专利名称：具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码SGTl多肽，或CLC-pKG多肽，或HD水解酶样多肽的核酸在植物中的表达而增强植物的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码SGTl多肽，或CLC-pKG多肽，或HD水解酶样多肽的核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明的方法的构建体。持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改进手段利用选择育种技术来鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，这可能不总是导致从亲代植物中传递所希望的性状。分子生物学进展已经允许人类改进动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物 中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改进性状的作物或植物的能力。具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为作物产生的可测量的经济价值。这可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。因此，优化前述因素可以对增加作物产量有贡献。种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的苗和根的来源)和胚乳(萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈籽粒。对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻栽培品种上的一个重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固着是重要的。在将稻直接播种至涝田的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好的出苗是重要的。人工改造植物内早期萌发势的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带生殖质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayesL.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。另一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50% (Wang等、(2003) Planta218:1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性、氧化胁迫引起。改进植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民具有极大的经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。取决于最终用途，对某些产量性状的改进可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是期望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
增加植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过修饰植物的内在生长机制，如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号途径。目前发现，可以通过调节植物中编码SGTl多肽，或CLC-pKG多肽，或HD水解酶样多肽的核酸在植物中的表达而改进植物的多种产量相关性状。
背景技术：
I. SGTl 多肽已知SGTl是skpl突变体的抑制等位基因。Chung等人，2006报导，SGTl在发育过程中起关键作用。SGTl具有蛋白质功能所必需的独特结构域三角形四肽(tetratricopeptide)重复结构域(TPR)、CH0RD和SGTl基序(CS)和SGTl-特异性基序(SGS基序)。已知TPR结构域介导功能为分子伴侣、细胞周期、转录或蛋白质转运复合物的多重复合蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。例如，据显示SGTl的TPR结构域结合热休克蛋白70(HSP70)。然而，SGTl的CS结构域与人p23蛋白中的CS结构域类似，已知后者与HSP90相互作用并参与不同调节蛋白的折叠。2. CLC-pKG 多肽在原核和真核生物二者中，阴离子通道/转运体在代谢控制、电化学梯度的维持和导致对非生物和生物环境胁迫的适应的信号转导途径中作为关键参与者出现。在植物中，其参与多种生理功能，例如控制叶中调节气体交换的气孔运动，植物-病原体相互作用，根木质部装载，代谢物的区室化和与质子梯度偶联(在De Angeli等人2007 Phil.Trans. R. Soc. B 2009364, 195-201中综述)。主要使用电生理学技术表征阴离子通道活性和相关的调节机制。在包括质膜、液泡膜、内质网、线粒体和叶绿体的所有植物膜中报导了阴离子通道，相比位于其他膜上的通道，质膜通道是迄今为止表征最完善的。在模式植物例如稻和拟南芥中存在多达7种编码CLC的基因，其分布在2个截然不同的亚科中(Marmagne等人 2007，Journal of Experimental Botany, Vol. 58, No. 12, pp. 3385 3393)。这些亚科之一包含AtCLCe和AtCLCf蛋白，接近原核CLC,共同属于氯离子通道原核组,而另一类与真核CLC更接近。据报导，拟南芥AtCLCf蛋白与集胞藻属CLC的那些CLC具有类似的亚细胞分布和可能的类似功能，认为其代表了植物叶绿体的祖先前体。硝酸盐和苹果酸盐代表了植物细胞中的大部分阴离子。硝酸盐是一种营养素，但也可作为信号转导分子。植物具有复杂的包括低和高亲和力转运体的硝酸盐摄取系统，接着硝酸盐或者通过木质部被转运进入细胞代谢，或被局部储存。细胞通过硝酸盐还原酶途径同化硝酸盐或将其储存在液泡膜中，在细胞质和液泡的硝酸盐水平之间存在动态平衡，此平衡通过胞外硝酸盐的摄取、液泡中的储存和合成代谢调节。氯离子通道(CLC)家族的发现允许阐明质子/硝酸盐在液泡膜和细胞质之间的交换机制。亚细胞定位的测定、表达模式和敲除突变体表型的表征揭示了 CLC蛋白的生理作用。表型分析显示，clca-1和clca-2突变体植物相比野生型在根和幼苗组织中具有减少的硝酸盐。Clcc和clce突变体相比对照植物也显示了降低的硝酸盐水平。De Angeli等人，Phil. Trans. R. Soc. B364，195-201,2009;和其中引用的参考文献提供了相关领域的综述。然而，有关CLC蛋白的精确作用和过表达CLC基因对植物表型的影响仍所知甚少。3. HD水解酶样多肽HD结构域包含以下序列2个小氨基酸，接着是2个疏水氨基酸，I个组氨酸和I个天冬氨酸，又一个疏水氨基酸，I个小氨基酸和I个带电荷的氨基酸。因 为其低序列保守性，其最近才被发现(Aravind和Koonin, Trends in BiochemicalSciences, 23:469-472, 1998)。据报导，此结构域在包括核酸聚合酶和解旋酶的金属依赖性磷酸水解酶中存在(Aravind和Koonin, 1998)。尽管推测包含HD结构域的蛋白质展示磷酸水解酶活性和似乎参与核酸代谢或信号转导(Galperin等人，J. Mol. MicrobiolBiotechnol. I, 303-305, 1999)，HD结构域的精确的生物学作用仍有待阐明。概述I. SGTl 多肽意想不到的是，目前已经发现，相对于对照植物而言，调节编码SGTl多肽的核酸的表达可以产生具有增强的产量相关性状，特别是增强的种子产量的植物。根据本发明的一个实施方案，提供了用于改善相对于对照植物而言的植物产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码SGTl多肽的核酸的表达。2. CLC-pKG 多肽意想不到的是，目前已经发现，相对于对照植物而言，调节编码CLC-pKG多肽的核酸的表达可以产生具有增强的产量相关性状的植物。根据一个实施方案，提供了用于增强或改善相对于对照植物而言的植物产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码CLC-pKG多肽的核酸的表达。3. HD水解酶样多肽意想不到的是，目前已经发现，相对于对照植物而言，调节编码HD水解酶样多肽的核酸的表达可以产生具有增强的产量相关性状，特别是增强的产量的植物。根据一个实施方案，提供了用于改善相对于对照植物而言的植物产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码HD水解酶样多肽的核酸的表达。定义在本说明书通篇中将使用以下定义。多肽/蛋白质术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指通过肽键连接在一起的处于任意长度的氨基酸聚合形式。多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指任意长度的核苷酸聚合无分支形式，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与其所源自的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合小，约1-10个残基的级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag 100表位、c-myc表位、FLAG ~表位、lacZ、CMP (韩调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
替换指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结构或折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的(可以是1-10个氨基酸的范围)，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域众所周知的(见例如Creighton (1984) Proteins, ff. H. Freeman和Company (编著)和下表I)。表I :保守性氨基酸替换的例子
i保守性替换^残j保守性替换^
_____
Ala_Ser_LeuHe; Val Arg_Lys__LysArg; Gln_ Asn Gin; His MetLeu; IleAsp GluPheMet; Leu; Tyr
GlnAsnSerThr; Gly_ Cys_Ser__ThrSer; Val_
Glu AspTrpTyr Gly Pro Tyr Trp; Phe ...His.............................................[Asη;—Gln...........................................Val He; Leu氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生替换突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括Μ13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand, OH)、QuickChange 位点定向诱变法(Stratagene, San Diego, CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变法。衍牛物“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的经改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蘧酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然的经改变的氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然发生形式蛋白质与标签肽(如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白) 的融合物(标签肽的综述参阅 Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60，523-533，2003)。肓向同源物/旁系同源物直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也来源于共同的先祖基因。结构域，基序/共有序列/特征序列术语“结构域”指依据进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其它位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。术语“基序”或“共有序列”或“特征序列”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。存在用于鉴定结构域的专门数据库，例如SMART (Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 95，5857-5864;Letunic 等(2002)NucIeic AcidsRes 30, 242-244), InterPro (Mulder 等,(2003)Nucl. Acids. Res.31,315-318),Prosite(Bucher 和 Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecularsequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In)ISMB-94;Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology. Altman R. , Brutlag D. , Karp P. , Lathrop R. , Searls D.编著，第 53-61 页,AAAI Press, Menlo Park;Hulo 等，Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)或者 Pfam(Bateman 等,Nucleic Acids Research30(I):276-280 (2002))。用于计算机分析蛋白质序列的一组工具可获得自ExPASy蛋白组服务器(Swiss Institute ofBioinformatics(Gasteiger 等，ExPASy:the proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788 (2003))。还可以使用常规技术(如序列比对)来鉴定结构域或基序。比对序列以进行比较的方法为本领域所熟知，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。GAP 利用 Needleman 和 Wunsch ((I97O) J Mol Biol 48:443-453)的算法来寻找两序列间使匹配数最高并使空位数最少的全局比对(即在完整序列上)。BLAST算法(Altschul等(1990) J MolBiol 215:403-10)在两序列间计算百分比序列同一性并进行相似性的统计学分析。用于进行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(NationalCentre for Biotechnology Information(NCBI))向公众提供。可以使用例如默认配对比对参数的ClustalW多重序列比对算法(I. 83版)和百分比评分法来容易地鉴定同源物。也可以使用 MatGAT 软件包(Campanella 等，BMC Bioinformatics. 2003Jul 10;4:29.MatGAT:an application that generates similarity/identity matrices using proteinor DNA sequence)中提供的一种方法确定全局的相似性和同一'丨生百分比。本领域技术人员会意识到，可以进行少量手动编辑以优化保守性基序之间的比对。此外，还可以使用特定的结构域代替全长序列来鉴定同源物。序列同一性值可以是使用默认参数的上述程序在完整的核酸或氨基酸序列上或在所选择的结构域或保守的基序上测定的。对于局部比对，Smith-Waterman 算法是特别有用的(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol.Bioll47(l);195-7)。交互BLAST通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例章节表A中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX (利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN (利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST (二次BLAST)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则找到了旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则找到了直向同源物。高排名的命中是那些E值低的命中。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了 E值之外，还对比较进行同一性百分比评分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直向同源物和旁系同源物。杂交如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其它树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称 作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。术语“严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及PH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30°C。中等严格性条件是此时温度低于Tm约201，高严格性条件是此时温度低于Tm约10°C。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分子。Tni是在确定的离子强度及pH下50%的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16°C直至32°C获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达O. 4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低O. 6至O. 7°C，并且添加50%甲酰胺允许在30至45°C进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1°C。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算1)DNA-DNA 杂交分子(Meinkoth 和 Wahl，Anal. Biochem.，138:267-284，1984):Tm = 81. 5°C +16. 6xlog10[Na+] a+0. 41x%[G/Cb] - 500x[Lc]_1 - 0. 61x% 甲酰胺2) DNA-RNA 或 RNA-RNA 杂交分子Tm = 79. 8°C +18. 5(log10[Na+]a) +0. 58 (%G/Cb) +11.8 (%G/Cb) 2-820/Lc3)寡DNA或寡RNAd杂交分子对于〈20个核苷酸Tm = 2 (In)对于2035 个核苷酸! = 22+1. 46 (In)3或对于其它一价阳离子，但是仅在O. 01 O. 4M范围内是精确的。b仅对于％GC在30%至75%范围内是精确的。cL=双链体的长度(以碱基对计)。doligo，寡核苷酸山，=引物的有效长度=2 X (G/C数)+ (A/T数)。可以众多已知技术的任何一种来控制非特异性结合，如例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行(i)逐渐降低退火温度(例如从68°C至42°C )或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50%至0%)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65°C于IXSSC中或在42°C于IXSSC和50%甲酰胺中杂交，随后在65°C于O. 3XSSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的例子包括在50°C、于4X SSC中或在40°C于6X SSC和50%甲酰胺中杂交，随后在50°C于2X SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。I X SSC是O. 15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5XDenhardt试剂、O. 5-1. 0%SDS、100 μ g/ml变性的片段化鲑精DNA、0. 5%焦磷酸钠。为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning alaboratory manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New York 或参考 Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989 和每年更新版本)。剪接变体如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex, (2005)BMC Bioinformatics. 6 25)。等位夺体等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于lOObp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。内源基因本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)引入植物的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可从生物体分离，或可人工制造(例如通过化学合成)。基因改组/定向讲化基因改组或定向进化的组成为反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改进生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004) Science304(5674) : 1151-4 ;美国专利 5，811，238 和 6，395，547)。构津体其它调节元件可包括转录及翻译增强子。本领域技术人员会了解适于在实施本发明中使用的终止子和增强子序列。如在定义部分所述，也可将内含子序列添加至5’非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量。其它控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以容易地获得此类序列。本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制需要的复制原点序列。一个例子是当需要将遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(例如质粒 或粘粒分子)维持时。优选的复制原点包括但不限于Π-ori和colEl。为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，使用标记基因(或报告基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分中有更详细的描述。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于标记基因去除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文“定义”部分中描述。调节元件/控制序列/启动子术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用，并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。 本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35盒序列和/或10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不一定是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3’调节区(如终止子)或远离ORF的其它3’调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更具活性的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。为了鉴定功能等价启动子，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式，例如通过将该启动子与报告基因有效连接并测定该报告基因在多种植物组织中的表达水平和模式。合适的公知报告基因包括例如β -葡糖醛酸糖苷酶或β -半乳糖苷酶。通过测量β -葡糖醛酸糖苷酶或β -半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子活性。接着可以将启动子强度和/或表达模式与参考启动子(如用于本发明方法中的)进行比较。或者，可以通过定量mRNA水平或者将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平进行比较来测定启动子强度，其中使用本领域熟知的技术，如通过放射自显影的光密度测定分析进行的Northern印迹、定量实时PCR或RT - PCR (Heid等，1996GenomeMethods 6:986 - 994)。通常，“弱启动子”指驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”指每个细胞中约1/10，000的转录物至约1/100，000的转录物至约1/500，0000的转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞中约1/10的转录物至约1/100的转录物至约1/1000的转录物的水平。通常，“中等强度启动子”指此类启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平表达，特别是在所有情况下以低于35S CaMV启动子控制时获得的水平表达。有效连接
如本文中所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。组成型启动子“组成型启动子”指在至少一种细胞、组织或器官中在其大多数(但不一定是全部)生长和发育阶段并在大多数环境条件下有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型启动子的例子。表2a:组成型启动子的例子
权利要求
1.用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，包括调节编码SGTl多肽的核酸在植物中的表达，其中所述SGTl多肽以任意顺序包含以下 (i)至少一个三角形四肽(TPR)重复； (ii)至少一个CS结构域；和 (iii)SGS结构域。
2.权利要求I的方法，其中所述受调控的表达通过在植物中引入和表达SGTl多肽的编码核酸而实现。
3.权利要求I或2的方法，其中所述SGTl多肽的编码核酸编码表Al中列举的任一蛋白质，或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
4.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表Al给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
5.任意前述权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的种子产量。
6.权利要求1-5的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
7.权利要求2-6的任一项的方法，其中所述核酸与根特异性启动子，优选RCc3启动子，最优选来自稻的RCc3启动子有效连接。
8.权利要求1-7的任一项的方法，其中所述SGTl多肽的编码核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物甜辣椒，进一步优选来自茄科，更优选来自辣椒属，最优选来自甜辣椒。
9.通过权利要求1-8的任一项方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码SGTl多肽的重组核酸。
10.构建体，包含 (i)编码如权利要求I定义的SGTl多肽的核酸； ( )能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的 (iii)转录终止序列。
11.权利要求10的构建体，其中所述控制序列之一是根特异性启动子，优选RCc3启动子，最优选来自稻的RCc3启动子。
12.权利要求10或11的构建体在用于制备植物的方法中的用途，其中所述植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的种子产量。
13.用权利要求10或11的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
14.用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的种子产量的转基因植物的方法，包括 (i)在植物中引入和表达如权利要求I定义的SGTl多肽的编码核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
15.相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的种子产量的转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，通过如权利要求I定义的SGTl多肽的编码核酸受调控的表达获得。
16.权利要求9、13或15的转基因植物，或源自它的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦、德国小麦、黑麦属、一粒系小麦、teff、高粱和燕麦。
17.权利要求16的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
18.来自权利要求16的植物和/或权利要求17的植物的可收获部分的产品。
19.SGTl多肽的编码核酸在相对于对照植物增加产量，特别是增加种子产量中的用途。
20.SGTl多肽的编码核酸在具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物中作为分子标记物的用途。
21.用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，包括调节编码CLC-pKG多肽的核酸在植物中的表达，其中所述CLC-pKG多肽包含Vol tage_CLC结构域(Pfam条目PF00654)和CBS结构域(Pfam条目PF00571)和任选地USP结构域(PF00582)。
22.权利要求21的方法，其中所述CLC-pKG多肽包含以递增的优先顺序与以下结构域具有至少 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%序列同一性的结构域 (i)SEQID NO:54中的CLC，以位于SEQ ID NO:54的氨基酸77和422之间的序列代表; (ii)SEQID NO: 54中的CBS结构域，以位于SEQ ID NO: 54的氨基酸455至510或516至571之间的序列代表；和任选地 (iii)SEQID NO:54中的USP结构域，以位于SEQ ID NO:54的氨基酸597-731之间的序列代表。
23.权利要求21或22的方法，其中所述受调控的表达通过在植物中引入和表达包含CLC-pKG多肽的编码核酸的遗传构建体而实现。
24.权利要求21-23的任一项的方法，其中所述编码CLC-pKG多肽的核酸编码表A2中列举的任一蛋白质，或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
25.权利要求21-24的任一项的方法，其中所述核酸编码表A2给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
26.权利要求21-25的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选增加的生物量和/或增加的种子产量。
27.权利要求21-26的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下或在干旱胁迫或盐胁迫条件下获得的。
28.权利要求23-27的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选地与RCc3启动子，最优选地与来自稻的RCc3启动子有效连接。
29.权利要求21-28的任一项的方法，其中所述CLC-pKG多肽的编码核酸是蓝细菌来源的，进一步优选来自集胞藻属物种，更优选来自集胞藻属物种PCC 6803。
30.通过权利要求21-29的任一项方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码CLC-pKG多肽的重组核酸。
31.构建体，包含(i)编码如权利要求21或22定义的CLC-pKG多肽的核酸； (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的 (iii)转录终止序列。
32.权利要求31的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选RCc3启动子，最优选来自稻的RCc3启动子。
33.权利要求31或32的构建体在用于制造相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物的方法中的用途。
34.用权利要求31或32的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
35.用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括 (i)在植物中引入和表达如权利要求21或22定义的CLC-pKG多肽的编码核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
36.相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，通过如权利要求21或22定义的CLC-pKG多肽之重组编码核酸受调控的表达获得。
37.权利要求30、34或36的转基因植物，或源自它的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦、德国小麦、黑麦属、一粒系小麦、teff、高粱和燕麦。
38.权利要求37的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
39.来自权利要求37的植物和/或权利要求38的植物的可收获部分的产品。
40.包含CLC-pKG多肽的编码核酸的遗传构建体相对于对照植物在植物中增加产量，特别是增加种子产量和/或苗生物量中的用途。
41.用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，包括调节编码HD水解酶样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述HD水解酶样多肽包含CRISPR相关蛋白Crm2结构域。
42.权利要求41的方法，其中所述HD水解酶样多肽包含基序11-26中的一种或多种。
43.权利要求41或42的方法，其中所述受调控的表达通过在植物中引入和表达HD水解酶样多肽的编码核酸而实现。
44.权利要求41-43的任一项的方法，其中所述编码HD水解酶样多肽的核酸编码表A3中列举的任一蛋白质，或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
45.权利要求41-44的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A3给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
46.权利要求41-45的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选增加的生物量和/或增加的种子产量。
47.权利要求41-46的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
48.权利要求43-47的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选地与GOS2启动子，最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。
49.权利要求41-48的任一项的方法，其中所述HD水解酶样多肽的编码核酸是植物来源的，优选来自蓝藻植物，进一步优选来自色球藻科，更优选来自集胞藻属。
50.通过权利要求41-49的任一项方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码HD水解酶样多肽的重组核酸。
51.构建体，包含 (i)编码如权利要求41或42定义的HD水解酶样多肽的核酸； (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的 (iii)转录终止序列。
52.权利要求51的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
53.权利要求51或52的构建体在用于制造相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物的方法中的用途。
54.用权利要求51或52的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
55.用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括 (i)在植物中引入和表达如权利要求41或42定义的HD水解酶样多肽的编码核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
56.相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，通过如权利要求41或42定义的HD水解酶样多肽的编码核酸受调控的表达获得。
57.权利要求50、54或56的转基因植物，或源自它的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦、德国小麦、黑麦属、一粒系小麦、teff、高粱和燕麦。
58.权利要求57的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
59.来自权利要求57的植物和/或权利要求58的植物的可收获部分的产品。
60.HD水解酶样多肽的编码核酸相对于对照植物在植物中增加产量，特别是增加种子产量和/或苗生物量中的用途。
全文摘要
本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码SGT1多肽，多CLC-pKG多肽，或HD水解酶样多肽的核酸在植物中的表达而增强植物的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码SGT1多肽，多CLC-pKG多肽，或HD水解酶样多肽的核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明的方法的构建体。
文档编号C12N15/82GK102648282SQ201080053311
公开日2012年8月22日 申请日期2010年9月24日 优先权日2009年9月25日
发明者C·勒佐, D·崔, J-Y·宋, Y-Ii·帕克, 崔良夀 申请人:巴斯夫植物科学有限公司, 植物功能基因组中心