺加入到制剂中，可改善本发明制剂的性质。在一个实施方案中，本发明制剂含有约20mM-约200mM烟酰胺，任选与约5mM_约50mM精氨酸组合，优选约40mM-约150mM烟酰胺任选与约IOmM-约30mM精氨酸组合。尽管本发明涉及本文定义的含有白蛋白和酰化胰岛素的制剂，其中白蛋白和所述酰化胰岛素之间没有共价键，但所述制剂在特定实施方案中可含有与白蛋白共价结合的酰化胰岛素。在这样的实施方案中，酰化胰岛素的氨基酸序列可与白蛋白共价结合的胰岛素的氨基酸序列相同或不同。在本发明优选实施方案中，本发明制剂中没有沉淀物质。然而，含有呈溶解形式的胰岛素和呈非溶解(沉淀的)形式的胰岛素二者的胰岛素制剂一直在市场上存在几十年，其为本领域技术人员所知。因此，在本发明ー个实施方案中，制剂含有溶解的胰岛素和非溶解的胰岛素二者。
制剂可如下制备将酰化胰岛素粉溶解在pH 7. 4的Milli-Q水中。可按所列次序或任何其它期需或方便的次序加入磷酸盐缓冲液、乙酸锌、氯化钠、苯酚、甲酚、甘油和白蛋白，以产生为制剂设计的最终浓度。延长程度在某种程度上视酰化胰岛素和白蛋白之间的摩尔比率而定。通常相对较大量的胰岛素将产生更长时间的吸收率，即更长作用时间，这可能是由于胰岛素-白蛋白聚集物的大小更大。在本发明实施方案中，涉及含有由胰岛素溶解性限定的量的酰化胰岛素类似物和白蛋白的药物制剂，意即其量不产生沉淀或仅沉淀到较小或较低程度，其中胰岛素不与白蛋白共价结合。在本发明另一实施方案中，涉及含有由药物延长曲线限定的化学计量量的酰化胰岛素类似物和白蛋白的药物制剂，意即其量视所需药物延长曲线而定，其中胰岛素不与白 蛋白共价结合或仅以少量结合。如前所述，本发明新型制剂还含有白蛋白。白蛋白可为任何物种的白蛋白，例如人白蛋白或desl (Asp)人白蛋白，例如albagen。优选白蛋白为重组来源。在本发明制剂中，白蛋白不与其它化学分子共价结合，或白蛋白仅以约5% (重量/重量)或更少的量与所述其它分子结合，优选小于2%，更优选小于1%。在一个实施方案中，白蛋白不与酰化胰岛素共价结合，或仅以约5% (重量/重量)或更少的量与酰化胰岛素结合，优选小于2 %，更优选小于I %。在一个实施方案中，酰化胰岛素为在胰岛素及其类似物的A-链的C-末端氨基酸延伸中存在的赖氨酸侧链中的e -氨基酰化的胰岛素，其如WO 2009/022005或WO2009/022013中所公开。在另一实施方案中，酰化胰岛素选自以下
名称备选名称
A22K(A匕十六烷二酰基-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧 基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰基-丫Glu)，B29R， desB30人胰岛素
十六烷二酰基-(2-氨基乙基-PEG2000- 基乙晚基))，B29RdesB30人胰岛素
八2210^-3-(3-{4-[3-(5-羧基戊酰基氨基)丙氧 基]丁氧基}丙基氨基曱酰基)丙酰基-丫Glu)，
B29R，desB30人胰岛素
权利要求
1.一种用于通过注射使用的药物制剂，其含有酰化胰岛素和白蛋白，其中至少80 %(重量/重量)的所述酰化胰岛素溶解，其中至多5% (重量/重量)的所述胰岛素与白蛋白共价结合。
2.一种可注射药物制剂，其含有酰化胰岛素和白蛋白，其特征在于至少80% (重量/重量)的所述酰化胰岛素溶解，其中至多5% (重量/重量)的所述胰岛素与白蛋白共价结合。
3.一种用于通过注射使用的药物制剂，其含有酰化胰岛素和白蛋白，其中全部所述酰化胰岛素溶解，其中在所述酰化胰岛素和白蛋白之间没有共价键。
4.前述权利要求中任一项的任选可注射的药物制剂，其中所述酰化胰岛素为盐析酰化胰岛素。
5.前述权利要求中任一项的任选可注射的药物制剂，其中所述盐析酰化胰岛素为在150mM NaCl溶液中具有低于30%溶解性的酰化胰岛素，如本文测试A中具体确定。
6.前述权利要求中任一项的任选可注射的药物制剂，其中所述盐析酰化胰岛素为形成具高于440，000的分子量的胰岛素-白蛋白-寡聚体的酰化胰岛素，如本文测试B中具体确定。
7.本文所述的新产品，其例如以上条款中任一种的产品。
8.本文所述的新方法，其例如以上条款中任一种的方法。
9.本文所述的新用途，其例如以上条款中任一种的用途。
10.本文所述的新治疗，其例如以上条款中任一种的治疗。
11.以上实施例中任一实施例例如实施例I中所述的产品。
12.以上实施例中任一实施例例如实施例I中所述的方法。
13.本文所述的任何新特征或特征组合。
全文摘要
若将白蛋白加到WO 2009/022005和WO 2009/022013所述的含有酰化胰岛素的药物制剂中，则酰化胰岛素在皮下注射后可保持在溶液中。
文档编号C12N15/17GK102665676SQ201080050520
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月1日 优先权日2009年11月2日
发明者H·纳弗, P·马德森, S·哈夫伦 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司