一种鉴定抑制人乳头状瘤病毒复制的化合物的方法和试剂盒的制作方法

专利名称：一种鉴定抑制人乳头状瘤病毒复制的化合物的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学、细胞生物系、细胞培养和药物开发。特别地，本发明提供一种筛选抗HPV物质的方法以及一种筛选抗HPV物质的试剂盒。
背景技术：
因为人类乳头状瘤病毒(HPV)与某些人类癌症相关，因此HPV—直是研究热点。HPV可感染上皮基底增殖细胞，诱导良性肿瘤形成。在某些情况下，感染可导致恶性肿瘤进展和形成。完整的乳头状瘤病毒包含一个环状双链DNA以及包裹在其周围的衣壳蛋白，DNA可分为编码区和非编码区。在乳头状瘤病毒编码区中已发现了 8个早期(E1-E8)开放读码框(ORF)和2个晚期(LI，L2)0RF。早期ORF编码的蛋白参与病毒DNA复制过程、连续的维持阶段和晚期扩增(El和E2)、病毒基因表达和染色体牵引调控(E2)、病毒组装(E4)、永生化和转化(E6和E7/仅高危型HPV)。仅在细胞分化后方激活晚期0RF，晚期ORF编码病毒衣壳蛋白(LI和L2)。在非编码上游调控区(URR)中，除了复制起始位点之外，还有启动子、增强子和其它调控元件。目前的观点将乳头状瘤病毒生命周期分为3个阶段。第一个阶段，在最初进入上皮基底层细胞核(复制必须的细胞器存在位点)后，PV基因组开始扩增，病毒DNA合成速度较染色体DNA快，其拷贝数升高(高达每个细胞50-300个拷贝)(可参阅以下综述KadajaM, Silla T, Ustav E, Ustav M. Papillomavirus DNA replication-from initiation togenomic instability. Virology. 2009Feb 20; 384 (2) : 360—8.)。第二个阶段代表 HPV DNA稳定复制S期，其与染色体复制同步，而且由于病毒基因组分隔进入子代细胞，病毒DNA作为染色体外多拷贝细胞核游离体。在这一阶段表达早期基因，而不合成衣壳蛋白LI和L2或进行病毒颗粒组装。早期基因产物提供转化蛋白，其可以确保被感染的细胞克隆扩增。如果被感染的细胞脱离基底膜并抵达皮肤或粘膜上层，它们会停止分裂并开始分化(角质化)。它会触发第三步，即营养期病毒DNA复制，在该过程中I)重新启动病毒DNA扩增；之后2)合成晚期蛋白并包装病毒颗粒(请参阅以下综述Kadaja M, Silla T, Ustav E, UstavM. Papillomavirus DNA replication-from initiation to genomic instability.Virology. 2009 Feb20;384(2):360-8.)。对于人类乳头状瘤病毒，建立细胞内这些复制阶段的模型会有问题。大多数组织培养细胞不支持任何模式的HPV基因组复制。在任何角质细胞系或原代角质细胞中，从β-乳头状瘤病毒转染质粒中获得病毒基因组DNA复制的尝试均告失败。同时，建立可增殖的携带稳定HPV复制基因组的人类细胞系也很困难，尤其是低危型HPV。仅有一些实验室完成了 HPV游离体的稳定复制。这些游离体仅能够在饲养层或移植培养物中存在。一株常用的HPV-16细胞系W12衍生于一个患者样本，但在培养W12单层细胞时，发生了整合，而不是维持病毒基因组的游离状态。 但是，当El和Ε2蛋白由不同表达载体产生时，在许多不同种属的不同细胞系中可对含有HPV复制起始位点的质粒进行复制。因此，限制仅在某些上皮细胞中复制的主要因素是病毒蛋白转录mRNA的胞内转录因子的协同表达可及性。目前已经开发了靶向HPV-16 和 HPV-18 或 HPV_6b, HPV-1I, HPV-16 和 HPV-18 的疫苗，并且这些疫苗已在许多国家上市。这可以被认为是人类与宫颈癌斗争的巨大成就。但是，这并不够，因为疫苗仅靶向成百上千种乳头状瘤病毒中的4个亚型，包括高危型粘膜或皮肤乳头状瘤病毒。此外，已有证据表明，在发达国家中，HPV-16和HPV-18是宫颈癌中广泛存在的病毒。根据发展中国家(如撒哈拉以南的非洲)对这些病毒传播的分子流行病学分析，目前其它病毒株正在流行，例如HPV-52和HPV-35。目前很需要一种小分子药物，其可用于有效阻断乳头状瘤病毒基因组的复制，从而降低细胞内的病毒载量，并避免病毒颗粒的生成，从而避免病毒的传播。但是，这一目标很难实现，这是因为目前缺乏针对候选药物筛选的有效的细胞体系。理想中的细胞体系应当能够与候选药物筛选的高通量和高含量模式相兼容，同时能够以重现性和经济有效的方式找到活性物质。J.Duan已在专利W00040082中描述了一种动物裸鼠移植瘤模型(一种)(A reproducible xenograft animal model for hosting and propagating humanpapillomavirus (HPV)), Kreider等在1993和1998发明了可用做病毒基因组宿主的原代角质细胞(US5541058，检测抗乳头状瘤病毒药物有效性的体外检测系统；US6200745，检测抗乳头状瘤病毒药物有效性的人类细胞系体外检测系统)。但是，这些方法仍不能满足候选药物的高通量筛选，因此需要一种更为简单和便捷的方法。我们小组之前发现了人骨肉瘤细胞系U20S能够支持HPV的体外培养的特性(K. Salk, 2009 Studies on the mechanismsof the DNA replication of high—and low-risk human papillomavirus in differentcell lines. MSc thesis / in Estonian/; University of Tartu Press)。但是，对于通过高通量筛选，靠游离HPV自身维持来发现潜在的HPV复制抑制剂是不够的。

发明内容

本发明提供一种鉴定抑制人乳头状瘤病毒(HPV)DNA复制的化合物的方法，以及鉴定抑制HPV DNA复制化合物的试剂盒。本发明提供一种方法，其中将HPV基因组或亚基因组DNA插入一种细胞系中，该细胞系可支持HPV DNA复制，从而确定一种化合物对HPV DNA复制的影响。U20S细胞系被发现是一种可支持HPV DNA复制的宿主细胞系。目前，根据本发明，U20S细胞可作为一种粘膜和皮肤组织特异性HPV扩增以及HPV基因组相关载体扩增的合适宿主细胞。我们还证实，HPV基因组的扩增复制，与病毒生命周期中生长期的扩增类似，使用常规培养基可将高密度HPV阳性U20S细胞克隆维持较长的一段时间(4-12天)。因此，本发明提供的方法可对复制的HPV DNA进行定量检测，或者更优选检测报告基因产物或报告基因编码的一种蛋白的反应产物，这样可筛选在HPV生命周期不同复制阶段中可抑制HPV DNA复制的因子a)起始扩增复制，经短暂复制试验验证；b) HPV DNA稳定复制，与细胞DNA复制同步化，可通过分析验证低至高HPV含量的亚克隆；和0)与病毒DNA复制生长期类似的扩增复制。此方法可广泛应用于药理学研究以及筛选预防或治疗各种HPV亚型感染的新型候选药物中。
本发明提供的鉴定抑制HPV DNA复制的化合物的方法包括以下步骤a.将能够进行HPV DNA短暂、稳定和营养期复制的全部或部分序列的HPVDNA导入能够在这类细胞中进行HPV DNA短暂、稳定和营养期复制的细胞系。b.生成携带染色体外HPV DNA (每个细胞中拷贝数不同)的稳定亚克隆的细胞库；c.将所选细胞亚克隆(不同HPV类型或拷贝数)培养为分裂中的分散单层细胞培养物，和/或将所选细胞亚克隆为高密度单层细胞培养物。d.将研究中的化合物应用于携带HPV DNA的所选亚克隆单层细胞物的培养皿中；e.评估化合物对细胞中病毒DNA维持和/或扩增的抑制作用；f.如果观察到某一浓度的化合物对HPV DNA复制有抑制作用，则将这一化合物作为HPV DNA复制的候选抑制剂。在优选的实施例中，本发明提供一种鉴定能够抑制HPV DNA潜伏复制的化合物的方法，其包括以下步骤a.携带可保证病毒复制循环所有步骤的所有病毒顺式序列和反式因子的HPV DNA全部或部分序列的质粒，其还可以包含一个报告基因，使用的方法类似但不限于电转或已知的化学转染方法，将该质粒导入人骨肉瘤细胞系U20S中；b. U20S细胞系克隆携带染色体外复制HPV质粒，可采用对抗生素类似G418或嘌呤霉素选择性标记物或已知的其它选择性标记物进行分离；c.培养鉴定出的携带不同HPV拷贝数(每个细胞)的细胞克隆，确定其稳定性，并生成这些细胞克隆的细胞库；d.将所选用于鉴定HPV潜伏期复制抑制剂的亚克隆细胞低密度接种于96孔或384孔培养板中，将细胞培养一段短暂时间，将HPV DNA复制维持在潜伏期；e.之后，在细胞融合之前，将所研究的化合物应用于细胞克隆单层培养物以鉴定潜伏期复制抑制剂；f.通过直接定量或半定量检测病毒DNA含量或测量插入HPV质粒的报告基因产物的含量来确定细胞中HPV拷贝数增减情况；g.如果观察到某一浓度的该化合物可抑制HPV DNA稳定复制，确定该化合物作为HPV DNA潜伏期复制的候选抑制剂。在另一优选的实施例中，本发明提供了一种鉴定能够抑制经诱导的HPV DNA营养期扩增复制的化合物的方法，其包括以下步骤a.携带可保证病毒复制循环所有步骤的所有病毒顺式序列和反式因子的HPV DNA全部或部分序列的质粒，其还可以包含一个报告基因，使用的方法类似但不限于电转或已知的化学转染方法，将该质粒导入人骨肉瘤细胞系U20S中；b. U20S细胞系克隆携带染色体外复制HPV质粒，可采用对抗生素类似G418或嘌呤霉素选择性标记物或已知的其它选择性标记物进行分离；c.对鉴定出的携带不同HPV拷贝数(每个细胞)的细胞克隆进行定性分析，确定其稳定性，测量扩增量，生成这些细胞克隆的细胞库；d.将所选的用于确定营养期扩增复制亚克隆细胞接种于96孔或384孔板中，通过再饲养至少4-12天达到细胞融合，从而启动对数扩增复制期，每个细胞中复制的游离体DNA拷贝数量增多 ；
e.之后，将所研究的化合物添加至已融合的U20S细胞克隆单层培养物细胞克隆单层培养物的培养基中以鉴定营养扩增期复制抑制剂；f.通过直接定量或半定量检测病毒DNA含量或测量插入HPV质粒的报告基因产物的含量来确定细胞中HPV拷贝数增减情况；g.如果观察到某一浓度的该化合物可抑制HPV DNA复制，确定该化合物作为HPVDNA营养扩增期复制的候选抑制剂。通过目前已知的任何方法确定抑制作用，其能够定量检测染色体外DNA (质粒)。但是，最优选的方法包括但不限于，将编码报告基因的核酸序列插入附加的复制载体中。这些报告基因可以编码任何已知的可直接检测到或测量到的蛋白，或催化一个反应的蛋白，其产物可通过，例如显微镜观察，进行定量或半定量测量。可测量的产物可能会留存在细胞内或被分泌到培养基中。这类报告基因包括但不限于dGFP、荧光素酶、分泌的碱性磷酸酶、Gaussia荧光素酶、dGFP-荧光素酶融合基因。优选，将报告基因的核酸序列插入HPV基因组区域中，其可编码L基因。最优选，报告基因的核酸序列包含HPV基因组的LI和L2基因。可从生成的细胞库中选择的亚克隆是从携带不同拷贝数的细胞中挑选的，其每个细胞中携带的HPV质粒拷贝数可由低至高。本发明提供的HPV亚型包括但不限于HPV-18, HPV-16, HPV_6b, HPV-1I, HPV-5和HPV-8。这些亚型属于HPV亚组中粘膜高危型、低危型和皮肤类型，这样其为检测抑制低危型和皮肤类型HPV的DNA复制的物质提供了之前从未揭露的方法。本发明中HPV DNA复制的潜伏期提供了 HPV感染的基底和上基部皮肤中分裂细胞中发生的病毒DNA复制模型。本发明提供的HPV复制的营养扩增复制期提供了上层细胞中非分裂细胞中病毒DNA复制过程的模型。 而且，本发明提供了一种鉴定能够抑制HPV DNA稳定和扩增期复制的化合物的试剂盒。该试剂盒至少包括人类骨肉瘤细胞系U20S，或另一株能够稳定复制HPV DNA的细胞系；一种游离体维持型载体，其包含携带LI和L2基因的HPV DNA的全部或部分序列，并包含用于导入细胞系中的报告基因；一个化合物或一个化合物库，可筛选抗HPV活性；以及一种评估细胞中HPV DNA转录活性的方法。从而，我们提供的实验性数据说明，U20S细胞系能够支持HPV DNA复制，包括在建系时，潜伏维持期以及未预期的诱导的病毒DNA扩增指数期现象，其可模拟感染的营养期。


图1-4. HPV粘膜高危型、低危型和皮肤类型亚组的短暂DNA复制试验将U20S 细胞转染 HPV-16 基因组(图 l)、HPV-6b、HPV_ll 和 HPV-18 基因组(图 2);HPV-5和HPV-8基因组(图3和图4)并进行短期复制试验。在转染前，从质粒骨架中切去HPV DNA =EcoRI酶切pBR322载体，获得HPV-18基因组；BamHI酶切pBR322载体，获得HPV_6b基因组；BamHI酶切pUC19载体，获得HPV-16和HPV-1l基因组；BamHI酶切pUC9载体，获得HPV-8基因组；SacI酶切pBR322载体，获得HPV-5基因组。在低DNA浓度下(5 μ g/ml)，将线性化的HPV片段(ca 8 kb)在4度下重新连接16小时。图1.检测导入的粘膜型HR-HPV16报告基因质粒的量效关系将1，2，和5ygHPV-16基因组的重新连接的环状质粒导入U20S细胞。在转染后24、48、72和96小时通过Hirt裂解法提取低分子量DNA，并使用线性化酶BamHI和细菌甲基化敏感性DpnI进行限制性内切酶分析。对于Southern杂交,采用全长HPV-16特异性探针。线性化8kb条带强度随时间增强(如箭头所示)，这可提示这些细胞中的病毒基因组复制情况。复制信号也随浓度独立增加。图 2.建立 LR-HPV-6b, LR-HPV-1I 和 HR-HPV-18DNA 复制。将 5 μ g HPV-6b, HPV-1I和HPV-18基因组的重新连接的环状质粒DNA导入U20S细胞中。除DpnI外，用合适的线性化酶(查看标记物)酶切Hirt法裂解样本，用放射性标记的HPV基因组特异性探针通过Southern杂交检测复制后的HPV DNA信号。对于3种研究的乳头状瘤病毒类型，ca 8 kb的线性化DpnI抗性复制信号随时间增加。图3.建立皮肤型HPV-5基因组DNA复制。将重新连接的HPV-5基因组环状质粒DNA(2，5，10 μ g)滴入U20S细胞中，并加入Hirt法裂解样本(用Sac l/Dpnl处理游离DNA)，采用Southern杂交方法，使用全长HPV-5基因组探针(箭头)在转染后24、48、72、96小时检测病毒DNA扩增情况。图4.建立皮肤型HPV-8基因组DNA复制。将重新连接的HPV-8基因组环状质粒DNA (2，5，10 μ g)滴入U20S细胞中。如箭头所示，线性化8kb的HPV-8基因组复制的游离DNA(用BamHIl/Dpnl处理Hirt法裂解样本)，其随时间和浓度增加。图5-图12.在U20S细胞中稳定维持HPV基因组。图5. U20S细胞中高/低危型HPV质粒的稳定DNA复制。将5yg重新连接的HPV-6b, -11，-16，-18 环状质粒与 5 μ g AraD 载体 DNA 和 2 μ g Eco0109I_ 线性化 pNeo-EGFP导入U20S细胞。转染后48小时，加入G418筛选，在转染后生长约3周时挑选。采用Hirt方法抽提母细胞库的低分子量染色体外DNA样本，并进行分析。用线性化酶对样本进行酶切，然后采用Southern杂交方法，用混合的放射性标记的HPV探针检测HPV信号。同样示转染后在无G418筛选下培养3周的DNA样本。图6-12. U20S细胞系中不同HPV亚型的单细胞亚克隆Southern杂交分析。将5 μ g再连接的患者HPV质粒与5 μ g载体DNA(AraD)和2 μ g线性化的pNeo-EGFP或pBabeNeo质粒导入U20S细胞中。转染后48小时开始进行G418筛选，持续约3周。在每个IOOmm培养皿中接种从母细胞库中转移出的5000、10 000和50 000个细胞，然后分离单细胞克隆，培养并进行分析。采用标准方法分离整个基因组DNA。将10 μ g线性化的全细胞DNA进行凝胶分析，并用合适的放射性标记的HPV基因组特异性探针进行Southern杂交。根据标记物泳道的标准曲线估算拷贝数量。然后生成这些细胞克隆的细胞库。图6.含有不同浓度稳定型HPV-18质粒的系列HR-HPV18阳性U20S细胞系。采用Southern杂交方法，用放射性标记的全长HPV-18基因组特异性探针对10 μ g EcoRI线性化的全细胞DNA进行分析。克隆数如图中系列上方所示，计算出的拷贝数如标记物泳道所示。鉴定出的细胞克隆每个细胞中携带不同数量的HPV-18拷贝。图7.对HR-HPV16阳性克隆细胞群进行分析。采用Southern杂交方法，用放射性标记的全长HPV-16基因组特异性探针对10 μ g BamHI线性化的全细胞DNA进行分析。计算出的拷贝数和克隆数如图所示。筛选得到的细胞克隆每个细胞中携带不同数量的HPV-16拷贝，包含低拷贝至高拷贝。图8.含有不同浓度稳定型HPV-1l质粒的系列LR-HPVll阳性U20S细胞系。采用Southern杂交方法，用放射性标记的全长HPV-1I基因组特异性探针对10 μ g BamHI线性化的全细胞DNA进行分析。计算出的拷贝数和克隆数如图所示。筛选得到的细胞克隆每个细胞中携带不同数量的HPV-1l拷贝。图9.含有不同浓度稳定型HPV_6b质粒的系列LR_HPV6b阳性U20S细胞系。采用Southern杂交方法，用放射性标记的全长HPV_6b基因组特异性探针对IOyg BamHI线性化的全细胞DNA进行分析。计算出的拷贝数和克隆数如图所示。鉴定出的细胞克隆每个细胞中携带不同数量的HPV-6b拷贝。图10.含有低拷贝数至高拷贝数稳定型HPV-5质粒的人类U20S细胞系。采用Southern杂交方法，用放射性标记的全长HPV-5基因组特异性探针对10 μ g SacI线性化的全细胞DNA进行分析。计算出的拷贝数和克隆数如图所示。筛选得到的细胞克隆每个细胞中携带不同数量的皮肤型HPV-5拷贝。图11.含有低拷贝数至高拷贝数稳定型HPV-8质粒的人类U20S细胞系。采用Southern杂交方法，用放射性标记的全长HPV-8基因组特异性探针对10 μ g BamHI线性化的全细胞DNA进行分析。计算出的拷贝数和克隆数如图所示。筛选得到的细胞克隆每个细胞中携带不同数量的皮肤型HPV-8拷贝。图12. U20S细胞中HPV-18基因组的维持情况。在首次检测到HPV-18阳性信号后接下来的11周中，在常规单层细胞培养条件下培养出HPV-18 #1. 13。从IOOmm培养皿中提取Hirt法裂解物,然后对线性化的低分子量DNA样本进行Southern杂交分析,从而确定染色体外HPV-18 DNA稳定性随时间`的变化情况。图13-18.在HPV-18阳性细胞系U18 #1. 13中验证DNA扩增的诱导情况。从细胞库中取出U18 #1. 13细胞系样本，将细胞培养为常规的单层细胞，在每个IOOmm培养皿(共6个冲接种IO6个细胞，进行培养。每2日加入2ml新鲜培养基(IMDM)，但是不进行细胞传代。在12天的培养周期中(2天添加一次培养基)，在每次添加培养基的第二天进行时间点分析。时间依赖性生长以获得高密度细胞培养物。图13.未转染的U20S和HPV-18阳性细胞系U18 #1. 13的生长曲线。时间依赖性生长以获得高密度细胞培养物。在分析前使用Invitrogen Countess细胞计数仪进行细胞计数。图14.时间系列中汇总的总DNA量。按标准操作分离总DNA，采用NanoDrop分光光度计测量DNA含量。图15.对不同时间点的总细胞DNA恒定含量进行Southern杂交分析。将等量(10 μ g)的全细胞DNA用线性化酶EcoRI酶切，然后使用放射性标记的HPV-18基因组特异性探针检测HPV-18基因组的扩增情况。确定DNA扩增的诱导情况。图16.不同时间点的HPV-19拷贝数的计算值。使用Phosphor-1mager和ImageQuant软件测量U18 #1. 13细胞系复制信号强度。通过标准品泳道标准曲线估计HPV-18基因组拷贝数。总结3种不同系列。图17.在不同时间点对U18 #1. 13细胞系mRNA水平进行RT-PCR分析。在扩增诱导期间的不同时间点对病毒蛋白的mRNA水平进行研究。按照厂商说明书，用TRIzol (Invitrogen)试剂抽提总DNA,然后用DNase I (Fermentas)处理，之后热灭活酶。将I U g总RNA作为模板，在20 ill的反应体系中加入oligo-dT引物，使用cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas)合成cDNA。将cDNA稀释为160iU，在2，5^1稀释液中加入进行300nM正向引物和反向引物以及2y I商品化5x HOTFIREPoI EvaGreen qPCR预混物(Solis Biodyne)组成IOiU的反应体系，进行单次PCR反应。在7900HT Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)上进行扩增，再使用比较Ct ( A Ct)法进行分析,将HPV转录特异性信号与參比基因0 -actin信号进行比较。将信号按时间零点进行归一化处理。RT-PCR分析显示编码病毒蛋白El，E2, E6, E7, LI的mRNA水平上调。图18.确定DNA复制中间产物(RI)结构的中性/中性ニ维凝胶分析(N/N2D)。抽提U18 #1. 13高密度单层细胞培养物的总DNA，用HindIII酶进行酶切(不会酶切HPV-18DNA)，然后在ニ维凝胶上进行分离。将10 ii g总DNA加样至置于0. 5xTBE缓冲液中的0. 4%葡聚糖凝胶中。IOV条件下进行第一向电泳，持续48小时。然后将兴趣泳道切下，旋转90°。在置于0. 5xTBE缓冲液中的1%葡聚糖凝胶(含0. 33 u g/ml EtBr)中进行第二向电泳，150V下6小吋。将DNA从凝胶转移至尼龙膜上，再用HPV-18基因组特异性探针杂交。在两个方向上示超螺旋DNA分子量标准品。箭头所示为ー个8kb的环状质粒；同时检测到高分子量质粒多聚物。图19-20.荧光原位杂交法检测U20S细胞中HPV-18拷贝数增加情況。在每个IOOmm培养皿(共6个)中接种IO6个U18 #1. 13细胞，培养2周，每2日加入2ml新鲜培养基，但是不进行细胞传代。在接种后第一天和第14天收集样本，进行原位杂交荧光法分析(FISH) (Invitrogen Corporation, TSA Kit #22)。杂交探针由切ロ平移法获得，使用HPV-18基因组作为模板，生物素标记的16-dUTP作为探针。使用DAPI对细胞核进行复染，再用50%的甘油PBS封片。图19.接种后第一天带有HPV-18信号的U18 #1. 13细胞。图20.接种后2周带有HPV-18信号的U18 #1. 13细胞。由于病毒基因组扩增，高密度细胞培养物中HPV-18阳性信号増加。图21.质粒 pUCHPV-18E, (SEQ ID NO1.)通过ApaI和BpiI酶切去除HPV-18基因组中大部分的晚期区(LI和L20RF)。用含有大肠杆菌细胞质粒扩增必需序列的片段替换被去除的区域，(PMB I复制起始位点和从PUC18克隆载体中扩增得到的￠-内酰胺酶抗性标记基因(bla))。可通过HindIII酶切去除插入的细菌序列。图 22.质粒 pUCHPV-18E-Gluc (SEQ ID NO 2) 表达框包含合成的5'内含子元件、包含Gaussia荧光素酶标记基因的经优化的終止子序列以及小牛生长激素多聚腺苷酸加尾信号，将表达框插入PUCHPV-18E，这样HPV-18早期区可保持完整。可通过HindIII酶切去除插入的细菌序列。图23.质粒 pUCHPV-18E-TKGluc (SEQ ID NO 3)。在 pUCHPV-18E_Gluc 载体中插入单纯疱疹病毒I (HSV 1)，后者来自于I nt-Gluc-bgh表达框前的胸腺嘧啶激酶(TK)启动子区。可通过HindIII酶切去除插入的细菌序列。
具体实施方式
实施例1U20S细胞中HPV DNA短暂复制人乳头状瘤病毒对上皮细胞表现出很强的亲嗜性。我们已经发现人类骨肉瘤细胞系U20S表现出上皮粘附形态，虽然其来自于ー种中度分化的骨肉瘤，其可非常有效地支持HPV El和E2蛋白依赖性病毒DNA复制，当病毒复制蛋白表达载体与含有病毒原点的报告质粒一同使用时。U20S细胞编码野生型pRb和p53。之后，我们研究了病毒转录因子(El和E2)是否以其原始构型发挥作用，支持U20S单层细胞培养物中的病毒基因组复制。根据其对癌症紧张的预后情况，我们纳入了 4种不同皮肤类型的乳头状瘤病毒，其中2种属于高危型(HR/HPV-18和HR/HPV-16)，另2种为低危型(LR/HPV-11和LR/HPV-6b)。此外，我们纳入了 2种亚型HPV-5和HPV-8，其作为皮肤感染性P -乳头状瘤病毒。用HPV-16基因组、即￥-613、即￥-11、即￥-18基因组转染U20S细胞(图2);用HPV-5和HPV-8基因组(分别为图3和图4)和AraD质粒载体DNA转染，并进行短期复制检测。在转染前，从质粒骨架·中切去HPV DNA =EcoRI酶切pBR322载体，获得HPV-18基因组；BamHI酶切pBR322载体，获得HPV_6b基因组；BamHI酶切pUC19载体，获得HPV-16和HPV-1l基因组；BamHI酶切pUC9载体，获得HPV-8基因组；SacI酶切pBR322载体，获得HPV-5基因组。胶回收纯化线性化HPV片段(ca 8kb)，并将低DNA浓度下(30 y g/ml)的连接化合物在4度下重新连接16小时。如图1所示，将递增量(1，2和5 ii g)的HPV-16质粒导入U20S细胞中，病毒DNA复制信号随时间增加(图1，泳道1-4，5-8,9-12)且具有浓度依赖性(图1，泳道1-4;5-8;9-12)。其它5种已研究的HPV类型表现处同样类型的短暂复制。如图所示，在经DpnI处理的样本中，线性化8kb条带强度随时间増加，可认为这提示这些细胞中病毒基因组的复制情况(图2，泳道1-4为5 ii g插入HPV-6b的质粒DNA，泳道7_10为HPV-1l ;泳道
I1-14为HPV-18DNA;图3和ID分别为HPV-5和HPV-8)。在独立实验中已观察到，在短期试验中所有转染的HPV质粒可在U20S细胞中启动病毒DNA相当水平的复制。HPV-6b, HPV-1I, HPV-16, HPV-18, HPV-5 和 HPV-8 的各种 HPV 环状基因组能够在U20S细胞中进行病毒DNA复制，这提示病毒调控元件已能够支持这些病毒类型的DNA复制，且病毒和细胞转录和复制因子能够表达。因此，一种能够抑制U20S细胞培养物中病毒DNA复制的第一扩增步骤的化合物可被认为是HPV治疗和HPV感染预防的候选化合物。至少在高危型和低危型粘膜HPV以及皮肤型HPV中这ー观察是可靠的。实施例2U20S单层细胞培养物中HPV稳定复制在U20S细胞系中持续稳定维持HPV短期试验中U20S细胞中的HPV基因组DNA复制信号很强，这说明需要进ー步评估HR-和LR-HPV质粒进行稳定游离复制的能力。基于这ー目的，我们在U20S细胞中共转染了5u g HPV-6b,或 HPV-11，HPV-16, HPV-18, HPV-5, HPV-8 环状质粒以及 5 ii g AraD 载体 DNA和2 ii g Eco0109I线性化pNeo-EGFP或EcoR1-线性化pBabeNeo质粒，其编码抗生素抗性标记物，这样可对转染细胞进行筛选。转染后48小时进行G418筛选。经G418筛选2_3周后，用Hirt裂解液提取全细胞(DNA“库”)获得低分子量(LMW)DNA提取物，然后再用针对适用的HPV类型的放射性标记的探针进行Southern杂交分析。分析显示所测试的样品含有相当可比性的HPV基因组，这提示所选细胞包含HPV复制子(图5)。即使在未经筛选的系列中，也非常有效地保留了转染的HPV基因组(图1)。为检测携帯染色体外复制中的HPV游离基因的克隆的人类细胞系，从所选的细胞群中按每IOOmm培养皿接种5000，10 000和50 000个细胞的稀释度转移细胞，挑选单细胞克隆，并在G418筛选条件下扩增和生长。从这些克隆中提取总基因组DNA，然后采用适当放射性标记的全长HPV亚型特异性探针对10 ii g EcoRI线性化(图6)、BamHI线性化(图7，8，9，11)或SacI线性化(图10)的总细胞DNA进行Southern杂交分析。检测U20S细胞系中每ー种不同HPV类型的单细胞亚克隆(图6-11)，将其纳入细胞库中。图6和图7示高危型HPV-18和HPV-16阳性亚克隆，每ー细胞系中所含HPV基因组的拷贝数量不同。同吋，也分离得到携带低危型HPV-1l和HPV-6的U20S细胞系(图8和9示)以及P -乳头状瘤型HPV-5和HPV-8亚克隆(图10和11)。Southern杂交表明，不同细胞系中每个克隆中的病毒DNA拷贝数可以从很低到很高。采用已知量的HPV质粒在同一凝胶上估计病毒基因组拷贝数量。分析DNA游离基因状态并进行FISH检查。 通过Southern杂交分析对HPV阳性亚克隆进行长期跟踪通过Southern杂交分析对分离得到的HPV阳性亚克隆进行长期跟踪以确定游离基因維持复制进入之后传代的稳定性。在至少2个月的检查期内，大多数测试的细胞系在常规培养条件下的单层培养物中稳定(如图12所示HPV-18亚克隆#1. 13)。如果细胞系连续传代，在低危型HPV-1l和HPV-6b中存在一定程度的质粒丢失。从开始检测阳性HPV-18信号开始的11周内，在常规单侧细胞培养条件下培养HPV-18 #1.13亚克隆。在每个时间点收集ー个IOOmm培养皿中的细胞培养物，按Hirt法获得裂解物，通过Southern杂交分析线性化(Ec0RI)低分子量DNA样本，确定染色体外HPV-18 DNA稳定性随时间变化情況。在平行系列中，在同一时间内将等量(2ii g)的线性化细胞DNA (总DNA)上样进行比较。使用HPV-18全长基因组特异性探针。HPV-6b, HPV-1I, HPV-16, HPV-18, HPV-5 和 HPV-8 的各种 HPV 环状基因组能够在U20S细胞中进行病毒DNA复制，这提示病毒调控元件已能够支持这些病毒类型的稳定期或潜伏期DNA复制，且病毒和细胞转录和复制因子能够表达。因此，一种能够抑制U20S细胞培养物中病毒DNA复制潜伏期的化合物可被认为是HPV感染潜伏期中HPV治疗和预防的候选化合物。至少在高危和低危粘膜HPV以及皮肤型HPV中这ー观察是可靠的。建立HPV质粒拷贝数从低至高的亚克隆证实了所建工具的价值，这在抗HPV药物筛选中是必需的。实施例3HPV基因组晚期扩增基因组扩增模式与分化依赖性病毒扩增类似在HPV生命周期的繁殖期阶段，病毒基因组扩增发生在表皮上层细胞的分化细胞中。为了研究组织培养物中病毒生命周期的繁殖期阶段，同时尝试使用器官或移植培养物、甲基纤维素悬液、饲养层细胞通过调控下的培养和生长条件复制表皮的三维结构。我们使用另ー种方法，仅高密度细胞培养物模拟分化依赖型病毒扩增。因此我们在数个培养皿中接种等量(例如每个IOcm培养皿IXlO6个细胞)的HPV阳性细胞克隆，并维持常规融合的单层细胞生长至高密度。在第2，4，6，8，10，12，(...)天收集、分离和分析总DNA或低分子量(Hirt法)DNA样本。
以HPV-18阳性细胞系HI 8 #1. 13为例，图13-18示HPV DNA扩增的诱导情况。研究测试了所有HPV类型的同一扩增类型。图13给出了细胞生长曲线，图14示系列中提取的总DNA含量増加。在图15中，将等量的系列总DNA加样至凝胶中，并采用EcoRI作为单酶切酶和病毒特异性探针进行Southern杂交分析。图16示高密度培养条件下HPV DNA扩增定量数据。进行数项重复实验。奶- 0 分析示病毒蛋白￡^23637合成以及し1 RNA水平上调。中性/中性ニ维凝胶电泳(2D)杂交图谱提示存在HPV质粒的单聚体和多聚体(图18)。在两个阶段(接种后第I天和第12天)的ニ维限制性内切酶分析中，DNA复制中间产物形状差异提示复制模式改变。为了对细胞内HPV DNA游离体形成进行定性分析，除了 Southern杂交分析外，还对所研究的亚克隆进行中期和间期突光原位杂交(FISH)分析(InvitrogenCorporation, TSA Kit #22)。图 19-20 示 HPV-18 亚克隆 #1. 13 的间期 FISH 分析示例。U18#1. 13细胞在接种后第一天表现出HPV-18信号(图19)。接种2周后U18 #1.13细胞中的HPV-18阳性信号由于病毒基因组扩增而增加(图20)。从这些示例可以看出，HPV质粒在融合的U20S细胞中经历了ー个扩增复制的阶段，其单细胞拷贝数可高达数以万计，因此其适用于熟悉本领域的技术人员在高通量系统中筛选具有抗HPV特性的药物。因此，一种能够抑制U20S细胞中DNA扩增复制的化合物被认为是HPV扩增期中治疗和预防HPV的候选化合物。至少在高危和低危型粘膜HPV以及皮肤型HPV中这ー观察是可靠的。实施例4通过ApaI和BpiI酶切去除HPV-18基因组中大部分的晚期区(LI和L20RF)。用含有大肠杆菌细胞质粒扩增必需序列的片段替换被去除的区域，(PMB I复制起始位点和从PUC18克隆载体中扩增得到的￠-内酰胺酶抗性标记基因(bla))。可通过HindIII酶切去除插入的细菌序列。这样，获得了ー个HPV-18早期区的质粒载体。图21示该质粒图谱。 实施例5质粒pUCHPV-18E-Gluc (SEQ ID NO 2)。表达框包含合成的5'内含子元件、包含Gaussia荧光素酶标记基因的经优化的終止子序列以及小牛生长激素多聚腺苷酸加尾信号，将表达框插入PUCHPV-18E，这样HPV-18早期区可保持完整。可通过HindIII酶切去除插入的细菌序列。这样，构建了含有HPV-18早期区的质粒，其携帯ー个能够对染色体外高危型粘膜HPV-18 DNA进行定量或半定量检测的报告基因。图22示该质粒图谱。实施例6质粒pUCHPV-18E-TKGluc(SEQ ID NO 3)。在 pUCHPV-18E_Gluc 载体中插入单纯疱疹病毒I (HSV I)，后者来自于Int-Gluc-bgh表达框前的胸腺嘧啶激酶(TK)启动子区。可通过HindIII酶切去除插入的细菌序列。这样，构建了含有HPV-18早期区的质粒，其携帯ー个能够对染色体外高危型粘膜HPV-18 DNA进行定量或半定量检测的TK启动子调控的报告基因。图23示该质粒图谱。图4-6示基于HPV的载体，其中已去除LI和L2基因并用ー个报告基因替代。相应地，提供了可对复制的染色体外DNA进行定量和半定量评估的有用工具。实施例7本试剂盒包含人类骨肉瘤细胞系U20S、染色体外可维持性HPV DNA质粒pUCHPV-18E-TKGluc，其中LI和L2基因用Gaussia荧光素酶标记物基因替代。将该载体转染U20S细胞系，鉴定出稳定细胞系并培养至融合状态。熟悉本领域的技术人员可将现有或生成的任何化合物库添加至预融合和/或融合的细胞培养物中，以筛选化合物库中对稳定維持的HPV活性和/或病毒DNA复制的扩增期具有抗性的化合物。Gaussia荧光素酶报告基因可作为评估复制的染色体外DNA的定量或半定量方法，熟悉本领域的技术人员可通过测量荧光或在荧光显微镜下观察对插入基因的应该产物进行定量或半定量測定。实施例8ー种鉴定能够抑制HPV DNA复制的化合物的方法将携带病毒复制周期所有步骤所需的病毒CW-序列和转录因子的全部或部分HPVDNA通过电转或已知的化学转染方法导入人类骨肉瘤细胞系U20S中。使用G418抗性选择标记物分离得到携帯染色体外复制的HPV质粒的U20S细胞系克隆。对鉴定出的每个细胞中携帯不同HPV拷贝数的细胞克隆进行定性分析，获得这些细胞克隆的扩增物和细胞库。将用于鉴定HPV晚期复制抑制剂的所选亚克隆细胞低密度接种于96孔板中，在细胞培养基中添加不同浓度的候选药物，待细胞生长至融合。或者，将细胞接种于384孔板中以增加通量。作为另ー优选方案，将细胞培养物在培养板中至少培养5-7天以达到融合，在细胞融合后，再向培养基中添加候选药物。通过直接測量细胞中DNA含量或采用报告基因可以测量细胞中HPV染色体外拷贝数。之后，将研究的化合物加入U20S细胞单层培养物的培养皿中；通过测量报告基因产物含量或染色体外DNA含量来评估化合物对病毒DNA稳定或扩增复制有无抑制作用；最后如果在某ー培养条件下观察到该某ー浓度的化合物对某ー生长期中某 一拷贝数的HPV DNA复制具有抑制作用，将鉴定出的化合物作为HPV DNA复制候选抑制剂。
权利要求
1.一种鉴定能够抑制人乳头状瘤病毒(HPV)复制的化合物的方法，其包含以下步骤 a.将能够进行HPVDNA短暂、稳定和营养期复制的全部或部分序列的HPVDNA导入能够在这类细胞中进行HPV DNA短暂、稳定和营养期复制的细胞系。
b.生成携带染色体外HPVDNA (每个细胞中拷贝数不同)的稳定亚克隆的细胞库； c.将所选细胞亚克隆(不同HPV类型或拷贝数)培养为分裂中的分散单层细胞培养物，和/或将所选细胞亚克隆为高密度单层细胞培养物。
d.将研究中的化合物应用于携带HPVDNA的所选亚克隆单层细胞物的培养皿中； e.评估化合物对细胞中病毒DNA维持和/或扩增的抑制作用； f.如果观察到某一浓度的化合物对HPVDNA复制有抑制作用，则将这一化合物作为HPV DNA复制的候选抑制剂。
2.权利要求1中所述方法，其中能够稳定复制HPVDNA的细胞系为人类骨肉瘤细胞系U20S。
3.根据权利要求1或2中所述方法，其中在达到细胞融合前将所研究的化合物应用于细胞亚克隆单层培养物中；HPV抑制剂旨在抑制晚期HPV DNA复制。
4.根据权利要求1或2中的任何方法，其中通过融合后连续传代维持亚克隆培养物至少4-12天，直至染色体外HPV DNA开始营养扩增复制期，这时将研究的化合物应用于融合的细胞克隆单层培养物中，测试化合物对HPV DNA复制的营养扩增复制期的抑制作用。
5.根据权利要求1-4中任一要求的方法，通过定量或半定量测量染色体外病毒DNA含量来评估是否存在抑制作用。
6.根据权利要求1-4中任一要求的方法，将报告基因序列插入HPVDNA亚基因组片段中。
7.权利要求6中的方法，其中报告基因替代HPV的LI和L2基因。
8.权利要求6中的方法，其中报告基因为d-GFP、荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)或Gaussia突光素酶。
9.权利要求6中的方法，其中测量报告基因编码的蛋白含量。
10.权利要求6中的方法，其中测量报告基因编码的蛋白催化的反应产物。
11.根据权利要求1-4中任一要求的方法，其中HPV为高危粘膜型HPV，属于亚型HPV-18或HPV-16，或任何其它高危粘膜型HPV。
12.权利要求1的方法，其中HPV为低危粘膜型HPV，属于亚型HPV-6b或HPV-11，或任何其它低危粘膜型HPV。
13.权利要求1的方法，其中HPV为皮肤型HPV，属于亚型HPV-5或HPV-8，或任何其它皮肤型HPV。
14.根据权利要求1-13中任一要求的方法，其中在这类细胞中维持染色体外HPVDNA。
15.一种鉴定能够抑制HPV复制的试剂盒，至少包含 a.人类骨肉瘤细胞系U20S; b.将一种染色体外可维持性载体导入U20S细胞系中，其包含用报告基因替代LI和L2基因的全部或部分HPV DNA ； c.一种用于筛选抗HPV活性的化合物或化合物库； d.一种评估细胞内HPV DNA复制、转录或翻译活性的定量方法。
全文摘要
本发明提供一种鉴定抑制人类乳头状瘤病毒(HPV)复制的化合物的方法和试剂盒。将HPV基因组或亚基因组DNA插入一个细胞系中，其可支持HPV DNA复制，从而确定抑制化合物对HPV DNA复制的影响。我们鉴定出U20S细胞系为可行的宿主细胞系，其可支持HPV DNA复制，且U20S细胞系可作为粘膜型和皮肤型组织特异性HPV基因组扩增及HPV基因组相关载体的合适宿主。该方法能够筛选在HPV生命周期中不同复制阶段抑制HPV DNA复制的因子。该方法可用于药理学研究，筛选预防或治疗各类HPV亚型所致感染的新型候选药物。
文档编号C12Q1/70GK103038363SQ201080066857
公开日2013年4月10日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者马特·尤斯蒂瓦, 伊恩·尤斯蒂瓦, 杰里扎维特·杰曼恩, 里贾内·皮皮特斯, 海伦·伊斯卡-帕斯, 托米·芮恩松, 小马特·尤斯蒂瓦, 特瑞恩·劳斯, 马瑞特·奥若维, 克里斯汀娜·索尔克, 安德鲁斯·曼尼克, 安努·瑞姆 申请人:艾考斯根细胞制造有限公司