专利名称：一种表达小反刍兽疫病毒h基因的活载体疫苗及制备方法
技术领域：
本发明提供一种表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，同时还公开了其制备方法，用于预防小反刍兽疫的发生和流行，属于生物工程技术领域。
背景技术：
小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus，PPRV)引起的小反刍动物(特别是山羊和绵羊)的烈性，接触性传染病，小反刍兽疫作为一种病毒性疾病，还没有有效的药物进行治疗，该病主要依靠疫苗免疫进行预防。目前，世界上预防该病还是以传统的弱毒苗为主，但伴随着生命科学的迅速发展，在新型疫苗的研究方面已经取得了一定进展。基因疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗、活载体疫苗等逐渐成为新型疫苗的代表。特别是病毒活载体疫苗，由于其只表达目的蛋白抗原，克服了弱毒疫苗毒力返祖及死苗灭活不确实的缺点，免疫效果确实，同时可以达到一次免疫预防多种疾病的作用，因此倍受研究人员青睐。经检索未见以犬2型腺病毒为载体小反刍兽疫病毒H基因重组活载体疫苗的文献报道。
发明内容
本发明提供一种表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，具有良好的免疫保护效果，无毒副作用，制品容易保存，便于运输，保质期限长。本发明还提供上述表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗的制备方法，生产工艺简单，适合于工业化生产。本发明提供的表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，其特征在于以犬2型腺病毒为载体的重组小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗。本发明的技术解决方案如下
1.小反刍兽疫病毒保护性抗原基因的克隆通过RT-PCR方法获得小反刍兽疫保护性抗原H基因的全长基因；
2.重组质粒的构建将目的基因克隆入含有CAV-2全基因组的载体质粒中，重组质粒缺失了病毒基因组部分E3区；
1)通过PCR方法将CAV-2全基因组克隆入质粒pPoly2中，获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD J^BstB I + Hind III酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV-2，其特征是含有CAV-2全基因组；
2)将经步骤1获得的小反刍兽疫病毒保护性抗原H基因经酶切及体外连接的方法克隆到真核表达载体PVAX中，获得真核表达质粒pVAX-H，其特征是含有目的基因表达盒，包括巨细胞病毒(CMV)启动子、目的基因和多聚A (polyA)结构；
3)将真核表达质粒pVAX-H与含有CAV-2基因组E3区片段的质粒pVAX_E3酶切后在体外连接，获得目的基因真核表达转移载体PVAX- Δ Ε3-Η，其特征是所含CAV-2基因组Ε3区部分基因被缺失；
4)真核表达转移载体pVAX-Δ Ε3-Η与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV_2经酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2-H，其特征是含有质粒pPoly2部分片段及缺失部分E3区的CAV-2基因组，其中E3区缺失部分由目的基因表达盒代替；
5)重组病毒的获得将重组质粒转染MDCK细胞，通过细胞生物合成系统复制、包装获
得重组病毒；
6)疫苗的制备将阳性重组病毒通过敏感细胞增殖后，加入保护剂制成冻干制品。本发明所述表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗的生产工艺，具体步骤如下
1)PCR方法获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD，经PstI+ Hind III酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒 pPoly2-CAV-2 ；
PCR引物
P1 5 gcg_tgc_cta_act_aca_aac_tca_at 5 gcg一gcc一gcg一cct一get一get一tga一ttt一tgt一gat一c P2 5 gcff-ffcc-ffca-ctc-ata-gaa-gta-ggc-agc-tcc-g 5 cgg-ccg-cat-cat-caa-taa-tat-aca-gga-caa~ag
2)用RNA提取试剂盒提取小反刍兽疫病毒基因组RNA；
3)RT-PCR方法获得H基因，片段长度为1830bp ；
PCR 上游引物5，-CCGGTACCATGGCCGCACAAAGGGAAAG-3，； 下游引物5，-GCGCTCGAGTCAGACTGGATTACATGTTACCTC-3，
4)以内切酶KpnI和Xho I酶切H基因及真核表达载体pVAXl，连接，获得含有小反刍兽疫病毒H的真核表达质粒pVAX-H ；
5)限制性内切酶MluI和Hae II酶切含有小反刍兽疫病毒H基因的真核表达质粒 pVAX-H，电泳回收H基因表达盒(pCMV-H- polyA)，利用DNA补平试剂盒将目的片段两粘性末端补平；Ssp I酶切含有CAV-2基因组E3区部分片段的质粒pVAX-AE3，为防止其自身连接，用小牛肠碱性磷酸酶对其5'端去磷酸化；将获得的H基因表达盒连接到pVAX-AE3的 E3区缺失处，并筛选H基因表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得了含小反刍兽疫H基因表达盒的穿梭质粒pVAX- Δ Ε3-Η ；
6)穿梭质粒pVAX-AE3-H与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV_2经限制性内切酶 NruI和Sal I酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2-H ；
7)重组质粒pCAV-2-H转染MDCK细胞，复制包装获得重组病毒CAV-2-H；
8)以重组病毒接种MDCK细胞，经转瓶悬浮培养增殖，加入明胶蔗糖作为保护剂，分装后冻干。为表明本发明所获得重组病毒的稳定性以及在免疫靶动物方 面的效果，下列试验给予证明
一、重组病毒CAV-2-H (rCAV-2-H)体外遗传稳定性试验
将rCAV-2-H接种MDCK细胞进行传代培养，传至30代。提取rCAV_2_H的第10代、15代、20代、25代、30代培养物DNA，分别以各代培养物NDA为模板，扩增H基因表达盒核酸片段(在两侧含有E3区的部分序列)，进行测序。结果与对第五代培养物的测序结果一致。这表明rCAV-2-H在体外具有良好的遗传稳定性。
PCR 引物上游5，-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3，
下游5，-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3， 二、CAV-2-H疫苗对山羊的安全性试验
随机取5只山羊，用CAV-2-H疫苗(1 X IO9TCID50/ ml)对其中的3只山羊进行攻毒，口服5ml/只、肌注5ml/只，共IOml/只；另两只山羊作为阴性对照，口服5ml生理盐水/只， 肌注5ml生理盐水/只，共IOml/只。对实验山羊进行隔离饲养，每天观察山羊的精神、食欲、体温与粪便等临床变化情况，每隔3天进行一次白细胞总数计数。观察21d。在饲养观察期间未见攻毒山羊体温升高、食欲减少、渴欲增加、沉郁、血便、咳嗽等感染症状，白细胞总数没有发生明显的波动。三、CAV-2-H疫苗对山羊的免疫原性实验
用CAV-2-H疫苗免疫6只八月龄山羊(抗CAV-2和PPRV的中和抗体效价均小于1:2)， 肌注，剂量IX IO8TCID5tl/只，间隔21d加强免疫，免疫前、第一次免疫后21d及第二次免疫后21d采血制备血清，56°C 30 min灭活，-20°C冻存待检。用中和试验分别检测山羊血清中抗CAV-2和PPRV的中和抗体。免疫前，山羊血清抗CAV-2和PPRV的中和抗体效价均小于 1 2，免疫2次后，山羊血清抗CAV-2抗体效价为1 512 1 1024，抗PPRV的中和抗体效价为 1:32 1:64。本发明的积极效果在于制备的重组病毒具有良好的遗传稳定性，以此病毒制备的疫苗免疫山羊后，可诱导山羊产生特异的抗病毒中和抗体，具有良好的免疫保护效果，无毒副作用，制品容易保存，便于运输，保质期限长，生产工艺简单，适合于工业化生产。
图1为表达小反刍兽疫病毒H基因的重组腺病毒活载体疫苗工艺路线制备图； 图2为正常MDCK细胞(10X 10)图片； 图3为比々￥-2-!1病毒感染1 0(细胞的病变(10\10)图片；
图4为rCAV-2-H病毒感染MDCK细胞的电镜超微结构(X 80000)图片。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例1
表达小反刍兽疫病毒H基因的重组腺病毒活载体疫苗的制备按照附图1所示的工艺路线制备重组腺病毒活载体疫苗，重组病毒电镜下具有腺病毒的一般特征，感染MDCK细胞后，可出现特异细胞病变，参见附图2、图3、图4。具体步骤如下
1、PCR方法获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD J^BstB I + Hind
III酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒 pPoly2-CAV/20 PCR 引物
P1: 5， _gcg_tgc_cta_act_aca_aac_tca_at_3， 5，-gcg-gcc-gcg-cct-gct-gct-tga-ttt-tgt-gat-c-3， P2 5，-gcg-gcc-gca-ctc-ata-gaa-gta-ggc-agc-tcc-g-3， -cgg-ccg-cat-cat-caa-taa-tat-aca-gga-caa~ag-3^ 02、用RNA提取试剂盒提取小反刍兽疫病毒基因组RNA，操作方法见试剂盒说明书。3、RT-PCR方法获得H基因，片段长度为1830bp。其中
RT 在20 μ 反应体系中分别加入提取的RNA 2μ ,5Χ反转录缓冲液4 μ , 10 mmol/L 的 dNTP2 μ , RNase Inhibitor (40 U/μ ) 0· 5 μ , 10 U/μ 的 AMV 反转录酶 0· 5 μ ，上游引物(25pmol/>L) 0. 5 μ ，下游引物(25 pmol/^L) 0. 5 μ , Oligod (T) (10 pmol/^L) 0· 5 μ , 8. 5 μ 的无RNase的DEPC水，充分混合后离心，42°C水浴1 1. 5 h。PCR 上游引物5，-CCGGTACCATGGCCGCACAAAGGGAAAG-3，； 下游引物5，-GCGCTCGAGTCAGACTGGATTACATGTTACCTC-3，。PCR反应体系中分别加入10XPCR反应缓冲液2 μ , 2. 5 mmol/L dNTP 4 μ ，上游引物(25 pmol/μυθ. 5 μ ，下游引物(25 pmol/^L) 0. 5 μ ，RT 产物 2. 5 μL, aq plus DNA 聚合酶(5 U/>L)0. 25 μ ，补加 ddH20 至 20 μ 。95°C预变性 5 min，94°C变性 40 s，60°C退火60 s，72°C延伸2 min，32个循环后，72°C延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。回收目的片段，克隆连接T载体。4、限制性内切酶Kpn I和Xho I酶切H基因及真核表达载体pVAXl，电泳回收，T4 DNA连接酶16°C连接过夜，获得含有小反刍兽疫病毒H基因的真核表达质粒pVAX-H。5、限制性内切酶Mlu I和Hae II酶切含有小反刍兽疫病毒H基因的真核表达质粒pVAX-H，电泳回收H基因表达盒(pCMV-H- polyA)，利用DNA补平试剂盒将目的片段两粘性末端补平。Ssp I酶切含有CAV-2基因组E3区部分片段的质粒pVAX-AE3，为防止其自身连接，用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)对其5'端去磷酸化。将获得的H基因表达盒连接到 pVAX-AE3的E3区缺失处，并筛选H基因表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得了含小反刍兽疫H基因表达盒的穿梭质粒pVAX- Δ Ε3-Η。6、穿梭质粒pVAX-AE3-H与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV_2经限制性内切酶Nru I和Sal I酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2-H。7、重组质粒pCAV-2-H转染MDCK细胞，复制包装获得重组病毒CAV_2_H。8、以重组病毒接种MDCK细胞，经转瓶悬浮培养增殖，加入明胶蔗糖作为保护剂， 分装后(5mL/瓶)冻干。为表明本发明所获得重组病毒的稳定性以及在免疫靶动物方面的效果，下列试验给予证明
一、重组病毒CAV-2-H体外遗传稳定性试验
将重组病毒CAV-2-H接种MDCK细胞进行传代培养，传至30代。提取重组病毒CAV-2-H 的第10代、15代、20代、25代、30代培养物DNA，分别以各代培养物NDA为模板，扩增H基因表达盒核酸片段(在两侧含有E3区的部分序列)，进行测序。结果与对第五代培养物的测序结果一致。这表明重组病毒CAV-2-H在体外具有良好的遗传稳定性。PCR 引 物上游5，-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3，
下游5，-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3，。二、CAV-2-H疫苗对山羊的安全性试验
随机取5只山羊，用CAV-2-H疫苗(1 X IO9TCID50/ ml)对其中的3只山羊进行攻毒，口服5ml/只、肌注5ml/只，共IOml/只；另两只山羊作为阴性对照，口服5ml生理盐水/只， 肌注5ml生理盐水/只，共IOml/只。对实验山羊进行隔离饲养，每天观察山羊的精神、食欲、体温与粪便等临床变化情况，每隔3天进行一次白细胞总数计数。观察21d。在饲养观察期间未见攻毒山羊体温升高、食欲减少、渴欲增加、沉郁、血便、咳嗽等感染症状，白细胞总数没有发生明显的波动。三、CAV-2-H疫苗对山羊的免疫原性实验
用CAV-2-H疫苗免疫6只八月龄山羊(抗CAV-2和PPRV的中和抗体效价均小于1:2)， 肌注，剂量IX IO8TCID5tl/只，间隔21d加强免疫，免疫前、第一次免疫后21d及第二次免疫后21d采血制备血清，56°C 30 min灭活，-20°C冻存待检。用中和试验分别检测山羊血清中抗CAV-2和PPRV的中和抗体。免疫前，山羊血清抗CAV-2和PPRV的中和抗体效价均小于 1 2，免疫2次后，山羊血清抗CAV-2抗体效价为1 512 1 1024，抗PPRV的中和抗体效价为 1:32 1:64。
权利要求
1.一种表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，其特征在于是以犬2型腺病毒为载体的表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗。
2.根据权利要求1所述表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗的制备方法，包括以下步骤1)小反刍兽疫病毒保护性抗原基因的克隆通过RT-PCR方法获得小反刍兽疫保护性抗原H基因的全长基因；2)重组质粒的构建将目的基因克隆入含有CAV-2全基因组的载体质粒中，重组质粒缺失了病毒基因组部分E3区；a)通过PCR方法将CAV-2全基因组克隆入质粒pPoly2中，获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD J^BstB I + HindIII酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV-2，其特征是含有CAV-2全基因组；b)将步骤1)获得的小反刍兽疫病毒保护性抗原H基因经酶切及体外连接的方法克隆到真核表达载体PVAX中，获得真核表达质粒pVAX-H ；其特征是含有目的基因表达盒，包括巨细胞病毒(CMV)启动子、目的基因和多聚A (polyA)结构；c)将真核表达质粒pVAX-H与含有CAV-2基因组E3区片段的质粒pVAX_E3酶切后在体外连接，获得目的基因真核表达转移载体PVAX- Δ Ε3-Η，其特征是所含CAV-2基因组Ε3区部分基因被缺失；d)真核表达转移载体pVAX-Δ Ε3-Η与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV_2经酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2-H，其特征是含有质粒pPoly2部分片段及缺失部分E3区的CAV-2基因组，其中E3区缺失部分由目的基因表达盒代替；e)重组病毒的获得将重组质粒转染MDCK细胞，通过细胞生物合成系统复制、包装获得重组病毒；f)疫苗的制备将阳性重组病毒通过敏感细胞增殖后，加入保护剂制成冻干制品。
全文摘要
本发明提供一种表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，同时还公开了其制备方法，制备的重组病毒具有良好的遗传稳定性，以此病毒制备的疫苗免疫山羊后，可诱导山羊产生特异的抗病毒中和抗体，具有良好的免疫保护效果，无毒副作用，制品容易保存，便于运输，保质期限长，生产工艺简单，适合于工业化生产。
文档编号C12N15/85GK102178947SQ20111006241
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者侯小强, 夏咸柱, 杨松涛, 王承宇, 王铁成, 秦峻岭, 阮洋, 高玉伟, 黄耕 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所