用于诊断乳癌侵袭性和遗传不稳定性的标记的制作方法

专利名称：用于诊断乳癌侵袭性和遗传不稳定性的标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及乳癌控制的领域，包括所述乳癌的侵袭性和遗传不稳定性的诊断，以及适当的治疗的选择。本发明是在POLQ的过度表达与乳房肿瘤的侵袭性、以及因此的患者的生存高度相关这一发现的基础上的。同样其过度表达还与遗传不稳定性相关，其然后可被用于杀伤肿瘤细胞。例如，辐射疗法对已经受损的DNA更有效。同样地，DNA修复抑制因子可以防止DNA断裂的修复，从而导致肿瘤细胞死亡。
背景技术：
乳癌是女性中最常见的恶性肿瘤，是影响女性的所有癌症中具有最高致死率的一种。大多数乳癌表现为生长缓慢，无痛性团块。有一些可能表明乳癌存在的体征，其可通过乳房检查被发现。乳癌通过直接扩散、以及通过淋巴和血流转移。目前有一些方法被用于治疗乳癌，包括手术、辐射疗法、激素疗法和化学疗法。成功的癌疗法涉及原发肿瘤以及任何转移瘤，无论是临床上显著的或是显微的。因为乳房肿瘤可用综合疗法(combined modality therapy)治愈,可以单独使用上述方法的一个,或使与其一种或更多种其它疗法组合。对于患者，选择合适的治疗是重要的。有必要知道为了防止侵袭性乳癌的扩散，什么时候立刻使用剧烈的积极治疗(aggressive treatment)操作。否则，患者的生存可能被严重受损尽管存在许多用于检测、诊断和治疗乳癌的技术，该疾病仍是女性最常见的癌症，是最致命的疾病之一(Jemal等人，Cancer Statistics59:225-249，2009)。相反地，当患者所患的肿瘤没有必要的时候而进行剧烈的积极治疗，对于患者也是不利的。事实上，剧烈的积极治疗常常导致不利的毒性，可能严重影响患者的生活质量。另外，这种剧烈的积极治疗通常是非常昂贵的，因而仅应当在必要的时候进行。目前，治疗的选择根据肿瘤的阶段，其通常使用来自美国癌症联合委员会(AJCC)的肿瘤/结/转移(TW)测试进行。TW系统根据三种类型分配一个数字。“T”表示肿瘤大小，〃N〃表示淋巴结浸润程度，且“M”表示转移程度。癌症的较宽的阶段通常被引作数字
I、II、III、IV，其来自由预后分组的 !值；更高的数字表示更加进展的癌症，其可能有更不好的结果-0期表示非侵袭性乳癌。其没有在乳房中或者向身体其它部分扩散。-I期是浸润性乳癌的早期，其中测量肿瘤直径不超过2厘米(cm)，并且没有涉及淋巴结转移。在此阶段，癌不扩散到乳房以外。-II期，细分为IIA和IIB，表示浸润性乳癌，其中有以下中的一项是事实-测量肿瘤小于2cm，但已经扩散到臂下淋巴结-在乳房没有发现肿瘤，但在腋窝淋巴结发现癌-肿瘤在2cm和5cm之间(大约I至2英寸)，但可能扩散到臂下淋巴结-肿瘤超过5cm，但没有转移到任何淋巴结-III期乳癌被细分为3个类型——IIIA、IIIB和IIIC——根据不同标准的数字。根据定义，III期的癌症没有扩散(转移)至远处。-一个IIIA期肿瘤，例如，大于5cm，并扩散至一个至三个臂下淋巴结。其它IIIA期肿瘤可以是任何尺寸并且扩散至多个淋巴结。这些淋巴结聚在一起，互相附着或附着于周围组织。-在IIIB期乳癌中，任何尺寸的肿瘤扩散至乳房临近组织一皮肤和胸肌一且可能已扩散至乳房内或臂下淋巴结。IIIB期也包括炎性乳癌，一种不常见的但侵袭性的乳癌类型。-IIIC期是任何尺寸的肿瘤。其已扩散-至10或更多的臂下淋巴结-至锁骨上或下和颈部附近的淋巴结-至乳房自身内的淋巴结和至臂下淋巴结-IV期的乳癌已扩散至身体的其它远处部分，如肺、肝脏、骨或脑。尽管此测试和阶段系统提供了一些关于在患者中被诊断为乳癌的阶段的有价值的信息，但是其不能鉴别肿瘤进展的最早期。已经显示遗传的不稳定性是致突变的第一事件之一(Bartkova 等人，Nature, 434:864-870，2005;Gorgoulis 等人，Nature, 434:907-913, 2005)。可是，这不能在TNM测试中被检测，仅仅能够通过临床中常规基础很难使用的分析进行。另外，TNM测试不能给出肿瘤侵袭性的信息，因而其对预后的有用性是有限的。事实上，为了进行可靠的预后，在最早期能够区分侵袭性和非侵袭性肿瘤是重要的。尽管在IV期的患者显然具有不良的预后，但在早期被诊断为乳癌的事实也不能排除尽管在最早期，该肿瘤可能进一步非常迅速发展的可能性。相反地，当淋巴结被肿瘤细胞浸润时， M测试给出了一个不好的预后，患者通常经历一个严重的手术并随后的加强的化学疗法。然而，如果某些这样的患者实际上患的是非侵袭性的乳癌，则化学疗法，一种积极的致突变的治疗，则是可以避免的，且并不降低患者的生存预后。因而，真正需要更好的乳癌预后测试，其不仅仅改善患者的全面生存，还改善了他们的生存质量，且对真正能从积极的高花费的化学疗法受益的患者坚持该化学疗法。因而，发现新的更可靠的预后检测成为一个非常积极的研究领域。在正常细胞的增殖中，DNA复制是通过已知为复制聚合酶(P0LA、P0LD和POLE)三种DNA聚合酶进行的。可是，在人类细胞中鉴别了 10种其它的DNA聚合酶，其被认为是专门的聚合酶，其功能仍大部分未知。因为他们能加工尽管受损了的DNA的能力，因此这些专门的聚合酶看起来是经历了进化而保留的。还看起来这些聚合酶是非常致突变的，他们的活性被严格控制。POLQ (也称为POL theta或POL 0 )是这些专门的DNA聚合酶的一种，在其N-端部分包含一个解旋酶域，在其C-端包含一个聚合酶域。尽管此特殊的专门的DNA聚合酶的功能仍大部分未知，看起来其涉及基因组稳定性的维持和DNA修复(Seki等人，EMBO J，23:4484-4494，2004 ；Masuda 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，102:13986-13991，2005，Yoshimura 等人，Mol. Cell, 24:115-125，2006)。Kawamura 等人(Kawamura 等人 ，Int J Cancer, 109:9-16，2004)比较了在一些包括乳腺的非肿瘤组织和在肺(27名患者)、结肠(26名患者)和胃(28名患者)的癌组织中的POLQ的表达水平。他们发现POLQ在非肿瘤组织中几乎不能被检测到，但是其在相当比例的肺、胃和癌组织中过度表达。作者还指出肿瘤组织中POLQ的过度表达与不好的生存预后相关。但是，他们没有测试乳房肿瘤细胞系或乳房肿瘤中POLQ的表达水平。本发明人分析了肿瘤相对于邻近的正常乳房组织中POLQ基因表达的变化，比较了这些数据与疾病进展和临床特性。其显示POLQ在乳房肿瘤组织中显著地过度表达。另夕卜，其证明了 POLQ的失控表达积极地有助于肿瘤进展。事实上，POLQ过度表达导致遗传的不稳定性和明显的DNA断裂。

发明内容
因而，本发明提供了用于诊断患者中乳癌侵袭性的方法。根据本发明的方法，提高的POLQ基因表达水平表明所述乳癌的侵袭性。因此，本发明提供了用于从患者的乳癌样本诊断所述患者中乳癌侵袭性的方法， 其包括a)体外测量所述患者乳癌样本中POLQ基因的表达水平和对照基因的表达水平，b)计算所述患者的乳癌样本中所述POLQ基因的POLQ表达水平与所述对照基因的表达的表达水平比，c)比较所述POLQ表达水平比与相应的阈值，和d)如果所述POLQ表达水平比高于相应的阈值，则诊断乳癌为侵袭性。特别地，在一个实施方案中，本发明的方法可被用于预后具有多个转移淋巴结的患者的生存。在此实施方案中，具有多个转移淋巴结的患者中高水平的POLQ表达表明肿瘤的侵袭性，导致不好的生存预后，而具有多个浸润淋巴结的患者中低水平的POLQ表达与比较好的诊断相关。数量少的转移淋巴结可以被定义为，例如，浸润淋巴结计数等于I或小于1，而多个转移淋巴结可以被定义为浸润淋巴结计数等于2或大于2。在另一个实施方案中，本发明的方法可被用于预后患有表达p53wt cDNA (与来自GenBank的NC000017-9的序列对照后该序列包含任何突变)的肿瘤的患者的生存。在这个实施方案中，具有表达p53wt cDNA肿瘤的患者中POLQ表达的高水平表明肿瘤的侵袭性，导致不好的生存预后，而具有表达p53wt cDNA肿瘤的患者中POLQ表达的低水平与比较好的预后相关。事实上，发明人已显示具有表达p53wt cDNA肿瘤的患者中POLQ表达的低水平与98%的生存可能性相关。在另一方面，本发明的方法允许检测表现遗传不稳定性的癌细胞。POLQ的失控表达导致增加的DNA损伤和染色体的不稳定性，因而诱发Y H2AX-ATL-CHK2DNA损伤检验点的构建性激活。因此，本发明提供了用于从患者的乳癌样本诊断所述患者中乳癌遗传不稳定性的方法，其包括a)体外测量所述患者乳癌样本中POLQ基因的表达水平和对照基因的表达水平，b)计算所述患者乳癌样本中所述POLQ基因的POLQ的表达水平与所述对照基因的表达的表达水平比，c)比较所述POLQ表达水平比与相应的阈值，和d)如果所述POLQ表达水平比高于其相应的阈值，则诊断乳癌为遗传不稳定性。应该理解两种方法可以组合。因而，在另一方面，本发明涉及用于诊断患者中乳癌侵袭性和用于检测表现遗传不稳定性的癌细胞的方法。因而，本发明的方法呈现出允许检测与不良生存预后和遗传不稳定性相关的遗传事件的优点。如文中使用的，术语“P0LQ”指编码DNA聚合酶0的人类基因(Entrez基因ID号10721 ;mRNA序列参照号NM 199420. 3 ;蛋白序列参照号=NP 955452. 3)。此外，本发明包括所述POLQ基因的所有同种型。同种型，如此处所用，涉及POLQ基因的所有不同形式，并可能由突变产生，或可能通过可选的剪接来自同一基因。多数同种型是由单核苷酸多态性或SNPs，相同基因的等位基因间小的遗传差别引起的。这些发生在一个基因内特定的个别的核苷酸位点。在此定义中也包括通过采用不同的启动子从相同的基因产生不同版本的信使RNA的情况，该启动子引起越过某些外显子的转录。因而，应当理解本发明的方法不局限于POLQ本身，也包含一个或多个POLQ同种型。根据本发明的方法，测量POLQ基因和/或一个或多个其同种型的表达水平，并计算表达比。根据本发明，乳癌的“侵袭性”意指所述乳癌浸润肠壁、淋巴结和发生转移的倾向以及所述浸润可能出现的速度。乳癌的侵袭性显然与生存相关，可以使用上述方法预后患者的生存，其中诊断为侵袭性的病例导致不好生存预后，而没有侵袭性的诊断则产生良好的生存预后。如文中使用的，乳癌的“遗传不稳定性”意指所述乳癌的肿瘤细胞具有遭受DNA损伤的倾向。遗传不稳定性是更加常常发生DNA损伤的乳癌的标志。通过“DNA损伤”表明对DNA的损伤通过引起DNA的共价修饰或使其偏离其正常的双螺旋构象而影响DNA的正常功能。DNA损伤包括结构变形，其干扰复制与转录，以及能断裂碱基并改变DNA序列的点突变。一般而言，当一个细胞发生DNA损伤时，细胞周期停止在三个检验点之一(G1/S、S期内或G2/M)。细胞周期停止可导致DNA修复过程的激活(在DNA损伤相对小的情况)，或者导致凋亡的发生(在严重的DNA损伤的情况)。DNA损伤可由内源过程自发产生，比如由正常代谢产生的活性氧和自由基引起的碱基氧化和DNA链中断的发生，在DNA复制期间由DNA聚合酶产生的碱基的甲基化、脱嘌呤、脱嘧啶、碱基的错配等等。DNA损伤也可以由环境危害引起，如辐射(例如，紫外线辐射、X-射线、Y射线、电离辐射)、天然毒素(例如，植物毒素)、合成毒素、药物(例如，癌症化学疗法，辐射疗法)，烷化剂等等。DNA损伤可导致或来自于各种疾病，包括遗传性遗传疾病和由于暴露于环境危害引起的疾病。DNA损伤也可由吸烟引起，其导致例如心脏病，或由其它疾病，如癌症的疗法引起。使用待检测患者的乳癌样本进行上述方法。在某些情况中，根据本发明的方法可进一步包括从患者获取乳癌样本的预备步骤。通过“乳癌样本”，指肿瘤乳房组织样本。甚至在癌症患者中，乳房组织也包括非肿瘤的健康组织。因而“乳癌样本”应当被限定于取自患者的肿瘤乳房组织。所述“乳癌样本”可以是活检样本或取自外科乳房切除术疗法的样本。另外，根据本发明的方法可以在从患者获取样本以及如上述步骤a)之间包括其它的预备步骤，相应的为将乳癌样本(以及任选地，健康的乳房组织样本)转换成mRNA (或相应的cDNA)样本或转换成蛋白质样本，随后其可备用于步骤a)中的体外基因表达水平的测量。从组织样本中mRNA (以及逆转录为cDNA)或蛋白质的制备或提取仅仅是本领域技术人员熟知的常规程序。
一旦犾得了即用的乳癌mRNA (或对应的cDNA)或蛋白质样本,可进打POLQ基因表达水平的测量，其取决于转换和可获得的即用样本的类型，是在mRNA (即，根据样本中mRNA的含量)还是在蛋白质(即，根据样本中蛋白质的含量)水平。在某些实施方案中，可以在mRNA水平测量一些基因的表达水平，而在蛋白质的水平测量其它基因的表达水平。在这个情况中，取自患者的乳癌样本的一部分被转换为mRNA (或对应的cDNA)样本而另一部分被转换成蛋白质样本。在其它实施方案中，所有被测试的基因的表达水平是在mRNA水平测量或在蛋白质水平测量。当在mRNA水平测量表达水平时，显著地可以使用熟知的技术进行，如定量PCR或核酸微阵列技术(包括cDNA和寡核苷酸微阵列)。这些技术现在已被本领域技术人员常规使用，因此不需要在此详细地描述。使用定量PCR的实施方案的实施例在实验部分描述。可选地，可以使用允许根据mRNA含量评价基因表达水平的任何已知或未来技术。例如，可以使用原位杂交中偶联荧光的组织微阵列。组织微阵列(也称为TMAs)由石蜡块组成，其中多至1000个独立的组织核以阵列形式组装，以允许多重组织分析。在组织微阵列技术中，使用空心针从石蜡包埋的组织(如临床活检或肿瘤样本)的目标区域取出直径小如0. 6mm的组织核。然后将该组织核以精确的空间阵列模式插入受体石蜡块中。使用切片机对所述块切片，装于显微镜载片上，然后通过任何标准组织学分析的方法分析。每个微阵列块可被切为 100-500个切片，其可被用于独立的测试。在组织微阵列中通常采用的测试包括免疫组织化学和原位杂交中的荧光。对于在mRNA水平的分析，可以将微阵列技术偶联至原位杂交中的荧光。当在蛋白质水平测量表达水平时，显著地可以使用特异性的抗体进行，特别地使用熟知的技术，如Western印迹、ELISA或ELISP0T、抗体微阵列、或偶联免疫组织化学的组织微阵列。通过计算所述患者乳癌样本中的POLQ基因的表达水平相对于对照基因表达水平的表达水平比，通过比较得到的表达水平比与相应的阈值，进行所述患者的乳癌样本中被测量基因的表达水平的比较。根据本发明，所述的对照基因是在所有细胞类型中表达的基因。更特别地，根据本发明的对照基因是在构成乳房的所有细胞中表达的基因。在另一方面，对照基因的表达水平不受细胞状态的影响，即，在健康细胞和肿瘤细胞中对照基因表达为相同的水平。在一个特定的实施方案中，对照基因是管家基因。管家基因是在所有细胞类型中表达的基因，其为所有细胞类型的维持提供了基本的功能。人类管家基因的列表可在 Eisenberg 等人(Trends in Genetics 19:362-365，2003)中找到。根据本发明优选的管家基因是选自 B2M、TFRC, YffHAZ, RPLO, 18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB,PGKl、HPRTl、IP08和HMBS的基因。根据本发明的进一步优选的管家基因是IP08或HMBS。根据本发明，“阈值”意指允许区分样本的值，其中目标基因的表达水平比对应于患者乳癌样本中所述的目标基因的表达水平，其是低的或高的。特别地，如果基因表达水平比低于或等于阈值，那么在患者乳癌样本中的该基因表达水平被认为是低的，而如果基因表达水平比高于阈值，那么在患者乳癌样本中的该基因表达水平被认为是高的。对于每个基因，且取决于用于测量基因表达水平的方法的不同，最佳的阈值可不同。但是，本领域技术人员根据多种对照乳癌样本的分析以及比较其与对照基因(例如，管家基因)的表达，可以容易地确定该阈值，在所述对照乳癌样本中，对于该特定基因的表达水平(低或高)是已知的。特别地，发明人确定了 15. 8的独特阈值是特别有用的。发明人显示表达水平比在此阈值上的患者生存显著地降低。当使用定量PCR在mRNA水平测量所有基因的表达水平时，该15. 8的独特阈值特别有用。本发明进一步涉及专用于实现根据本发明方法的微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针，其中至少I个特异地结合POLQ mRNA (或相应的cDNA)或蛋白质。在一个优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针(因而，例如排除了全基因组(pangenomic)微阵列)其中至少I个特异地结合POLQ mRNA (或相应的cDNA)。除特异地杂交POLQ的探针外，所述微阵列还包含至少一个特异地杂交管家基因的探针。在一个实施方 案中，所述管家基因选自 B2M、TFRC、YffHAZ、RPLO、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08和HMBS。更优选地，管家基因是IP08或HMBS基因。根据本发明，“核微阵列”由不同的核酸探针组成，其附着于基底，该基底可以是微芯片、玻片或微球大小的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、硅或基于硅的物质、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维构成。探针可以是核酸，例如cDNA(“cDNA微阵列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微阵列”，寡核苷酸长度为大约25至大约60个碱基对或更短)。可选择地，在另一个实施方案中，所述微阵列可以是抗体微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的抗体，其中至少I个特异地结合POLQ蛋白质。除特异地结合POLQ蛋白质的抗体外,所述微阵列还包含至少一个特异地结合管家蛋白质的抗体。在一个实施方案中，所述管家蛋白质选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKU HPRTU IP08 和 HMBS 蛋白质。在一个优选的实施方案中，所述管家蛋白质是IP08或HMBS蛋白质。除核酸或抗体微阵列技术外，可以使用定量PCR，因而待检测的基因特异的扩增引物对于进行根据本发明的方法也非常有用。因而，本发明进一步涉及用于从患者的乳癌样本中诊断所述患者乳癌的侵袭性和遗传不稳定性的试剂盒，其包括如上所述的专用微阵列或POLQ特异的扩增引物。在此，当试剂盒包含扩增引物时，所述试剂盒可包含其它基因特异的扩增引物，所述试剂盒优选包含最多100、最多75、50、最多40、最多30、优选最多25、最多20、最多15、更优选最多10、最多8、最多6、甚至更优选最多5、最多4、最多3或甚至2或I或甚至0对其它基因而非POLQ特异的扩增引物。例如，除POLQ的引物外，所述试剂盒可以包含至少一对用于至少一个管家基因的扩增引物。在一个实施方案中，所述管家基因选自 B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGKl、HPRTl、IP08和HMBS。在一个优选的实施方案中，所述管家基因是IP08或HMBS基因。如上提及的，预后与其侵袭性相关联的乳癌进展的能力，对于选择适当的治疗非常重要，理由是除传统的外科治疗外，每次必要时且仅在必要时，使用具有潜在副作用的剧烈的昂贵的治疗。因而，本发明还涉及用于在患者中选择适当的乳癌治疗的方法，其包括a)使用如上所述的根据本发明的方法诊断所述患者中所述乳癌是或不是侵袭性，以及b)如果所述乳癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则在外科治疗中增加辅助的辐射疗法和化学疗法。除了其对乳癌侵袭性的预后价值外，发明人还发现基于POLQ表达水平分析的相同测试可以允许诊断是否存在遗传不稳定性，因而导致上述方法可用于诊断遗传不稳定性。特别地，本发明人显示失控的POLQ表达与DNA断裂频率的增加相关。因而，在一个优选的实施方案中，本发明的方法被用于诊断DNA断裂。这种遗传不稳定性以及DNA断裂频率的显著增加可能导致有关辅助疗法的选择。特别地，遗传不稳定性可能有助于肿瘤细胞突变，以及因此增殖和粘附的失控，DNA断裂的出现也可被用于抗肿瘤细胞。事实上，对于连续的增殖，那些DNA断裂被修复，而具有大量DNA断裂的细胞通常容易引起细胞死亡。结果，辐射疗法可能不能在所有环境中有效，但其
对已经存在增加的DNA断裂频率的肿瘤细胞的效率可被改善。例如，辐射疗法可能对于被本发明的方法确认的POLQ过度表达的乳房肿瘤细胞高度有效，原因是这些细胞含有高水平的DNA断裂和染色体不稳定性。以同样的方式，使用DNA修复抑制因子可允许冻结DNA断裂而导致肿瘤细胞死亡。更一般地，发明人显示DNA损伤检验点(DDC)或DNA代谢的抑制导致降低的POLQ过度表达的细胞的活力。例如，Chk2激酶活性中受影响的细胞不能检测到POLQ过度表达诱导的DNA损伤和/或响应所述损伤而引起的细胞周期的停止。同样地，POLQ过度表达细胞表现出对DDC或核苷酸代谢抑制增加的敏感性。因而，本发明还涉及用于预后辐射疗法或DNA修复DNA损伤信号或核苷酸代谢抑制因子在患者乳癌治疗中效率的方法，其包括a)使用如上所述的根据本发明的方法诊断所述患者的所述乳癌是或不是遗传不稳定性，和b)如果在步骤a)诊断为遗传不稳定性，则预后辐射疗法或DNA修复、DNA损伤信号或核苷酸代谢抑制因子效率。根据本发明，“DNA修复抑制因子”意指能够抑制DNA断裂(特别是双链DNA断裂)修复的分子。然而，这种表述不应当被理解为限定性的，DNA修复抑制因子的实例包括DNA修复蛋白 PARP 的抑制因子(参见，例如 W02004080976、W02005/053662、W02009/046205)、组蛋白脱乙酰基酶的抑制因子，如PCT申请W02008/082856中描述的那些，和DNA聚合酶3抑制因子(参见W02007001684)。“DDC抑制因子”是能够阻断涉及DNA损伤检验点中任何蛋白质活性的分子。此种蛋白质的实例包括ATM/ATR、Chk2和Chkl。如文中使用的，“核苷酸代谢抑制因子”包括所有导致核苷酸库失衡的化合物，理由是所述核苷酸代谢抑制因子是例如核苷酸类似物(如6TG)或由于其抑制核苷酸生物合成酶(如HU)。在其它实施方案中，本发明还涵盖用于分离能够抑制DNA修复、DNA损伤信号或核苷酸代谢的新的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a)使化合物与过度表达POLQ的细胞或不过度表达POLQ的细胞接触，和b)分析是否所述化合物对POLQ过度表达细胞活力的影响多于其对不过度表达POLQ细胞的活力的影响。过度表达POLQ的细胞可以是任何类型的细胞，其中POLQ的表达失控，而不过度表达POLQ的细胞是对POLQ表达的调节得以维持的细胞。例如，在强的普遍存在的启动子的控制下，用带有POLQ基因或cDNA的骨架载体转染宿主细胞，可以获得过度表达POLQ的所述细胞。在此情况中，有利地，所述细胞是用相同骨架载体转染的宿主细胞，其中所述载体不含有POLQ插入。在另一个方面，本发明还涉及一种或多种DNA修复、DNA损伤信号或核苷酸代谢抑制因子在制备药物中的用途，其中所述药物预期用于治疗其乳房肿瘤过度表达POLQ的患者的乳癌。根据本发明，如果所述乳癌样本中所述基因表达水平与对照基因表达水平的比高于如上定义的阈值，则该乳癌样本中的基因被认为是“过度表达的”。在一个特别的实施方案中，所述阈值可以是15. 8。本发明还涉及用于治疗患过度表达POLQ的乳癌的患者的方法，其包括对所述患者实施辐射疗法和/或向所述患者施用有效量的一种或多种DNA修复抑制因子。


图I.来自组I (法国，n=105)的乳房肿瘤中DNA聚合酶基因的相对表达。计算了肿瘤(T)和正常(N)乳房样本mRNA表达比(T/N)(预先对表达水平相对于对照基因进行了正态化)。T/N>1和〈I分别表示与合并的正常组织相比肿瘤中较高和较低的表达水平。从双向精确的二项检验给出未校正的P值；使用本杰明2001程序对全部为0. 05的FDR评价显著水平。由X轴表示的患者样本，并按照与每组(panel)相同的顺序进行分类。+和-分别代表与正常组织(N)相比，肿瘤(T)中的较高和较低的表达。对于小于I的图表征T/N值被转换为倒数(inverse) N/T值。图2.来自组2 (法国，n=101)的乳房肿瘤中DNA聚合酶基因的相对表达。计算了肿瘤(T)和正常(N)乳房样本(T/N) mRNA表达比(预先对表达水平相对对照基因进行了正态化)。T/N>1和〈I分别表示与合并的正常组织相比肿瘤中较高和较低的表达水平。从双 向精确的二项检验给出未校正的P值；使用本杰明2001程序对全部为0. 05的FDR评价显著水平。由X轴表示的患者样本，并按照与每组相同的顺序进行分类。+和-分别代表与正常组织(N)相比，肿瘤(T)中较高和较低的表达。对于小于I的图表征T/N值被转换为倒数N/T值。图3.肿瘤中相对基因表达的基因与基因的比较。法国人乳房肿瘤中DNA聚合酶表达间的所有配对相关的图形表示(非参数Spearman’ s相关；(A)组I (n=105) ； (B)组2(n=101))。Spearman rho系数越接近I (由水平和垂直轴相交的红或黄色区域表示),认为两基因的表达间越具有相关性。相反地，rho值小于I (由绿色区域表示)表示被比较的表达是互相独立的。图4. POLQ基因表达水平对患者的癌症特异性生存的影响。(A)根据原发肿瘤中DNAP0LQ表达水平的乳癌患者的Kaplan-Meier生存。来自法国人群的患者(n=203,而不是206，3例没有确定POLQ的样本被废弃)。表明来自每次对数秩(log-rank)检验的p值。(B)在原发乳房肿瘤中的POLQ基因表达和阳性淋巴结数目间的配对比较的Kaplan-Meier生存。患者来自法国人群(n=203)。给出了对数秩卡方检验(X2)和p值。Pq代表P0LQ，Ln代表阳性淋巴结。图5. POLQ过度表达克隆的细胞内平衡(A)稳定地过度表达POLQ的克隆的确认。来自用空载体(CTL2)稳定转染的对照细胞和来自用POLQ cDNA (Q1、Q2和Q3)稳定转染的克隆的细胞提取物(100 ii g)在5%SDS-PAGE上进行分离，电转移至PVDF膜，使用亲和纯化的抗POLQ (15)和抗粘着斑蛋白(作为加样的内对照)抗体通过免疫印迹分析。使用纯化的POLQ (50ng)作为大小对照；(B)细胞周期的结果。在用碘化丙啶染色DNA后，通过流式细胞术确定处于细胞周期每一期的细胞数。至少分析3次独立的实验。确定平均值和标准误差，通过学生t检验计算p值。图6.在POLQ过度表达的克隆中ATM-CHK2DNA损伤检验点。Y -H2AX (A)和PT68-CHK2 (B)染色阳性的细胞平均数的定量。用UV (10J. m_2)处理的对照(CTL)克隆被作为阳性对照。对于定量，在至少3次独立的实验中最少分析100个细胞。确定平均值和标准误差，通过学生t检验计算p值；(C)表示过度表达POLQ (Q1、Q2、Q3)的细胞的共聚焦显微镜图片。图7.Y-H2AX检测。收获250，000个尚未完全汇合(sub-confIuent)的细胞，然
后超声处理。通过在15%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离总蛋白提取物。将凝胶转移至Hybond-P 膜上(Amersham, Arlington Heights, IL),用单克隆抗 H2AX 抗体(Upstate, LakePlacid, NY)在4 °C下过夜杂交(probe)。使用辣根过氧化物酶羊抗鼠抗体作为二抗(Sigma, St. Louis, MO)。然后使膜与增强化学发光试剂(Amersham)孵育。通过用抗肌动蛋白抗体免疫印迹该膜，评价加样的提取物的等量。图8. POLQ过度表达的克隆中DNA断裂和染色体异常。(A)在对照克隆(CTL2和CTL9)和过度表达POLQ (Q1、Q2和Q3)的克隆中定量异常的中期。秋水仙酰胺处理3小时候收集细胞，制备中期涂片(spread)。对于定量,在至少3次独立的实验中最少分析100个中期。确定平均值和标准误差，通过学生t检验计算p值；(B)表示来自CTL9和Q3克隆的中期涂片的显微镜图像。箭头表示染色体异常。图9.对烷化剂的敏感性。通过克隆分析确定药物敏感性。POLQ过度表达(Q1、Q2、Q3)细胞和同基因对照(CTL2、CTL5)细胞对甲磺酸甲酯(丽S)和N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)的敏感性。生存被表示为被处理细胞对对照的相对接种效率(relative platingefficiency)。丽S和MNU的剂量以线性标度在x轴上表示，而生存的克隆分数以对数标度在y轴上表示。结果为至少3次独立的实验重复两次的平均值+/-SD。图10.在过度表达POLQ的细胞中DNA复制叉速度。(A)代表对照细胞或过度表达POLQ细胞中梳(combed)和免疫染色的DNA纤维的图像；(B)表示分布于对照克隆(CTL2)和两个过度表达POLQ的克隆(Q2和Q3)中的复制叉速度的直方图；(C)总长度是对每个克隆研究的所有DNA纤维的Mb总数；“n”是每个克隆中评分的IdU和CldU轨道(track)数。群的中值以kb/min给出。复制叉速度中值的不确定以绝对偏差中值的单位给出。应用Mann-Whitney检验比较Q2和Q3数据组与实验对照，CTL2。图11. POLQ基因表达水平对患者的p53特异性生存的影响。(A)根据p53基因(野生型对突变的cDNA序列)状态，乳癌患者(n=150)的Kaplan-Meier生存。使用对数秩检验比较这些生存曲线。该检验计算检验在两群体中生存曲线是相同的这一零假设的P值。表明了来自对数秩检验的P值。(B)根据POLQ表达水平的患有p53wt肿瘤的乳癌患者(n=84)的Kaplan-Meier生存。使用对数秩检验比较这些生存曲线。该检验计算检验在两群体中生存曲线是相同的这一零假设的P值。给出P值。
图12. POLQ基因表达水平对Chk2抑制因子敏感性的作用。(A) MCF7细胞比MDA-MB231细胞表现出对Chk2抑制因子II水合物(Sigma RefC3742)更高的敏感性。在克隆形成分析中确定生存。MCF7 :方形；MDA-MB231 :菱形(B)在MCF7中POLQ的表达量比在MDA-MB231中更高。通过RT-PCR分析基因表达水平。C51是正常乳房细胞系。
具体实施例方式实施例I.材料与方法I. I研究设计、患者和肿瘤样本，差异的基因表达包括的患者由来自辅助的多中心III期临床试验(PACSOI试验)的患者亚组组成。临床试验的结果已在其它地方发表了(Roch6等人J Clin Oncol 24:5664-5671，2006)。来 自此群的肿瘤样本(n=206)被分为用于基因分型的两组(n=101和n=105)。正常乳房组织获自Claudius Regaud Institute (Toulouse,法国),取自外科标本,其距离乳癌至少3cm。来自该群的患者以及肿瘤的特征如表I所述。表I患者和肿瘤的基线特征
权利要求
1.一种用于从患者的乳癌样本诊断所述患者中乳癌侵袭性的方法，其包括 a)体外测量所述患者乳癌样本中POLQ基因和/或一种或多种其同种型的表达水平和对照基因的表达水平， b)计算所述患者乳癌样本中所述POLQ基因和/或同种型的POLQ和/或一种或多种其同种型的表达水平与所述对照基因的表达的表达水平比， c)比较所述基因表达水平比与相应的阈值，和 d)如果所述比高于其相应的阈值，则诊断乳癌具有侵袭性。
2.权利要求I所述的方法，其中所述患者具有高数量的转移淋巴结。
3.权利要求I所述的方法，其中所述乳癌表达野生型p53cDNA。
4.一种用于从患者的乳癌样本诊断所述患者中乳癌遗传不稳定性的方法，其包括 a)体外测量所述患者乳癌样本中POLQ基因和一种或多种其同种型的表达水平和对照基因的表达水平， b)计算所述患者乳癌样本中所述POLQ基因和/或同种型的POLQ和/或一种或多种其同种型的表达水平与所述对照基因的表达的表达水平比， c)比较所述基因表达水平比与相应的阈值，和 d)如果所述比高于其相应的阈值，则诊断乳癌为遗传不稳定性。
5.权利要求I至4任一项所述的方法，其中所述的对照基因是管家基因。
6.权利要求5所述的方法，其中所述管家基因是选自B2M、TFRC,YffHAZ, RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08 和 HMBS 的基因。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的基因是IP08或HMBS。
8.权利要求I至7任一项所述的方法，其中所述的表达水平是在mRNA水平上测量的。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的表达水平是使用定量PCR或微阵列技术测量的。
10.权利要求I至9任一项所述的方法，其中所述的表达水平是在蛋白质水平上测量的。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的表达水平是使用特异性抗体测量的。
12.权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述阈值为15.8。
13.一种包含至多500个探针的微阵列，其中至少一个探针特异地与POLQ杂交。
14.根据权利要求13所述的微阵列，其中至少一个其它探针特异性与选自B2M、TFRC,YWHAZ、RPL0、18S、(；USB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS 的基因杂交。
15.根据权利要求14所述的微阵列，其中所述基因是IP08基因或HBMS基因。
16.一种试剂盒，其用于从患者的乳癌样本中诊断所述患者乳癌侵袭性和/或遗传不稳定性，其包括权利要求13-15任一项的微阵列或POLQ特异性扩增引物。
17.权利要求16所述的试剂盒，其中进一步包括特异于选自B2M、TFRC,YffHAZ, RPLO,18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08 和 HMBS 的基因的扩增引物。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述基因是IP08基因或HBMS基因。
19.一种选择患者中乳癌的适当的治疗的方法，其包括 a)使用权利要求1-3任一项的方法诊断所述患者中所述乳癌是或不是侵袭性，和b)如果所述乳癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则在外科治疗中增加辅助的辐射疗法或化学疗法。
20.一种用于预后辐射疗法或DNA修复、DNA损伤信号或核苷酸代谢抑制因子在患者乳癌治疗中效率的方法，其包括 a)使用权利要求4的方法诊断所述患者的所述乳癌是或不是遗传不稳定性，和 b)如果在步骤a)中诊断为遗传不稳定性，则预后辐射疗法或DNA修复抑制因子的效率。
21.一种用于分离能够抑制DNA修复、DNA损伤信号或核苷酸代谢的新的化合物的方法，所述方法包括以下步骤 a)使化合物与过度表达POLQ的细胞或不过度表达POLQ的细胞接触，和 b)分析是否所述化合物对POLQ过度表达细胞活力的影响多于其对不过度表达POLQ细胞的活力的影响。
22.—种或多种DNA修复、DNA损伤信号或核苷酸代谢抑制因子在制备药物中的用途，其中所述药物预期用于治疗其乳房肿瘤过度表达POLQ的患者的乳癌。
全文摘要
本发明涉及用于从患者的乳癌样本诊断所述患者中乳癌侵袭性和/或遗传不稳定性的方法，其包括a)体外测量所述患者乳癌样本中POLQ基因的表达水平和对照基因的表达水平；b)计算所述患者乳癌样本中所述POLQ基因的POLQ的表达水平与所述对照基因的表达的表达水平比；c)比较所述POLQ表达水平比与相应的阈值，和d)如果所述POLQ表达水平比高于相应的阈值，则诊断乳癌为侵袭性和遗传不稳定性。本发明还描述了专用的微阵列和试剂盒，以及选择适当的治疗的方法。
文档编号C12Q1/68GK102791879SQ201080056532
公开日2012年11月21日 申请日期2010年11月12日 优先权日2009年11月13日
发明者A·马沙多达西尔瓦, C·卡佐, H·罗什, J-C·布尔东, J-S·霍夫曼 申请人:克劳迪乌斯勒戈研究所, 国立保尔·萨巴梯埃-图卢兹第三大学, 法国国家科学研究中心