专利名称：用于细菌总dna内含物的特异性分离方法和用于该分离目的的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明的主题是一种用于不同来源样品的细菌总DNA内含物的特异性分离方法以及一种用于实践中实现该方法的试剂盒。
背景技术：
在饮用水、环境水、食品、工作区、不同的公共和环境表面的公共健康卫生监测方面，所收集样品的微生物测试的重要部分是细菌的定性和定量测定。对于上述测定而言一除了选择性或非选择性培养基上的体外培养和它们的显微检测以外，以及除了为单个细菌新陈代谢步骤而精心进行的生化反应以外一目前多种基于核酸的分子诊断方法也是可行的，例如聚合酶链反应(PCR)核酸序列的体外扩增、或揭示核酸碱基序列的排序方法、或测试所得核酸片段的琼脂糖凝胶电泳方法[Nucleic Acid Isolationand Purification, 2nd Edition, Roche Diagnostics GmbH, 2003] 与传统方法不同，这些核酸类的分子诊断方法使得分析即使在少量首批样品的情况下也能够进行。这些核酸类的分子诊断方法的模板是具有实际使用的分析方法所需的浓度和纯度的细菌核酸。然而，这两个参数，核酸的浓度和纯度会随着所用的预分析方法而变化，即随着样品破碎和核酸提取的方法而变化。为得到模板核酸的样品破碎为多步骤方法，在该方法中，适合当前用途的单独步骤可以分别进行或彼此结合。通常，破碎始于细胞裂解，接着在随后的步骤中进行选择性结合-靶向脱氧核糖核酸(DNA)的提取和纯化，然后以纯化分离的核酸的定性和定量测定结束方法。在确定合适的PH值、温度和离子条件时，可以机械地(例如通过溶胀、超声破解、粉碎进行破碎)，化学地(例如用含有酶、表面活性剂、洗涤剂、离子螯合剂的缓冲液)，在蛋白改性和细胞内脱氧核糖核酸酶抑制添加剂的联合复合物中，进行破碎。在沉淀-提取、离心、电泳或色谱法的帮助下，可以从破解得到的裂解物中分离并纯化靶向核酸。例如通过测量在紫外波长(UV)诱导的DNA插入聚芳染色(例如溴化乙啶)的荧光发射，可以进行从细胞大分子和进一步的细胞碎片中纯化的核酸产物的半定量分析。在用UV分光光度法在波长λ26(ι处测量的光密度(OD)的基础上，可以进行分离的核酸的定量分析。一个OD单元相当于50 μ g/ml的DNA浓度。为了定义分离的DNA的纯度，使用了在两个不同UV波长处测量的光密度比(OD26tl/OD28tl),即在核酸水溶液和蛋白水溶液的特征波长处(λ 26(|和λ28(ι)测量的光吸收比。优选地，OD260/OD280的比值在I. 4至2. O的范围内变化。较小值显示了蛋白污染(例如细胞裂解物的残留蛋白组分)，而较大值(>2)显示了分光光度测量误差或其他可能的污染。当使用PCR时，优选地0D26Q/0D28Q比应该在I. 4至I. 8之间。在日常的公共健康实践方面，最普遍地是使用苯酚-氯仿混合物分离细菌DNA[Sambrook J. et al. :Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarborLaboratory PressjlrdEditionjOOlh该方法基于用含有洗漆剂、蛋白降解酶的裂解缓冲液破坏细胞，然后向裂解物加入苯酚-氯仿混合物，结果酸性苯酚相从其它产物中提取裂解物的蛋白和 RNA 组分[Cohn E. J. , Conant J. B. (1926) : PNAS 12:433-438. ], MDNA可以用易与水混合的有机溶剂分离，例如用异丙醇分离[Kirby K. S. (1956) :Biochem.J.64:405-408.]。上述有机溶剂在破碎和分离的方法中毫无疑问是有效的，但是它们威胁实验室工作人员和环境的潜在毒性却不容忽视。避免使用上述有机溶剂的相当常用的解决方法为，在破坏生物样品之后还向分离基因组DNA内含物的缓冲液体系中加入离液序列高的组分[Chomczynski P. et al. (1997) :Biotechniques 22:550-553·]。由于离液序列高的组分使蛋白质改性(例如NaJ、KJ、Na-高氯酸盐、盐酸胍_GC、硫氰酸胍-GTC)以及合适的pH值水平，与蛋白结合的核酸分解，且核酸降解核酸酶的功能性抑制促进了有效的DNA分离。美国专利4900677记载了适用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌破碎的方法，之后使用不含有机溶剂的溶液以快速方法将绿脓杆菌和粪链球菌的染色体DNA内含物与其它物质分离。为了提取染色体DNA，在包含具有不同目标光谱的酶(溶解酵素、内-N-乙酰-溶菌酶、消色肽酶等)、溶解剂(例如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺)、表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、TritonX-100、CHAPS、CHAPSO)和离子螯合剂(例如EDTA)组分的基于pH=8. O的Tris缓冲液的混合物中，通过涡流混合将初始IO7-IO8细胞团破碎。用核糖核酸酶(RNase)消化污染核糖核酸(RNA)物质，且通过加入蛋白酶K中和剩余的酶蛋白物和非酶蛋白物。向体系中加入支 持DNA分离的离液序列高的组分(例如Na-三氟醋酸盐、Na-高氯酸盐、NaJ)，然后使用火棉胶膜透析纯化将近一小时得到的DNA。通过改变反应温度(37° C和60° C)进一步促进样品破碎和剩余蛋白的中和。根据美国专利5595876，在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的所谓原位单管DNA提取过程中，通过提高温度也可以促进残留蛋白的中和。如上所述，在破碎和分离的过程中成功地避免了有机溶剂的使用，但是提取的产量和分离的DNA纯度却降低了。通过一种间接方法试图提高DNA产量，该方法通过在碱性缓冲介质中(例如pH=8至9)加入少量易与水混合的有机溶剂而促进DNA的选择性分离。在美国专利5945515中，在一个真核细胞实例中，通过加入少量有机溶剂将RNA物质从也在碱性缓冲液中含有离液序列高组分(GTC)的细胞裂解体系中初步沉淀，然后用离心分离沉淀物，从而将要分离的DNA选择性地留在溶液中。在该专利说明书进一步的实例中，为了加快上述DNA分离，在数量上减少然后省略了离心步骤。在分析以此获得DNA的纯度时，还在琼脂糖凝胶电泳法中检测到了 RNA残留污染物。除了以上常规的和间接的分离方法以外，约二十年来，实践中按照不同原理操作的DNA分离的其他替代方法已经变得越来越广泛。实际上，这些替代方法中的一类在生物大分子的分离方面使用了色谱原理[例如根据美国专利6428703所述，使用盒式色谱系统纯化裂解的大肠杆菌中的质粒DNA，或根据WO专利9105606所述，在硅烷化的色谱盒上分离核酸]。这些方法都是基于原理细胞裂解后，裂解物的DNA物选择性地且可逆地结合在载体表面上。这些载体可以为过滤物(硝基纤维素、尼龙、醋酸纤维素、金属氧化物)、塑料(PVDF)或玻璃(硅胶 Si02、SiO2-TiO2)类的基质[Boom R. etal. (1990) :J.Clin. Microbiol. 28:495-503. , Mackey K. et al. (1998) :Mol. Biotechnol. 9:1-5. , BoomR.et al. (1999) :J. Clin. Microbiol. 37 :615-619. , Dames S. et al. (2006) : IMol.Diagn. 8:16-21. , Gushikem Y. , Rosatto S. S. (2001) : J. Braz. Chem. Soc. 12:695-705.],或者可以为通过结合不同离子和聚合物得到的微粒和珠子，在载体的使用过程中，破碎和DNA提取的步骤可以自动进行[Youngman L. D. et al. (2002) :Clin. Chem. 48:16291630.，SmithK. etal. (2003) :J. Clin. Microbiol. 41:2440-2443·]。WO 专利 2004033707 记载了 Na-硅酸盐载体的使用，WO专利第2004046231号记载了在真核线粒体DNA CmtDNA)或全血DNA内含物的分离过程中，结合到聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯载体(试管、微板孔)的二氧化硅、硅胶的使用。在记载于WO专利1998023630中的单步方法中，羟化的芳香疏水聚合物、聚羟基苯乙烯的作用被描述为保留细胞裂解物的污染组分，同时核酸随着洗提液离开。WO专利2002000930记载了在胍盐 的帮助下，从应用于尼龙或愈疮木浸入的载体的粪便涂片样品中提取DNA，而在美国专利20080319182中通过提供特殊的阳离子表面而确保DNA结合。用可逆的二级结合和对载体的选择性特征，在独特的物理-化学条件(温度、离心力、电解质条件等)下，将包括DNA的核酸结合在这些载体的表面。从溶液中清除具有结合在其表面的DNA的载体后，且在合适的脱盐后，通过从载体洗提DNA可以分离所结合的DNA。对于下游分子应用(例如PCR、酶消化、排序、电泳等)而言，分离的DNA的最重要的参数为纯度(参见下文)、量(浓度μ g/ml)和完整/片段，即分子的物理维持。使用上述有机溶液的常规提取方法的优点是较令人满意的纯度(OD26tlA)D28tl指数=1. 4-1. 7)和较大的浓度(>50 μ g/ml)。其缺点在于残留溶剂会干扰敏感的下游分子应用(例如水解探针定性的实时PCR、微阵列)，还在于分离方法耗时(最少I. 5-2小时)。就其效率而言，这些方法具有差的重复性，两个独立分离之间的合并方差(CV%)高，因此它们很难被调整为标准的实验室规程。使用以上列举的载体从溶液中选择性结合DNA，基于此替代的方法和试剂具有更好的技术参数，其重复性指数更好，其可以根据相对更快的规程操作，且由于其标准化的性质而更易于调整为仪器分离方法。美国专利5234809记载了一种核酸分离方法，其中，使用该方法单链的和双链的DNA都可以分离。在所述方法的过程中，不用预裂解就可以从复杂生物样品本身(例如全血、血清、尿)分离靶向核酸，所用方法为在单一试管缓冲液体系中，结合二价离子的离子螯合齐IJ (例如EDTA)，从溶液中沉淀蛋白分子的离液序列高的化合物(例如GTC)结合靶向核酸的以及基质表面(例如二氧化硅、或乳胶颗粒、或硝基纤维素过滤物)都是在同一反应空间。对于细菌样品而言，该方法的结果受到初始细胞浓度的显著影响，因此每个应用中结合基质的核酸的二氧化硅颗粒的尺寸范围都会不同。WO专利9534569包含了相同反应空间中细胞破碎和DNA分离的进一步的实例，在该实例的过程中，在相同的微板孔中裂解严重污染的少量样品(例如5X IO3个细胞，O. 5μ L血)，其中，在由40nm的SiO2颗粒组成的无孔、分散、同质基质表面上提取DNA内含物。在该方法的过程中分离的DNA的大小在50核苷-60，000核苷间的范围内变化。同样，德国专利4422044也记载了相同反应空间中的细胞破碎和DNA分离，在上述过程中，从与以上相同的少量初始样品中以类似的效率分离细菌质粒的DNA内含物或HeLa细胞培养物。以上相同反应空间的优点是使技术污染(例如吸液管)最小。然而，在这个共同的反应空间内，不容忽视的是，除了要分离的核酸分子以外，作为下游应用(例如PCR)的潜在抑制剂的其它组分(例如脂质、单链核酸、色素、小分子)也可以被吸收或结合在基质表面上。这些潜在的下游抑制剂的清除需要核酸分离方法中进一步的分离步骤。由此，用缓冲液和有机溶剂对具有含离子螯合剂的洗提液的与以上列举的二氧化硅类的载体结合的核酸进行数次清洗。如前所述，DNA分离的根本问题是在整个方法的过程中分子的维持和完整。所应用的机械效应，如吸取、混合、离心，以及与不同洗涤剂、离子螯合剂和离液序列高的组分接触可以导致核酸结构中的变形甚或破裂。如上所述，在相同反应空间内细胞裂解和核酸分离的实现，减小离心的必要性都为增强维持DNA完整而提供了可能性。同时，除了DNA完整以外，下游分子应用所需的核酸纯度和产量也不容忽视。由于该复杂目的，与单一的空间方法不同，在根据本发明的方法中，我们进行了细胞裂解，然后在分离的反应空间进行了选择性的DNA分离，结果洗涤步骤变得更简单，在约30分钟内制备了 DNA分离物，根据OD260/OD280比的纯度(平均I. 8)和产量(20至100 μ g/1OOmg初始样品)有利于PCR和其他下游分子应用。在根据本发明的方法中，为选择性结合细菌双链的DNA，制造了一种具有增强的化学和热力学稳定性的-SiO2-TiO2-基质，在该基质表面存在化学稳定的-OH(硅烷醇、钛醇(titanol))和十二烷胺基团，且该基质有利于与十二烷胺连接物预交联。美国专利6787307提供了一种使用磁化二氧化硅颗粒组成的基质表面的核酸分离、细菌染色体DNA、质粒DNA提取方法。在所述方法中，通过使用合适的磁场，该磁化二氧化硅颗粒可以容易地与结合于其表面的核酸一起分离，以从裂解物分离。在上述分离步骤中，除了由细胞破碎产生的裂解物的靶向DNA分子以外，下游应用(例如PCR)的抑制剂也附 着在基质表面。这些后面的组分清除是耗时的多步方法(参见上文)。与该方法不同，根据本发明的方法中，没有PCR抑制剂附着于我们制造的DNA结合基质表面。根据美国专利20100021905的一个实施方式，哺乳动物组织来源的DNA-RNA混合物在支持两个核酸相结合的缓冲液条件下结合于二氧化硅类基质表面。所结合的DNA用碱性试剂(PH=IO)分别从蛋白和RNA中洗提。该方法的选择性与胍盐阴离子的大小成正比，因此根据说明书的教导，硫氰酸盐离子代替氯离子的存在更有利于DNA的有效提取。在根据本发明的载体上DNA分离的离液序列高支持中，证明了 -SiO2-TiO2-基质表面、盐酸胍也是有益的。已知方法的困难可能首先是由于a)如果它们能够以大的选择性分离DNA，那么不含抑制下游分子应用(例如PCR)组分的纯DNA产量保持在总的可分离DNA的20 μ g以下，或b)如果可能有更多DNA产量(20至100 μ g/ml)，那么所得DNA的纯度相当可疑，即 0D26Q/0D28Q 比很低(I. 3 至 I. 4)。此外，该替代方法通常表征为a)在多数情况下，结合于载体的核酸的选择性和数量参数是可疑的，即除了旨在分离的双链DNA，还结合了单链DNA和RNA，且后者的存在会歪曲或干扰下游分子应用和分子特异性，b)分离的DNA量明显取决于载体的结合能力，c)分离的DNA的质量和抑制剂含量明显取决于样品，d)对于选择性富集的微生物样品来说，它们是最有效的，在从复合物或混合的细菌样品中分离的方面，它们并非如此有效，E)最重要的是，几乎所有的分离方法都会提取活的和非活的细菌细胞的DNA，而源于非活细胞的染色体的DNA在检测方法的过程中产生了假阳性信号。
对于化学制品和试剂行业而言，在现行实践中不存在同时满足以下所有需求的DNA制备方法a.即使在一般的实验室基础条件下，也可以相当快地进行，b.专门从活细胞中分离总DNA，即制备方法提供动态结果，c.即使在适当低数量的微生物存在的情况下，其也提供显著的结果，d.其仅对双链DNA是特异性的，e.其适于获取具有适当高化学纯度(无抑制剂)和适当高浓度的DNA，f.其特征可为较好的重现性和低数量的合并方差，g.从多种不同来源都能够收集微生物样品。
发明内容
根据本发明方法的目的是消除已知方法的不利特点并制定制备方法，其中细菌总DNA内含物的特异性分离具有包括a-g特点的优点且可以作为确实有效的方法引入微生物诊断实践(公共健康、临床应用、水和食品卫生)中。以上述实例为基础，可见在细菌核酸类的分子诊断之前的预分析阶段的细胞破碎和核酸提取方法都不会涉及初始样品的活的和非活的细胞群体的分离。对后两种细胞条件进行区别会严重影响分离细菌总DNA内含物还有下游分子应用的结果。类似于真核细胞，细菌细胞群体的动力学也由受到细胞外和细胞内因素影响的细胞繁殖和细胞死亡来调节。鉴于该原因，当分离公共健康卫生样品的细菌总DNA内含物时，细胞死亡的现象是不容忽视的因素。在生物体系中，一种细胞死亡为坏死，即由物理的和/或化学的和/或生物的效应诱发的细胞损伤，例如可以是由增加的细胞膜和细胞壁的被动渗透性、细胞组分的分解、细胞组织的分离和细胞内容物的脱离所形容的过程，通常是由细胞降解所形容的过程[Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease:8thedition, Saunders, Elsevier, 2010],在该过程中源于坏死细胞的分解产物对邻近的其他细胞具有毒性效应。在生物体系中，另一种细胞死亡为凋亡，即在真核细胞中清晰的程序化细胞死亡[Diaz L. F. et al. (2005) :Cell Death and Differentiation 12:1449-1456·]。后一种细胞死亡是由环境刺激影响的基因控制下的活动过程(例如在个体的不同时期的代谢活动中伴随着变化的形态重排)，在该过程中，由于细胞膜的结构改变(例如磷脂酰丝氨酸不对称性的损失、转运过程的改变)细胞的附着能力和膨胀降低，且随着细胞内酶的分裂出现了细胞收缩，在该过程中，DNA内含物变为片段，在该过程的末尾，已经经历了凋亡的细胞被邻近的其他细胞使用。在所谓对原核细胞群体的环境压力适应方面，逐步增多的数据涉及凋亡机制的作用[Lewis K. (2000) :Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:503-514. , KooninE. V. , AravindL. (2002):Cell Death and Differentiation 9:394-404·]。其中一个实例为革兰氏阳性属杆菌或链霉菌和革兰氏阴性粘细菌的孢子形成，这驱使细胞随着母细胞中诱导的自溶酶进入程序化的细胞死亡。在大量革兰氏阴性细菌中不可培养的变异的适应性出现也可以作为实例在此提出[Hochman A. (1997) !Critical Rev.Microbiol. 23:207-214.]。对于公共健康卫生测试样品的细菌总DNA内含物的分离而言，分离活的和非活的细胞群体之前的步骤具有诊断重要性。因此，根据本发明方法的另一个目的是制定确保活的和非活的细菌细胞分离和支持专门从活细胞中分离总DNA内含物的分离方法。上述细胞死亡的标准可以解释我们观察到的现象，根据该标准，在我们的测试样本中，坏死的复合物出现在非活的细菌细胞的表面上，所述复合物导致了该细胞群体的聚集。我们还观察到非活细胞的水合物改变了，其较低的悬浮率与活细胞的悬浮率不同，且细胞表面积与细胞体积的比例也改变了。我们认识到基于以上物理-化学的特征，活的和非活的细菌细胞可以被明显分开，如果使用了含有优选为Triton X-100、乙二胺四乙酸、KCl或NaCl、柠檬酸-I-水合物的合适的洗涤剂和电解质的缓冲混合物的溶液，即我们所谓清除非活细胞的缓冲液，那么通过改变影响沉淀的离心场强使细胞沉淀。我们假设由于在坏死的细菌的水合物中的变化，细胞表面积、细胞体积即细胞大小和密度也将改变，与合适选择的场强一起，所述改变是离心引起的沉淀过程中的区分因素。当研究真核细胞的实例时，由合适场强下的离心引起的活的和非活的细胞分离在 细胞尺寸和密度/水合的基础上发生。结果，非活细胞团出现在上清液中，而活细胞团出现在沉淀中[Fisher D. et al. :Cell Separation:A Practical Approach, Oxford Univ.Press, 1998.]。然而，必须考虑即使在相应的离心场强，所述分离也经常是不完全的，且少量活细胞也可以在上清液中检测到。为弥补以上不足的进一步的分离可能性为用于具有不同尺寸和密度的细胞分离的密度梯度离心法，且如果必要的话，进一步的补充分离方法可以为个体沉淀部分的体外培养。上述分离步骤的级别显然是耗时的，且在该分离步骤中，细胞损失的可能性会增加，使下游应用的精度降低。然而，初始测试样品的细胞团维持在活的和非活的细胞分离中是重要的，所述分离是用于专门的活细菌总DNA内含物的特异性分离。以上述内容为基础，在本方法中，活的和非活的细胞的区分是基于两种细胞条件的不同细胞尺寸特征，也基于由细胞膜的结构转变和变化的离子亲和性造成的不同渗透性和水合作用。用流动血细胞计数器检查根据本方法造成的区别。流动血细胞计数器的用途是基于水动力聚集的细胞悬浮液以如下方式穿过单色激光束在一定时间逐一经过检测窗的细胞将光线散射为向前和向侧面以适合细胞的尺寸和内在组织(向前的散射一尺寸)(向侧面的散射一内在组织)，且光线由光学体系送到检测器。到达检测器的信号由仪器进行电子收集，并以散布图或柱状图(钟形曲线)的形式显示。在本例中认为细胞尺寸是用于进行区分活的和非活的细胞的基础(参见说明书)。散布图和柱状图显示了可以配给一定细胞尺寸的细胞的量，因此对于本领域的技术人员而言显然流动血细胞计数法适于研究中样品的活的和非活的细胞群体的仪器定量分析[ShapiroH. M. !Practical Flow Cytometry, 2nd Edition, John ffiley&Sons, New York, 1988]。我们认识到用除去非活细胞的缓冲液反复洗涤样品数次之后并在给定条件下离心之后，非活细胞保留在上清液中，而活的细菌细胞可以选择性地沉淀并进行DNA分离。当我们检测沉淀中和上清液中存在的活的和非活的细胞时，我们的认识由上述流动血细胞计数检测得到了证实。结果总结于图I中的散布图和柱状图Ia和Ib中。(关于详细的阐述，参见
)。此刻，使用我们开发的去除非活细胞的缓冲液处理的测试样品中分离的含有活细胞的沉淀，可以开始进行DNA分离的方法(裂解、DNA结合、洗涤、洗提)。
在本实验过程中，我们成功地开发出结合双链DNA的载体基质，使用该技术，双链DNA在细胞裂解后直接并选择性地结合，而没有裂解样品的污染抑制剂组分。在所述结合双链DNA的载体基质中，优选使用含有化学激活的-OH和十二烷胺基团的-SiO2-TiO2-基质。如果激活的十二烷胺基团与十二烷胺连接物预交联，则为特别优选的。使用所述交联的基质，用于靶向结合特异性反应的条件产生于抑制复杂样品(血、排泄物、土壤)的污染和残留抑制剂组分结合时。用低CFU (菌落形成单位)滴度进行薄测试样品的总DNA内含物的选择性分离证明了本方法的敏感性(参见图2及其详细说明)。本发明的主题是一种用于不同样品的细菌总DNA内含物的特异性分离方法，在所述方法的过程中清除非活细胞，裂解维持的活细胞，选择性结合裂解物中的总DNA内含物，对结合的总DNA内含物洗涤并脱盐，然后从水溶液中的结合表面洗提脱盐的核酸。关于样品，我们是指公共健康卫生测试物质如水、食品、临床物品、固体和液体的环境物质、以及液体夹带的空气，其细菌细胞群体在细胞裂解破碎之前，在取样后或富集前用我们的 去除非活细胞的缓冲液直接处理。使用去除了非活细胞的缓冲液的重要性是，基于它们不同的细胞表面物理-化学特性，区分非活和活细菌细胞，因此只来自活细胞裂解物的双链DNA结合到DNA-结合载体基质上，所述基质优选含有化学激活的-OH和十二烷胺基团的-SiO2-TiO2-基质，优选地与十二烷胺连接物预先交联。在DNA结合载体基质上，通过加入海藻糖或葡聚糖和BSA阻止了非特异性二级连接。在所述方法的优选实施方式中，所述活的和非活的细菌细胞基于以上列举的其不同的细胞表面渗透性和离子亲和性而被区分。在所述方法的进一步优选的实施方式中，将不同渗透的洗涤溶液用于区分活的和非活的细菌细胞。例如，使用含有洗涤剂、电解质的洗涤溶液，优选为缓冲混合物(关于组分参见图4-表I)中的Triton X-100、乙二胺四乙酸、KCl或NaCl、柠檬酸-I-水合物，并改变影响细胞沉淀的离心场强。在本方法中，在专门制备的破碎用的试管中，用机械破碎或结合机械与酶破碎进行活细菌细胞的裂解，后者优选为溶菌酶消化。细菌细胞的机械破碎用台式设备进行。实际上，在根据本发明的方法中，用含有氧化还原组分、螯合剂和洗涤剂的裂解缓冲液，优选含有二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、TritonX-IOO和十二烷基硫酸钠(SDS)的裂解缓冲液分离至少104CFU/ml细菌样品的双链DNA内含物。在细菌裂解物的沉淀过程中，分离源于活细菌细胞的污染的色素染料与进一步的PCR抑制剂(叶啉、血红素化合物、多环芳烃物质)，这是因为裂解缓冲液还为这些物质的沉淀提供了优选的物理-化学环境。在根据本发明方法的更优选的实施方式中，源于活细菌细胞的裂解物的双链DNA的无降解选择性结合在含有化学激活的-OH和十二烷胺基团的-SiO2-TiO2-基质(关于组成参见图5-表3)上进行，所述基质与十二烷胺连接物预先交联。在所述基质上，通过加入海藻糖或葡聚糖和BSA，阻止了非特异性二级连接(RNA、蛋白、其它大分子)。用UV分光光度计在260nm和280nm的波长检测分离的双链DNA的数量和质量(纯度)，并比较了 OD26tl和OD28tl消光值。半定量测试是分离的DNA的体外PCR扩增之后常规的琼脂糖凝胶电泳(关于实施例参见图3及其详细说明)。
本发明还涉及适于提取上述方法的实施方式中细菌总DNA内含物的试剂盒，所述试剂盒首先用于分析水、食品、不同的公共表面和公共健康样品。试剂盒组成的结构图可见于图6中(关于详细解释参见
)。
以下详细阐释了附I.使用流动血细胞计数法证明了细菌总DNA内含物分离之前非活细胞去除的效率。X轴显示了细胞尺寸，而y轴显示了对应于一定尺寸的细胞数量。图Ia显示了离心后用我们制备的去除非活细胞的缓冲液处理过的细菌细胞沉淀部分的流动血细胞计数法散布图(点)和柱状图(钟形曲线)(关于缓冲液组成参见图4-表I)。图Ib显示了离心后未用去除了非活细胞的缓冲液处理的细菌细胞沉淀部分的流动血细胞计数法散布图(点)和柱状图(钟形曲线)。比较两图，从图Ia可见，由于用去除了非活细胞的缓冲液处理，活的、等径的、水合的细胞可以在均质部分(在图中指“微粒”)中沉淀，而轻微水合或完全未水合的坏死细胞留在上清液中。从图Ib中，当未用去除了非活细胞的缓冲液处理样品细胞时， 沉淀(微粒)的组成为非均质的，另一个附加部分显示于活细胞的旁边，柱状图被虚假地延展了。图2.从具有低CFU滴度(CFU/100ml)的水样中根据本方法分离细菌总DNA内含物，比较可以应用于样品数(X轴)的细胞数量对数值(y轴，具有四边形的下曲线)和分离的DNA产量(y轴，具有三角形的上曲线)。从不同稀释度的水样中，即嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)的不同CFU滴度中，分离细菌总DNA内含物。由本分离方法得到的细菌DNA产量(μ g/ml)的回归线流量和初始细胞数的回归线流量相似，但对DNA产量而言，具有较大的斜率。在相似的回归线流量的基础上，可以断定由本方法进行的细菌总DNA分离可靠地与初始细胞数量一致。即使在较大DNA产量的回归线斜率的情况下且即使在明显稀释(对应于X轴上样品数5至8的y轴下曲线上的CFU值)的情况下，也可以优选地分离DNA(对应于X轴上样品数5至8的y轴上曲线上的μ g/ml值)，这一事实驱使我们推断出根据本方法的双链DNA分离在细胞低滴度的情况下也是可靠的，即在高稀释度的情况下也是可靠的。因此根据本方法的DNA分离证明是敏感的。图3.在E.大肠杆菌的实例中，用琼脂糖凝胶电泳法对以本发明方法分离的细菌总DNA进行半定量分析。在半定量方法的过程中，首先从基质表面洗提的无抑制剂的DNA参加PCR反应，接着使用用于UV激发诱导的荧光发射的DNA-插入染色溴化乙啶以琼脂糖凝胶电泳分析增殖的多核苷酸。基于该图所示的密度带，本分离方法的敏感阈为IO4CFU/ml。在琼脂糖凝胶的最左边柱图中，可见分子量基准多核苷酸电泳图，其他柱图显示了水样的E.大肠杆菌中分离的总DNA的PCR扩增产物的电泳图。柱图顶端所显示的从IO8XCFU/mlUO6XCFU/mlUO4XCFU/ml的细菌滴度分离的DNA在10个独立的重现中出现。图4和5.表I至5记载了根据本发明方法的可能的实施条件的细节，如去除非活细胞的缓冲液、裂解缓冲液、结合基质、脱盐-洗涤缓冲液和洗提液的组分和PH值范围。图6.用于细菌总DNA内含物的特异性分离的试剂盒组成。所示试剂盒用于处理42个样品。在该图中，可见用于微生物DNA分离的复合整体分离体系。该试剂盒包含去除非活细胞之后在方法步骤中使用的溶液，如裂解缓冲液、结合基质、脱盐-洗涤缓冲液和洗提液，以及用途和设置实施例中所述的破碎试管，以适合当前的需要。
具体实施例方式以下我们总结了本申请可能的实施方式的优点。在实施方式中，优选地应该遵守下列图4和5的表的指导。I)表I说明根据本发明适于分离活的和非活的细胞的缓冲洗涤溶液的优选组成。由于分离了活的和非活的细胞，我们只从公共健康卫生样品的活细胞中进行了总DNA内含物的分离。2)在根据表2的含有还原二硫苏糖醇、阴离子十二烷基硫酸钠(SDS)和非离子洗涤剂(Triton X-100)的裂解缓冲液中，在碱性Tris-HCl缓冲液的环境中，在二价离子螯合齐IJ(EDTA)存在的情况下，与普通的裂解缓冲液不同，优选地，破碎的细菌细胞中DNA的完整得到了很好的保持。 如果根据本发明的裂解缓冲液与我们制备的含有玻璃填料和钢珠的破坏试管相结合，则产生了破碎方法，所述方法适合自动的DNA制备和基于机械破坏的样品处理体系。3)第二点所述的裂解缓冲液也可以有效地结合以溶菌酶进行的常规破碎。4)使用表3所示组分的混合物，我们开发了一种DNA结合载体基质，细菌细胞裂解后，DNA以相当高的程度与所述基质直接结合，结合能力在20 μ g/100mg以上的数量级。根据本方法的DNA结合表面为含有化学激活的-OH和十二烷胺基团的-SiO2-TiO2-基质，优选与十二烷胺连接物交联，所述基质在根据表3的环境中选择性地且专门地结合双链DNA，且绝对不会结合源自生物样品的常见PCR抑制剂(例如卟啉、胆红素)。在所述基质上，通过加入海藻糖或葡聚糖以及BSA阻止了非特异性二级连接(RNA、蛋白、其他大分子)。根据我们的经验，失活的离液序列高的组分盐酸胍证实是优选的。5)使用根据表4的脱盐洗涤缓冲液，在二价离子螯合剂存在的情况下，在两个洗涤步骤内，以短离心时间容易地从结合DNA的载体基质表面上所结合的DNA中去除了污染物。6)用根据表5的PCR级水从结合表面洗提根据表3的结合DNA的载体基质表面上所结合的并用根据表4的脱盐洗涤缓冲液处理过的DNA。7)根据第6点洗提的DNA纯度的平均特征值为0D=26(I/0D28(I=1. 8用本方法进行的两个独立的分离之间纯度的特征结合CV值为9%根据第6点洗提的DNA的平均浓度为6至60 μ g/ml，特征结合CV值为7. 5%根据第6点洗提的DNA的平均片段为5至12千碱基(kb)，特征结合CV值为15%用根据本发明方法进行的DNA分离的最低初始细菌数为104CFU/ml，特征结合CV值为10. 5%8)使用结合DNA的载体基质，从不同细菌数滴度中分离的总DNA量由半定量检测进行了合适地分析(参见图3及其说明)。在半定量检测的过程中，首先从基质表面洗提的无抑制剂的DNA参加了 PCR反应，然后用UV暴露条件下通过DNA插入染色溴化乙啶放出的荧光密度，在常规的琼脂糖凝胶电泳中检测增殖的多核苷酸(参见说明书)。9)本方法的又一个特殊的特征为，可以制备的细菌DNA尺寸最低为直链聚合核酸的500-1500个碱基对(bp)，且不优选用本方法制备小于该尺寸的DNA。本方法的又一个优点为提取的DNA的物理-化学维持，其纯度和浓度使其适用于下游PCR应用。本发明的又一个优点为发明可以快速完成，且使用为该目的制备的裂解缓冲液，本发明可以与常规的和替代的提取方法结合。以下叙述了根据本发明的几个可能的实施方式，本发明的保护范围并非限于这些实施例。实施方式的实施例用于细菌总DNA内含物分离的理想机会可能是在水、食品、临床样品、固体和液体环境样品、以及夹带液体的气体样品等样品中进行。
在实施方式中，优选地应该遵守下列图4和5的表的指导。A/用机械和酶处理进行样品破碎为常规分子生物实验仪器和分离设备(例如FastPrep )优化的反应方法的第一阶段/从样品中去除非活细胞I.将液体培养的细菌样品在室温(RT)沉淀lOmin。2.将样品的液相转移至干净、无菌的离心试管中。3.将转移的样品离心3. OOOrpm, Imin, 25° C。4.除去上清液，然后将沉淀在5ml的去除非活细胞的缓冲液(关于缓冲液的组成和pH值，参见表I)中彻底悬浮。5.用涡流搅拌器将悬浮液彻底混合。6.将悬浮液离心3. OOOrpm, Imin, 25。C。7.除去上清液，然后将沉淀在5ml的去除非活细胞的缓冲液(关于缓冲液的组成和pH值，参见表I)中彻底悬浮。8.用涡流搅拌器将悬浮液彻底混合。9.将悬浮液离心2. OOOrpm, Imin, 25° C。10.除去上清液，然后将沉淀在Iml的去除非活细胞的缓冲液(关于缓冲液的组成和pH值，参见表I)中彻底悬浮。11.用涡流搅拌器将悬浮液彻底混合。12.将悬浮液离心I. OOOrpm, 3min, 4。C。13.将沉淀重新溶解于O. 2至O. 5ml的O. IM的Tris-HCl (pH=7. 5)缓冲液中。14.样品准备进行细胞裂解。该方法第一阶段的必要特征如下a)储液在+4° C下储存。b)当制备储液时，必须严格遵守关于PCR方法的标准实验室章程(ENIS020838:2006, GLP)οc)以最低安全级别BSL2 (生物安全级别2)，在严格的无菌室环境(ISO209, FS209, BS5295, ISO 14644-1:1999)内工作。方法的第二阶段/细胞裂解和在载体基质表面结合双链DNAI.将根据方法第一阶段的步骤I至14处理过的样品转移到2ml的破坏试管中，该试管含有O. Ig的玻璃填料和具有4. 5" (4. 5X25. 4mm)的尺寸的CR-Va-钢珠。2.将含有样品的破坏试管置于均质化的非对称破碎机(例如FastPrep )中，然后开始旋转破碎。30秒后可以转移样品。3.以100 μ g/ml的最终浓度向样品中加入溶菌酶，并在37° C培养15分钟。然后可以转移样品。
4.向经过机械和酶处理过的样品中加入Iml裂解缓冲液(根据表2的组成和pH值)。保持室温1-2分钟。5.离心悬浮液13. OOOrpm, 5min. , 4。C。6.将800 μ I的上清液转移至干净无菌的2. 5ml离心试管内。7.加入800 μ I的DNA结合基质(根据表3的组成和pH值)。封闭离心试管。8.小心旋转悬浮液10至15次。在该步骤中不要以任何方式使用涡流搅拌器。9.在室温培养2分钟，在较大间隔内缓慢旋转试管。10.离心悬浮液12. OOOrpm, lmin。除去上清液。11.在700μ1的脱盐洗涤缓冲液(根据表4的组成和pH值)中悬浮沉淀物。12.离心悬浮液12. OOOrpm, lmin。除去上清液。13.在500μ I的脱盐洗涤缓冲液(根据表4的组成和pH值)中悬浮沉淀物。14.离心悬浮液12. OOOrpm, 30sec。除去上清液。15.不要接触或搅动基质，小心除去沉淀物上面的剩余上清液。16.令基质干燥2min，37。C。17.向干燥的基质沉淀物中加入100至120 μ I的洗提液(参见表5)。悬浮沉淀物。18.在室温下保持lmin。19.离心12. OOOrpm, lmin。20.将上清液转移至干净无菌的不含脱氧核糖核酸酶的离心试管中。21.分离的DNA可以进行下游应用。该方法第二阶段的必要特征如下a)除了 DNA结合基质保存在室温，溶液和组分都在+4…+8° C储存。b)当制备储液时，必须严格遵守关于PCR方法的标准实验室章程(ENIS020838:2006, GLP)οc)以最低安全级别BSL2 (生物安全级别2)，在严格的无菌室环境(ISO209, FS209, BS5295, ISO 14644-1:1999)内工作。方法的第三阶段/数量和质量控制在λ =260nm的波长，用UV分光光度的常规实验方法确定分离的DNA的浓度。用在λ =260nm和λ =280nm的波长测量的光密度值之比表征分离的DNA纯度。该方法第三阶段的必要特征如下a)在分光光度法的过程中，严格遵守关于PCR方法的标准实验室章程(ENIS020838:2006, GLP)。b)以最低安全级别BSL2 (生物安全级别2)，在严格的无菌室环境(ISO209, FS209, BS5295, ISO 14644-1:1999)内工作。
B/用机械处理进行样品破碎为常规分子生物实验仪器和分离设备(例如FastPrep )优化的反应方法的第一阶段/从样品中去除非活细菌细胞该方法的步骤和必要特征与在样品破碎A的第一阶段中叙述的步骤和特征相同。方法的第二阶段/细胞裂解和在载体基质表面结合双链DNAI)将根据方法第一阶段的步骤I至14处理过的样品转移到2ml的破坏试管中，该试管含有O. Ig的玻璃填料和具有4. 5" (4. 5X25. 4mm)的尺寸的CR-Va-钢珠。2)将含有样品的破坏试管置于均质化的非对称破碎机(例如FastPrep )中，然后开始旋转破碎。30秒后可以转移样品。
3)向机械处理过的样品中加入Iml裂解缓冲液(根据表2的组成和pH值)。在室温保持1-2分钟。4)离心悬浮液13. OOOrpm, 5min. , 4。C。5)将800 μ I的上清液转移至干净无菌的2. 5ml离心试管内。6)加入800 μ I的DNA结合基质(根据表3的组成和pH值)。封闭离心试管。7)小心旋转悬浮液10至15次。在该步骤中不要以任何方式使用涡流搅拌器。8 )在室温培养2分钟，在较大间隔内缓慢旋转试管。9)离心悬浮液12. OOOrpm, lmin。除去上清液。10)在700 μ I的脱盐洗涤缓冲液(根据表4的组成和pH值)中悬浮沉淀物。11)离心悬浮液12. OOOrpm, lmin。除去上清液。12)在500 μ I的脱盐洗涤缓冲液(根据表4的组成和pH值)中悬浮沉淀物。13)离心悬浮液12. OOOrpm, 30sec。除去上清液。14)不要接触或搅动基质，小心除去沉淀物上面的剩余上清液。15)令基质干燥2min, 37。C。16)向干燥的基质沉淀物中加入100至120 μ I的洗提液(参见表5)。悬浮沉淀物。17)在室温下保持lmin。18)离心12. OOOrpm, lmin。19)将上清液转移至干净无菌的不含脱氧核糖核酸酶的离心试管中。20)分离的DNA可以进行下游应用。该方法第二阶段的必要特征如下a)除了 DNA结合基质保存在室温，溶液和组分都在+4…+8° C储存。b)当制备储液时，必须严格遵守关于PCR方法的标准实验室章程(ENIS020838:2006, GLP)οc)以最低安全级别BSL2 (生物安全级别2)，在严格的无菌室环境(ISO209, FS209, BS5295, ISO 14644-1:1999)内工作。方法的第三阶段/数量和质量控制在λ =260nm的波长，用UV分光光度的常规实验方法确定分离的DNA的浓度。用在λ =260nm和λ =280nm的波长测量的光密度值之比表征分离的DNA纯度。该方法第三阶段的必要特征如下a)在分光光度法的过程中，严格遵守关于PCR方法的标准实验室章程(ENIS020838:2006, GLP)。b)以最低安全级别BSL2 (生物安全级别2)，在严格的无菌室环境(ISO209, FS209, BS5295, ISO 14644-1:1999)内工作。C/用酶裂解进行样品破碎为常规分子生物实验仪器优化的反应方法的第一阶段/从样品中去除非活细菌细胞该方法的步骤和必要特征与在样品破碎A的第一阶段中叙述的步骤和特征相同。方法的第二阶段/细胞裂解和在载体基质表面结合双链DNAI.以100 μ g/ml的最终浓度向根据方法第一阶段的步骤I至14处理过的样品中 加入溶菌酶，并在37° C培养15分钟。然后可以转移样品。2.向酶处理过的样品中加入Iml裂解缓冲液(根据表2的组成和pH值)。在室温保持1-2分钟。3.离心悬浮液13. OOOrpm, 5min. , 4。C。4.将800 μ I的上清液转移至干净无菌的2. 5ml离心试管内。5.加入800 μ I的DNA结合基质(根据表3的组成和pH值)。封闭离心试管。6.小心旋转悬浮液10至15次。在该步骤中不要以任何方式使用涡流搅拌器。7.在室温培养2分钟，在较大间隔内缓慢旋转试管。8.离心悬浮液12. OOOrpm, lmin。除去上清液。9.在700 μ I的脱盐洗涤缓冲液(根据表4的组成和pH值)中悬浮沉淀物。10.离心悬浮液12. OOOrpm, lmin。除去上清液。11.在500 μ I的脱盐洗涤缓冲液(根据表4的组成和pH值)中悬浮沉淀物。12.离心悬浮液12. OOOrpm, 30sec。除去上清液。13.不要接触或搅动基质，小心除去沉淀物上面的剩余上清液。14.令基质干燥2min, 37。C。15.向干燥的基质沉淀物中加入100至120 μ I的洗提液(参见表5)。悬浮沉淀物。16.在室温下保持lmin。17.离心12. OOOrpm, lmin。18.将上清液转移至干净无菌的不含脱氧核糖核酸酶的离心试管中。19.分离的DNA可进行下游应用。该方法第二阶段的必要特征如下a)除了 DNA结合基质保存在室温，溶液和组分都在+4…+8° C储存。b)当制备储液时，必须严格遵守关于PCR方法的标准实验室章程(ENIS020838:2006, GLP)οc)以最低安全级别BSL2 (生物安全级别2)，在严格的无菌室环境(ISO209, FS209, BS5295, ISO 14644-1:1999)内工作。方法的第三阶段/数量和质量控制在λ =260nm的波长，用UV分光光度的常规实验方法确定分离的DNA的浓度。用在λ =260nm和λ =280nm的波长测量的光密度值之比表征分离的DNA纯度。
该方法第三阶段的必要特征如下a)在分光光度法的过程中，严格遵守关于PCR方法的标准实验室章程(ENIS020838:2006, GLP)。b)以最低安全级别BSL2 (生物安全级别2)，在严格的无菌室环境(ISO209, FS209, BS5295, ISO 14644-1:1999)内工作。对于实施方式的实施例中所述方法步骤的实施而言，优选使用以下设备BSL2II级A2型薄层工作台、涡流搅拌器、冷冻实验室离心机和冷冻微型离心机，2ml试管培养器，可以为水浴。可选地，可以使用支持自动破 碎的机械破碎机(例如FastPr印 、TeenPrep ,BigPrep 等)。本发明的技术优势之一表示为良好的测量技术参数。根据该优势，在两个独立的分离之间，表征纯度的合并方差(CV%)很低，在106CFU/ml细菌菌落的情况下为7. 5至8. 5%。分离特异性为95%，重现可靠性为85%。本双链DNA分离方法的动态范围是IO4至IO8CFU/ml (IOOmg样品)的细菌菌落。本发明的另一个技术优势为其敏感性DNA分离需要的最少细胞，即本方法的应用性底限的绝对值为104CFU/ml±15%。本发明的第三个优势为其快捷性，这意味着随着非活细胞的快速去除，细菌的总DNA内含物可以在约半小时内分离。在本发明的经济优势中，首先再次提到快捷性。快速去除非活细胞之后，持续约半小时的DNA分离在公共健康卫生监测的诸如PCR分析的下游应用中提供了快速结果，如果必要的话，该结果在依据质量控制体系运行的公司(水厂、食品加工厂)中引起了及时的干预。结果，由于产品问题和控制测试或者必要的撤回产品所需的时间短，因此没有时间损失。用于细菌总DNA内含物分离方法的应用用户和领域为饮用水、废水、公共健康细菌和水厂的测试实验室、食品测试站、食品工业测试实验室、常规的细菌实验室、车间卫生以及工业和公共卫生实验室。用于根据本发明的DNA分离方法的实际实施方式的试剂盒的商业构造实施例的可能形式可见于图5中。在该图中可见用于微生物DNA分离的复合完整的分离体系。该试剂盒包含用于非活细胞去除后的程序步骤中的溶液(裂解缓冲液、结合基质、脱盐洗涤缓冲液、洗提液)以及用途实施例中所述的破坏试管。
权利要求
1.用于样品的细菌总DNA内含物的特异性分离方法，在所述方法的过程中裂解细胞，选择性结合所述裂解物的DNA内含物，洗涤所述DNA内含物，然后在水溶液中从所述结合表面上洗提所述脱盐的直链聚合核苷酸，其特征在于，基于非活细菌细胞和活细菌细胞不同的细胞表面的物理-化学特性，将所述非活细菌细胞预先从所述活细胞中分离，因此源自所述活细胞裂解物的双链DNA专门结合在含有化学激活的-OH和十二烷胺基团的-SiO2-TiO2-基质上。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，活的和非活的细菌细胞是基于它们不同的细胞表面渗透性和离子亲和性区分的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将不同渗透的洗涤溶液用于区分活的和非活的细菌细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述区分活的和非活的细菌细胞的过程中，使用含有洗涤剂、电解质的洗涤溶液，优选使用Triton X-100、乙二胺四乙酸、KCl或NaCl、柠檬酸-I-水合物的缓冲混合物，并改变影响所述细胞沉淀的离心场强。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活细菌细胞的裂解是在单独制备的破坏试管中，通过机械破碎或结合机械和酶破碎进行的，优选通过溶菌酶消化进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用台式设备进行所述细菌细胞的物理破碎。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，用含有氧化还原组分、螯合剂和洗涤剂的裂解缓冲液分离至少为104CFU/ml细菌样品的所述双链DNA内含物，所述裂解缓冲液优选含有二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Triton X-100和十二烷基硫酸钠(SDS)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在所述细菌裂解物的所述沉淀过程中，分离源自所述活细菌细胞中可能的染色剂与PCR抑制剂(叶啉、血红素化合物、多环芳烃物质)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，源自活细胞细菌的所述裂解物的所述双链DNA的所述无降解选择性结合是在-SiO2-TiO2-基质上进行的，所述基质包含化学激活的-OH和十二烷胺基团且与十二烷胺连接物预先交联，且通过加入海藻糖或葡聚糖以及BSA阻止了所述基质上的非特异性二级连接，实际为RNA、蛋白和其它大分子的连接。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其特征在于，在260nm的波长用UV分光光度计检测所述分离的双链DNA的量和纯度。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，还在280nm的波长用UV分光光度计检测所述分离的双链DNA的量和纯度，并比较所述OD26tl和所述OD28tl消光值。
12.为实现权利要求1-11的用于分离细菌总DNA内含物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的首要目的为分析水、食品、环境样品还有公共健康样品。
全文摘要
本申请公开了用于不同样品的细菌总DNA内含物的特异性分离方法，在所述方法的过程中，裂解所述细胞，选择性结合所述裂解物的DNA内含物，洗涤所述DNA内含物，然后在水溶液中从所述结合表面上洗提所述脱盐的直链聚合核苷酸。在细胞裂解之前，基于非活细菌细胞和活细菌细胞不同的细胞表面的物理-化学特性，将所述非活细菌细胞从所述活细胞中分离，将所述样品的所述活细胞保存然后用机械和/酶的方法裂解，优选溶菌酶的方法。此后，将源自活细胞的所述裂解物的双链DNA专门结合在含有化学激活的-OH和十二烷胺基团的-SiO2-TiO2-基质上，洗涤之后，在水溶液中所述洗提脱盐的直链聚合核苷酸。
文档编号C12N1/04GK102906262SQ201080066888
公开日2013年1月30日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者加博·基斯, 亚诺什·基斯, 卡塔林·斯通奇克, 乔治娜·贝尔纳特 申请人:戴阿冈有限公司