产阿霉素的假单胞工程菌的制作方法

专利名称：产阿霉素的假单胞工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种产阿霉素的假单胞工程菌。
背景技术：
阿霉素和道诺霉素为蒽环类抗生素，是临床上常用的抗癌药物。阿霉素又名 14-羟柔红霉素，是道诺菌素结构中道诺糖胺的4'位羟基化衍生物。阿霉素和道诺菌素结构相似，因此作用机制也相同。然而阿霉素与道诺菌素相比，相同剂量的疗效更强，毒副作用更低，且无交叉耐药，抗肿瘤谱比道诺菌素广，使其有更高的应用价值，成为目前临床上应用最广泛的抗肿瘤药物之一。在治疗时阿霉素经常和其它化疗药物例如阿糖胞苷，长春新碱，丝裂霉素C等合并使用以增加疗效。阿霉素生物合成基因簇大小共4131!3bp，其中的doxA基因编码氧化还原酶，负责将道诺菌素进行羟基化得到阿霉素的生物合成步骤。由于DoxA催化作用的不完全性，使含有阿霉素生物合成基因簇的菌株，例如链霉菌Mi^ptomyces peucetius ATCC 29050同时产生阿霉素和道诺菌素。采用S. peucetius ATCC 29050进行阿霉素的生产存在一些不足， 例如菌体生长速度慢(菌体的倍增时间近48小时)、难培养(需严格的富含氧气的环境，且需充分搅拌以使菌体混勻)以及遗传育种较难进行(菌株为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，诱变剂难以发挥功效)等。这些因素制约着对阿霉素的有效开发和应用。近年来，次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达成为提高化合物产量或有针对性地改造化合物的有效手段。在异源表达宿主的选择中，由于假单胞菌与抗生素主要来源的放线菌密码子的使用相近，有翻译后修饰，安全无毒(如模式菌株恶臭假单胞菌I^eudomonas putida KTM40)，生长快速，次级代谢产物背景清晰等优点，成为首选的宿主菌之一。在其中进行生物合成基因簇的异源表达有着很好的应用潜力。

发明内容
本发明的目的是提供一种高产阿霉素的假单胞工程菌。本发明的另一目的是提供上述假单胞工程菌在生产阿霉素中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种产阿霉素的假单胞工程菌，其是将阿霉素生物合成基因簇中dnrH、dnrX和dnrU基因删除并在编码氧化还原酶的doxA基因前插入来自假单胞菌的Rii启动子，然后将改造后的基因簇整合至恶臭假单胞菌O^eudomonas putida)KT2440的基因组中而获得。前述的工程菌，其中所述阿霉素生物合成基因簇来源于链霉菌(Sti^ptomyces peucetius)ATCC 29050。前述的工程菌，改造后的基因簇是与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) KT2440 的基因组中的。前述的工程菌，其是将改造的阿霉素生物合成基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。
其中，trpE基因和trpC基因分别编码邻氨基苯甲酸合酶组分I和吲哚-3-甘油-磷酸合成酶，在trpE基因和trpC基因之间为trpE和trpC之间为PP_0418、PP_0419、 trpG和trpD基因，它们分别编码脂酶，编码32个氨基酸的未知多肽，邻氨基苯甲酸合成酶组分II和邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶。这些基因参与邻氨基苯甲酸的生物合成，均为非必须基因，即去除它们不影响菌株的生理和生化功能。前述的工程菌，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因或庆大霉素抗性基因。前述的工程菌，其是将改造的阿霉素生物合成基因簇与卡那霉素抗性基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。前述的工程菌，其为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) Sino-HDR，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏号CGMCC N0.4638，保藏日期2011年3月7日。该工程菌的培养方法为将所述工程菌接种于LB培养基中，在30°C下进行培养。本发明还提供上述工程菌在生产阿霉素中的应用，其是将所述的工程菌进行发酵培养，然后从发酵液中分离纯化得到目标产物阿霉素。本发明通过基因工程的方法，将来源于链霉菌(Sti^ptomycespeucetius)ATCC 29050的阿霉素生物合成基因簇中dnrH、dnrX和dnrU基因删除并在编码氧化还原酶的 doxA基因前插入来自假单胞菌的Rii启动子，然后将改造后的基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌O^seudomonas putida)KT2440的基因组中构建得到高产阿霉素的假单胞工程菌。其中，对恶臭假单胞菌Sino-HDR进行发酵，发酵产物经高效液相色谱(HPLC) 检测表明阿霉素产量为3. 51 μ g/ml，道诺菌素产量为0. 85μ g/ml。而未进行dnrH，dnrX 和dnrU基因删除以及doxA高表达的恶臭假单胞菌Sino-DNDR (保藏号CGMCC N0. 4637)发酵得到的阿霉素和道诺菌素的产量分别为2. 34 μ g/ml和3. 01 μ g/ml。可见在恶臭假单胞菌Sino-HDR菌株中，阿霉素的产量显著提高。所得菌株还可通过优化发酵条件及目标化合物的分离和纯化步骤等进一步地提高阿霉素的产量，达到大规模工业化生产的目的，因此本发明有着广泛的应用价值。


图1为本发明改造后的阿霉素生物合成基因簇整合至P. putidaKT2440基因组中的示意图，其中doXE-dnrM表示被doxE基因片段所取代的dnrM基因片段，Δ dnrH, Δ dnrX 和Δ dnrU表示dnrH、dnrX和dnrU这三个基因的敲除，xylS-Pm-doxA表示doxA基因置于 Rii启动子的作用之下，xylS是调节Rii启动子表达的调控基因，bla是氨苄青霉素抗性基因， sacB是6-果糖基转移酶基因，oriT是结合转移片段，trpE是分别编码邻氨基苯甲酸合酶组分I基因，kan是卡那霉素抗性基因，trpC是吲哚-3-甘油-磷酸合成酶基因，gph是磷酸乙醇磷酸酶基因，PP_0418是编码脂酶的基因，PP.0419是未知多肽的基因，trpG是邻氨基苯甲酸合成酶组分II基因，trpD是邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶基因，PP_0423是未知功能的基因，DE1、DE2、DE3和DE4为验证P. putidaSino_HDR基因型所设计的PCR引物。图2为本发明P. putida Sino-HDR菌株基因型分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中 M代表DL2000DNAMarker, 1为DEl和DE2引物扩增的1. 2kb，2为DE3和DE4引物扩增的 1. ^ib。
图3为本发明P. putida Sino-HDR菌株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析结果，其中A是道诺菌素和阿霉素标准品，B是P. putidaSino DNDR菌株的发酵产物，C是 P. putida Sino-HDR菌株的发酵产物。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分的，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。以下实施例中使用的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒1. Escherichia coli DHlOB0 基因型 F- mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80 dlacZ M15 lacX74 deoR recAlaraD139 (ara, leu) 7697 galU galK rpsL endAl nupG。文献 LifeTechnologies, Inc. Focus, 1990,12 :19。购自美国 Invitrogen 公司。2. Ε. coli ΗΒ101/ρΙ Κ2073。 文 ^ =Marx CJ, Lidstrom ME. evelopment of improved versatile broad-host-range vectors for use inmethylotrophs and other Gram-negative bacteria, icrobiology. 2001,147 (8) :2065_75。
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[l]trpE基因的克隆设计引物CST5 5 ‘ -GGGGAGCTCGGCCGCTGCCGGCTACAACCG-3 ‘，CST6 5 ‘ -GGGGAAT TCCAGATCGATCAGCATCAGGTG-3 ‘，以恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA为模板，PCR扩增得到1. Okb的trpE基因，用SacI和EcoRI酶切后，克隆至pBRST的相同位点，得到重组质粒 pBRSTtrpEo[2]trpC基因的克隆设计引物CST7 5 ‘ -GGGAAGCTTTATGGACAGCAAGCGAACCGG-3 ‘，CST8 5 ‘ -GGGGGAT CCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3 ‘，以 pKD4 质粒 DNA 为模板，PCR 扩增得到 1. Okb 的 kan 基因， kan为卡那霉素抗性基因，用于筛选阿霉素基因簇整合至基因组上的重组菌株。设计引物 CST9 :GGGGAATTCAGATCTGGGCGTGATCCGCGAGCACTTC-3‘ , CSTlO 5' -GGGCTCGAGGCCGGTTTCT CGCAGCAGCAC-3 ‘，以恶臭假单胞菌KTM40基因组DNA为模板，PCR扩增得到1. Okb的trpC 基因。将kan基因用HindIII和BamHI酶切，将trpC基因用BglII和XhoI酶切，两者与用HindIII和XhoI酶切的pKS(-)在T4-连接酶的作用下连接后，转化Ε. coli DHlOB的感受态细胞，筛选得到克隆有kan-trpC基因盒的质粒pNTC。将pNTC以HindIII和BioI酶切后，回收2. Okb片段，克隆至用HindIII和BioI酶切并以碱性磷酸酯酶处理的pBRSTtrpE， 获得trpE和trpC克隆至低拷贝质粒上的重组克隆，命名为pBRSTEC。5.含阿霉素生物合成基因簇同源臂和正负筛选标记的克隆的构建为实现以重组工程法克隆阿霉素生物合成基因簇，首先需将阿霉素生物合成基因簇两侧的片段(称之为“同源臂”)克隆至克隆载体上，同时为了筛选目的克隆，需引入筛选标记；为了去除筛选标记，需引入负筛选标记。[1]阿霉素生物合成基因簇同源臂的克隆设计引物DHAl:5' -AAAGAATTCGAGTCGTCGCCTCTGCGGCCCC-3‘ ,DHA2 5' -AAAACT AGTGTCGCCGCGCGGGCCGAGCAGG-3 '，以 S. peucetius ATCC 29050 基因组 DNA 为模板，扩增得到1. 51Λ，用EcoRI和SpeI酶切后，克隆至pKS (-)的相同位点，得到含阿霉素生物合成基因簇左侧1. 5kb同源臂的克隆pDHAl。设计引物DHA3 5 ‘ -AAAACTAGTGTTCAGGTGACGCACCATCTTG-3 ‘，DHA4 5 ‘ -AAAAAG CTTCAACACGTGACCTTCCTCAGACC-3 ‘，以 S. peucetius ATCC 29050 基因组 DNA 为模板，扩增得到1. 51Λ，用SpeI和HindIII酶切后，克隆至pKS (-)的相同位点，得到含阿霉素生物合成基因簇右侧1. 5kb同源臂的克隆pDHA2。用EcoRI和SpeI酶切pDHAl，回收1. 5kb左侧片段；用SpeI和HindIII酶切pDHA2,回收1. 5kb右侧片段；两片段与用EcoRI和HindIII酶切的pKS(-)在T4-连接酶的作用下连接，转化E.coli DHlOB的感受态细胞，筛选重组质粒 pDHA3。[2]正负筛选标记的克隆所选择的正筛选标记为四环素抗性基因tet，负筛选标记为编码大肠杆菌核糖体 S12蛋白的rpsL，rpsL基因表达使得含该质粒的菌株不能在链霉素环境下生长。rpsL和tet 组成基因盒，tet和rpsL均由pompF启动子所驱动以增强其在大肠杆菌中的表达。经链霉素筛选后，通过同源臂之间的同源重组，克隆目的基因的同时将rpsL-tet基因盒去除。设计引物DHA5:5' -GGGTCTAGATCGCTGTCGAGATATGACGGTG-3 ‘ , DHA6 5' -GGGTCTAGAGATGATAAGCTGTCAAACATGAG-3 ‘，用 pM0D4_RT 质粒 DNA 为模板，PCR 扩增得到 2. Okb 的rpsL-tet基因盒，用^CbaI酶切后克隆至pKD4，用)(baI酶切后得1.81A，RKE. coli BW25141菌株，得到重组质粒pR6KRT。pR6KRT含R6K复制子，不能在一般的菌株如DH10B、 HBlOl和DH5 α中复制，BW25141通过R6K复制子表达pir蛋白而成为pR6KRT的宿主菌。[3]同源臂和筛选标记的连接用)(bal酶切pR6KRT，切胶回收2. Okb的rpsL-tet基因盒，与用SpeI酶切并经碱性磷酸酯酶处理的PDHA3相连，转化E. coli DHlOB的感受态细胞，以氨苄青霉素和四环素双重筛选，得到筛选重组质粒PDHA4。6.克隆基因簇和整合表达型质粒的构建将含阿霉素生物合成基因簇的同源臂以及正筛选和负筛选标记的质粒pDHA4以 EcoRI和HindIII酶切后，回收4. Okb的片段，与用EcoRI和HindIII酶切并经碱性磷酸酯酶处理的pBRSTEC相连，转化E. coliDHlOB的感受态细胞，最终获得克隆阿霉素生物合成基因簇的质粒PDHA5。实施例2阿霉素生物合成基因簇的克隆和修饰本发明利用重组工程法克隆阿霉素生物合成基因簇并对其进行修饰。1.表达重组酶基因的质粒的构建由于克隆基因簇实验中所涉及的抗性标记较多，我们首先构建了具氯霉素抗性的重组酶表达质粒。设计引物RC1:5'-AAACATGGATATTAATACTGAAACTG-3‘ ,RC2 5' -AAAAAGCTTGTCA TCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3 ‘，以lambda DNA做为模板，PCR扩增得到1. 9kb的重组酶基因 (即gam、bet和exo基因)片段，用NcoI和HindIII酶切后克隆至pBAD322C的相同位点， 所得质粒命名为pBADRed。由于pBADRed和pDHA5含相同的复制子，为避免质粒不相容性，将pBADRed用NsiI 和I3StI酶切后，回收3. 2kb的araC-pBAD和重组酶基因片段，与用I3StI和HindIII酶切的 pBBRlMCS-Ι载体相连接，转化转化E. coli DHlOB的感受态细胞，筛选得到由阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的，含BBRl复制子的重组酶表达质粒pBBRlRed-C。2.阿霉素生物合成基因簇的重组工程法克隆[1]克隆载体转化至表达重组酶的质粒制备DH10B/pBBRlRed-C的电转化感受态细胞，培养时加入25μ g/ml的氯霉素，其余方法同DHlOB电转化感受态细胞的制备。转化PDHA5，以氨苄青霉素、四环素和氯霉素进行筛选，得到菌株 DH10B/pBBRlRed-C+pDHA5。[2] L-阿拉伯糖诱导重组酶表达的菌株的电转化感受态细胞的制备和DNA转化从含相应的抗生素的LB平板上挑取新鲜划线培养的DH10B/pBBRlRed-C+pDHA5单菌落至2ml含相应的抗生素的LB液体培养基中37°C振荡过夜，以1/50体积转至50ml LB 中，振荡培养至菌体OD6tltl约为0. 2时，加入终浓度为0. 15%的L-阿拉伯糖，继续培养至菌体OD6tltl约为0.6。后续的步骤同感受态大肠杆菌DHlOB的制备和DNA转化。[3]阿霉素生物合成基因簇的克隆电转化经机械剪切的5 μ g S. peucetius ATCC 29050基因组DNA，在含200 μ g/ml 链霉素的LB培养基上进行筛选，得到22个克隆，经酶切验证，其中包括两个正确的克隆，将最终含有阿霉素生物合成基因簇的克隆命名为pSino-200。3. TDP-D-葡萄糖4，6_脱水酶基因的修复由于阿霉素产生菌S.peucetius ATCC 29050中的阿霉素生物合成基因簇中的 dnrM基因在第183个核苷酸发生移码突变而异常终止，因此dnrM基因编码的TDP-D-葡萄糖4，6_脱水酶基因不能表现出正常的活性。为恢复TDP-D-葡萄糖4，6_脱水酶基因的活性，我们首先从S.peucetius ATCC 29050中克隆了功能性的TDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶基因片段，再将其置换原基因簇中失去功能的基因。[1] TDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶区域的克隆根据链霉菌来源的TDP-D-葡萄糖4，6_脱水酶基因的保守序列设计兼并引物 GDHl 5' -CSGGSGSSGCSGGSTTCATSGG-3‘ , GDH2 5' -GGGffRCTGGYRSGGSCCGTAGTT G-3'， 其中 S = G 或 C，W = A 或 T，Y = C 或 T，R = A 或 G。以 S. peucetius ATCC 29050 基因组 DNA为模板，PCR扩增得到约0. 6kb的目标产物，克隆至pGEM-T载体后测序得到542个碱基， 从第三位开始呈现开放阅读框，540bp片段所编码的180个氨基酸没有终止序列，即包含在一个完整的蛋白中，将此基因片段命名为doxE。同源性比较发现DoxE与其他链霉菌来源的 TDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶基因有很高的同源性。如与链霉素生物合成基因簇中TDP-D-葡萄糖4，6_脱水酶基因MrE的同源性为67% ；与德胺糖生物合成基因簇中TDP-D-葡萄糖 4,6-脱水酶基因DesIV的同源性为62%。这表明所克隆的doxE为功能性TDP-D-葡萄糖 4，6-脱水酶基因。[2]功能基因的置换以重组工程法来实现doxE基因取代相应的dnrM基因部分。设计引物DOMD 1 5 ‘ -GACGACAGCAGGGTGGAGATCTCCTCATGACCATGAAGATCCTGGTGACATCGCTGTCGAGATATGACGGT G-3'，前50个碱基为针对dnrM 5'的同源臂，后22个碱基为扩增rpsL-tet基因盒5 ‘的弓丨物；D0MD2 5 ‘ -ACCCGGCCACCGCTCAGCAGGGTCGTCACAAAACGCGGAATGACCTTCTCGATGATAAGCT GTCAAACATGAG-3'，前50个碱基为针对dnrM 3'的同源臂，后23个碱基为扩增rpsL_tet 基因盒3'的引物。以PR6KRT质粒DNA为模板，扩增得到2. 11Λ的目的产物，即为含同源臂以及rpsL-tet基因盒的打靶DNA。将pSino-200转化DH10B/pBBRlRed_C的电转化感受态细胞，以氯霉素和氨苄青霉素进行筛选，所得菌株为DHlOB/pBBRlRed-C+pSino-200，制备阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，转化300ng 2. Ikb的打靶DNA，以链霉素抗性进行筛选，随机挑取的4个克隆经培养和提质粒验证，均为含打靶DNA的重组克隆，即rpsL-tet基因盒取代了 dnrM基因Mlbp。将此重组质粒命名为pSino_201。为了实现用doxE取代dnrM失去功能的部分，设计引物D0MD3 5' -GACGACAGCAGG GTGGAGATCTCCTCATGACCATGAAGATCCTGGTGACAGGCGCCGCGGGGTTCATCGGC-3 '，前 50 个碱基为针对dnrM 5'的同源臂，后21个碱基为扩增doxE5'的引物；D0MD4 :5' -ACCCGGCCACCGCT CAGCAGGGTCGTCACAAAACGCGGAATGACCTTCTCTGGGTACTGGTACGGCCCGTAG-3 ‘，前 50 个碱基为针对dnrM 3'的同源臂，后22个碱基为扩增doxE 3'的引物。以doxE基因为模板，PCR扩增得到640bp产物，即为含同源臂以及doxE基因的打革巴DNA。将pSino-201转化DH10B/pBBRlRed_C的电转化感受态细胞，以氯霉素和氨苄青霉素进行筛选，所得菌株为DHlQB/pBBRlRed-C+pSino-201，制备阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，转化640bp的打靶DNA 300ng，以链霉素抗性进行筛选，获得90个克隆，四环素抗性验证发现82个为四环素敏感性，表明rpsL-tet基因盒失去。随机挑取目的克隆，经培养和提质粒验证，均为含打靶DNA的重组克隆，即doxE基因取代了 rpsL-tet 基因盒。将此重组质粒命名为pSino-202，该质粒即包含dnrM基因的Mlbp为doxE的540bp 所取代而获得功能性的TDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶基因，因此其中的阿霉素生物合成基因簇为完整的。实施例3阿霉素生物合成基因簇中dnrH、dnrX和dnrU的基因敲除基因dnrH、dnrX和dnrU是阿霉素生物合成基因簇中的负调节基因，DnrH和DnrX 催化阿霉素和道诺霉素转化为巴龙霉素(baumycin)类糖苷，DnrU催化道诺霉素转化为 13 (R) - 二羟基道诺霉素，它们均为阿霉素代谢的副产物，阻断它们的形成有利于使生物合成的前体小分子代谢流指向目标产物阿霉素，从而增加阿霉素的产量，同时消除副产物有利于目标产物的分离和纯化。l.dnrH基因的敲除采用重组工程法对dnrH进行基因敲除，首先通过同源重组以正筛选和负筛选基因盒rpsL-tet取代dnrH基因，随后通过寡核苷酸介导的同源重组将rpsL-tet去除。最终仅保留dnrH基因开放阅读框的前三个和后三个核苷酸，这样既实现了 dnrH基因的读码框内敲除，又不破坏下游基因表达的极性效应。设计引物D0MD5 5 ‘ -AACCCGCTCAGCCGTGCCGTCCGCCCCGCCCCGGAGGTGAGTTCCCCGTG TCGCTGTCGAGATATGACGGTG-3‘，前50个碱基为含dnrH基因开放阅读框起始密码子GTG序列的5'同源臂，后22个碱基为扩增rpsL-tet基因盒5'的引物；D0MD6 :5' -CCGCCGGTCACGA TCACGGATCGCTGTGTGTTCTCCATGCGGCGAGGCTAGATGATAAGCTGTCAAACATGAG-3 ‘，前 50 个碱基为含dnrH基因终止密码子TAG的3'的同源臂，后23个碱基为扩增rpsL-tet基因盒3‘的引物。以PR6KRT质粒DNA为模板，扩增得到2. Ikb的目的产物，即为含同源臂以及rpsL-tet 基因盒的打靶DNA。将pSino-202转化DHlOB/pBBRlRed-的电转化感受态细胞，以氯霉素和氨苄青霉素进行筛选，所得菌株为DHlOB/pBBRlRed-C+pSino-202，制备其L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，转化300ng 2. Ikb的打靶DNA，以四环素抗性进行筛选，随机挑取的4个克隆经培养和提质粒验证，均为含打靶DNA的重组克隆，即rpsL-tet基因盒取代了 dnrH基因。将此重组质粒命名为pSino-203。设计引物D0MD7:5' -CAGCCGTGCCGTCCGCCCCGCCCCGGA GGTGAGTTCCCCGTGTAGCCTC GCCGCATGGAGAACACACAGCGATCCG TGATCGTG-3‘，前 42 个碱基为 50bp 5'同源臂的后 42 个碱基序列，后42个碱基为50bp 3'同源臂的前42个碱基序列。将pSino-203转化DH10B/pBBRlRed-C的电转化感受态细胞，以氯霉素和氨苄青霉素进行筛选，所得菌株为DHlOB/pBBRlRed-C+pSino-203，制备其L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，转化300ng D0MD7寡核苷酸，以链霉素抗性进行筛选，随机挑取的4个克隆发现均为四环素敏感型，经培养和提质粒验证，它们均为rpsL-tet基因盒消除的的重组克隆，将此dnrH基因敲除的质粒命名为pSino-204。2. dnrX基因敲除基因敲除的原理和基本步骤同dnrH的基因敲除。
设计引物D0MD8 5 ‘ -CCGGCACGCCCTCTCTGTCCGGCGGTCCGGGGACGACGCCACCGGGATCA TCGCTGTCGAGATATGACGGTG-3 ‘，前50个碱基为包含dnrX基因终止密码子反向互补序列TCA 的5'同源臂，后22个碱基为扩增rpsL-tet基因盒5'的引物；D0MD9 :5' -CCGGGCGGTGGCC CCGGACCGGCGGCCACTCAGCATCGAGAGGGATCATGGATGATAAGCTGTCAAACATGAG-3 ‘，前 50 个碱基为含dnrX基因起始密码子反向互补序列CAT的3'的同源臂，后23个碱基为扩增rpsL-tet 基因盒3'的引物。以pR6KRT质粒DNA为模板，扩增得到2. Ikb的含同源臂以及rpsL-tet 基因盒的打靶DNA。转化pSino-204至DHlOB/pBBRlRed-C，制备所得菌株的L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，电转化和筛选步骤同dnrH的基因敲除，得到rpsL-tet基因盒取代了 dnrX基因的重组质粒命名为pSino-205。设计引物D0MD10 5' -CCCTCTCTGTCCGGCGGTCCGGGGACGACGCCACCGGGATCACATGATC CCTCTCGATGCTGAGTGGCCGCCGGTCCGGGGCCA-3 ‘，分别含上、下游同源臂的 42 个碱基。转化pSino-205至DHlOB/pBBRlRed-C，制备所得菌株的L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，D0MD10寡核苷酸电转化和筛选步骤同dnrH的基因敲除，得到rpsL-tet基因盒消除的重组克隆pSino-206。3. dnrU基因敲除基因敲除的原理和基本步骤同dnrH的基因敲除。由于dnrU和其上游基因dpsG为转录偶联表达，dpsG的终止密码子部分和dnrU的起始密码子部分重叠四寡核苷酸TCAT，dnrU基因敲除实验的选择是只保留TCAT这四个碱基，而删去所有其他碱基。由于dnrU基因下游的dnrV基因使用其自身的启动子，因此dnrU 的敲除不影响dnrV基因的表达。设计引物DOMD 11:5' -CGGACATCTCGCGGATGAGACGGACATGCGGGCGGGGCGGGCCGCCGCC GTCGCTGTCGAGATATGACGGTG-3 '，前50个碱基为dnrU基因读码框下游的50个核苷酸，后 22 个碱基为扩增 rpsL-tet 基因盒 5‘的引物；D0MD12 5‘ -CGCATAGCATGCTGATCTTCGTCAA CGAGAGGCTGCGAGCGGCGGCATGAGATGATAAGCTGTCAAACATGAG-3 '，前 50 个碱基为含 dnrU 基因和dpsG基因的四个重叠碱基TCAT的反向互补序列的3'的同源臂，后面23个碱基为扩增 rpsL-tet基因盒3'的引物。以pR6KRT质粒DNA为模板，扩增得到2. Ikb的含同源臂以及 rpsL-tet基因盒的打靶DNA。转化pSino-206至DHlOB/pBBRlRed-C，制备所得菌株的L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，电转化和筛选步骤同dnrH的基因敲除，得到rpsL-tet基因盒取代了 dnrU基因的重组质粒命名为pSino-207。设计引物DOMD 13:5' -TCGCGGATGAGACGGACATGCGGGCGGGGCGGGCCGCCGCCGTCATGC CGCCGCTCGCAGCCTCTCGTTGACGAAGATCAGCAT-3 ‘，分别含上、下游同源臂的 42 个碱基。转化pSino-207至DHlOB/pBBRlRed-C，制备所得菌株的L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，D0MD13寡核苷酸电转化和筛选步骤同dnrH的基因敲除，得到 rpsL-tet基因盒消除的重组克隆pSino-208。实施例4将doxA基因置于假单胞菌中诱导型高表达启动子的控制下阿霉素生物合成基因簇中的doxA基因编码氧化还原酶，催化道诺菌素羟基化生成阿霉素。但DoxA的催化反应并不完全，因此S.peucetius ATCC 29050原株同时产道诺菌素和阿霉素，且前者的产量还要高于后者。增加doxA基因的表达量，可使催化反应进一步地向阿霉素方向进行。为达到这一目的，选择了在恶臭假单胞菌KTM40中有效的xylS-Pm 强启动子表达系统。XylS和Rn分别为假单胞菌TOL质粒pffffO中降解芳香环化合物的meta 操纵元的调节基因和间甲基苯甲酸诱导的强启动子，Rii的作用受xylS的正向调控。Rii强启动子的高表达驱使doxA基因的高表达。采用重组工程法引入xylS-Pm的原理和步骤基本上同dnrH的基因敲除，首先将 rpsL-tet基因盒插入到doxA基因的5'端，并去除共转录的doxA基因和dnrV基因之间的十个核苷酸，随后在链霉素的负筛选作用之下，以含同源臂的xylS-Pm取代rpsL-tet基因盒而达到xylS-Pm和doxA基因融合的目的。设计引物D0MD14 5' -GGCTTGCGCTGCATGGTCATCATGGGACACGCGAACGGGTCGACGGCCA CTCGCTGTCGAGATATGACGGTG-3 ‘，前50个碱基为含doxA基因起始密码子序列的5 ‘同源臂， 后 22 个碱基为扩增 rpsL-tet 基因盒 5'的引物；D0MD15 5' -ACTGCGGGAGGGGTACCCCGCGG CGGCGGGCGGTGCCTCGTGAGCGGCGAGATGATAAGCTGTCAAACATGAG-3 '，前 50 个碱基为含 dnrV 基因开放阅读框末端的3'的同源臂，后23个碱基为扩增rpsL-tet基因盒3'的引物。以 PR6KRT质粒DNA为模板，扩增得到2. Ikb的含同源臂以及rpsL-tet基因盒的打靶DNA。转化pSino-208至DHlOB/pBBRlRed-C，制备所得菌株的L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，电转化和筛选步骤同dnrH的基因敲除，得到rpsL-tet基因盒取代doxA基因和dnrV基因之间序列的重组质粒pSino-209。设计引物D0MD16 :5' -GGCTTGCGCTGCATGGTCATCATGGGA CACGCGAACGGGTCGACGGCC ACACATGTTCATGACTCCATTATTATTG-3 '，前50个碱基为含doxA基因起始密码子序列的5 ‘ 同源臂，后 26 个碱基为扩增 Pm端的引物；D0MD17 5' -ACTGCGGGAGGGGTACCCCGCGGCGGCGGG CGGTGCCTCGTGAGCGGCGATCAAGCCACTTCCTTTTTGCATTG-3 '，前 50 个碱基为含 dnrV 基因开放阅读框末端的3'的同源臂，后M个碱基为扩增xylS端的引物。以PJB861质粒DNA为模板，PCR扩增得到1. 8kb的产物，即为含xylS-Pm的打靶DNA。转化pSino-209至DHlOB/pBBRlRed-C，制备所得菌株的L-阿拉伯糖诱导重组酶基因表达的电转化感受态细胞，含同源臂的xylS-Rii的电转化和筛选步骤同dnrH的基因敲除，得到xylS-Pm取代rpsL-tet基因盒的重组质粒pSino-210。在此质粒中，doxA由Rii启动子所驱动表达。实施例5改造后的阿霉素生物合成基因簇的异源表达1.三亲本结合转移法转化恶臭假单胞菌KTM40以P. putida KT2440为宿主菌，E. coli HB101/pRK2073为辅助转移的菌株，E. coli DH10B/pSino-209为含待转化DNA的菌株。将三个菌株以三亲本结合转移法进行操作，以卡那霉素抗性筛选，以10%的蔗糖进行负筛选，最终的得到改造后的阿霉素生物合成基因簇整合至P. putida KT2440基因组trpE和trpC之间的菌株。2.基因型的验证设计引物DEl :5 ‘ -TCAAGGCCTTGGCCCGTTGGC-3 ‘，是针对 trpE 上游基因 gph 的引物；DE2:5' -TGTTCAGGTGCACCTGTAGGC-3‘，是针对阿霉素生物合成基因簇中dnrL基因的引物；DE3 5 ‘ -ATATTGCTGAAGAGCTTGGCG-3 ‘，是针对卡那霉素基因kan的引物；DE4 5' -TAGACCAGTGCAACGTTCACC-3‘，是针对 trpC 下游基因 PP_0423 的引物。
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随机挑取四个菌株，以它们的基因组DNA为模板，DE1、DE2和DE3、DE4为引物分别扩增得到1. 2kb的目的片段，与预期完全一致。将其中一个菌株的两个目的片段克隆后测序，序列结果完全正确，表明阿霉素生物合成基因簇已整合至恶臭假单胞菌KTM40的基因组。最终将基因型正确的菌株命名为P. putida Sino-HDR0通过同源重组法获得P. putida Sino-HDR的示意图如图1所示。P.putida Sino-HDR基因型验证的PCR结果如图2所示。实施例6 P. putida Sino-HDR发酵产物的分析通过发酵培养，采用高效液相色谱(HPLC)法检测发酵产物，鉴定P. putida SinoHDR菌株表达产生阿霉素和道诺菌素的情况。P. putida Sin0-HDR菌株发酵产物的高效液相色谱分析结果如图3所示。其中A 是道诺菌素和阿霉素标准品，道诺菌素和阿霉素标准品的含量分别为ι μ g，道诺菌素的保留时间为19. 7分钟，阿霉素的保留时间为10. 9分钟，B是P. putida Sino-DNDR菌株的发酵产物，C是P. putida Sino-HDR菌株的发酵产物。根据标准品的峰面积计算结果，可见基因工程菌株P. putidaSino-HDR的发酵产物阿霉素的产量为3. 51 μ g/ml，道诺菌素产量为0. 85 μ g/ml。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.产阿霉素的假单胞工程菌，其特征在于，其是将阿霉素生物合成基因簇中dnrH、 dnrX和dnrU基因删除并在编码氧化还原酶的doxA基因前插入来自假单胞菌的Rii启动子， 然后将改造后的基因簇整合至恶臭假单胞菌O^seudomonas putida)KTM40的基因组中而获得。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述阿霉素生物合成基因簇来源于链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 29050。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，改造后的基因簇是与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌O^seudomonasputic^KTM^的基因组中的。
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因或庆大霉素抗性基因。
5.根据权利要求3或4所述的工程菌，其特征在于，其是将改造后的阿霉素生物合成基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。
6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，其是将改造后的阿霉素生物合成基因簇与卡那霉素抗性基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，其为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Sino-HDR，保藏号 CGMCC N0. 4638。
8.权利要求7所述工程菌的培养方法，其特征在于，将所述工程菌接种于LB培养基中， 在30°C下进行培养。
9.权利要求1 7任一项所述的工程菌在生产阿霉素中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种产阿霉素的假单胞工程菌，其是将来源于链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 29050的阿霉素生物合成基因簇中dnrH、dnrX和dnrU基因删除并在编码氧化还原酶的doxA基因前插入来自假单胞菌的Pm启动子，然后将改造后的基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的基因组中构建得到的。为异源表达及大规模工业化生产阿霉素提供了基础，有着广泛的应用价值。
文档编号C12R1/40GK102229907SQ20111005677
公开日2011年11月2日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者廖志勇, 杨小芳 申请人:北京赛诺百奥生物技术有限公司