专利名称：与鸡肉质风味相关的adsl和lpl基因的hrm联合检测方法
技术领域：
本发明涉及一种联合、快速、准确筛选鸡肉质风味相关基因多态性的检测方法，属于农业生物技术领域。
背景技术：
优质肉鸡是指相对于外来白羽快大鸡种而言的一类肉用鸡种。我国的优质肉鸡生产经过三十多年的快速发展，已经成为产业特点突出、区域优势明显、市场份额持续扩大、 竞争力日趋强劲的农业支柱产业。2008年，我国全年上市优质鸡达到42亿只，产肉量380 万吨，已占我国鸡肉总产量的55%以上。与以往单纯看重肉鸡生长速度和体组成(产肉量) 的选育方向不同，优质肉鸡的育种、生产更应强调以肉品质和风味取胜。从遗传上讲，畜禽长速和肉质是两类相互制衡的选育性状，仅凭传统的育种手段，很难达到肉鸡产量、生长性能与肌肉风味物质同时提高的目标。而随着分子生物学技术的不断进步，采用分子遗传标记来辅助选育既肉质风味佳、又兼顾体重长速的优质肉鸡，不仅成为可能，并已日益成为现代家禽育种的发展方向。利用微卫星、单核苷酸多态性等分子标记，可以明显加快育种进程，提高育种效率。当前研究认为，与肉质风味密切相关的化学成分有氨基酸(特别是谷氨酸和甘氨酸)、肌苷酸(IMP)和肌内脂肪(IMF)，影响这些化学组成的候选基因很多，其中就包括腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因和脂蛋白酯酶(LPL)基因。肌肉IMP含量是决定肉质鲜味的主要物质基础，而ADSL是嘌呤核苷酸生物合成途径中可催化对IMP最终含量有重要影响的两步反应的酶，对维持正常细胞分裂和代谢起到必不可少的作用。束婧婷等(2005)对鸡ADSL 基因的外显子2进行SNP分析，结果发现1个多态位点，其不同基因型间IMP含量差异显著。肌肉IMF与肉质口感呈正相关，影响肉的嫩度、剪切力、风味和多汁性，而LPL是脂肪细胞、骨骼肌细胞、心机细胞等实质细胞合成和分泌的一种糖蛋白，主要催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，产生可供组织利用的脂肪酸和单酰甘油，为脂质代谢的关键酶。牟彦双等(2005)采用PCR-SSCP和测序法分析了 LPL基因的核苷酸变异，结果发现， LPL基因的突变对鸡的活重、腹脂重有显著影响。高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting curve,HRM)分析技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型方法。基于高效稳健的荧光定量PCR技术，HRM可以不受突变碱基的位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行产物熔解程序，即可完成扫描新基因突变、筛查单核苷酸多态性、区分插入/缺失或其他突变类型、 测定甲基化DNA比率等等工作。HRM的主要原理是根据DNA序列长度、GC含量以及碱基互补差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨精度可使其达到对单个碱基差异的检测能力。HRM技术操作简便快速、成本低廉、结果准确，能够实现真正意义上的闭管操作。目前，可用于基因多态性分析的其他研究手段主要有RFLP、SSCP, Taqman探针定量PCR、DNA直接测序等技术，但大都操作繁琐，费时费力费钱，重复性差，不具备对大批量样本快速准确检测的实用性。例如RFLP法将PCR与限制性酶切相结合，实验操作繁琐，检测周期长，存在第一酶切不完全导致的假阳性。PCR-SSCP法不能检测突变位置，且可能存在假阴性，结果的可重复性不高。Taqman探针法只能检测已知SNP，而且成本价格相对高昂。 DNA直接测序法周期长、代价昂贵，多基因多位点的检测需要多次反应来完成，所以对一些较大的、外显子较多的基因不宜采用；而且直接测序法也不适用于临床对大量标本进行检测。
发明内容
本发明 的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种基于HRM基因分型技术的鸡肉质风味相关基因(ADSL和LPL基因)联合检测方法。该方法简便快速、成本低廉、结果准确，解决了多个基因分批操作的麻烦，有助于加快筛选风味物质含量较高的肉鸡个体，指导优质鸡肉质风味的分子标记选育。与鸡肉质风味相关的ADSL和LPL基因的HRM联合检测方法，其特征在于包括以下步骤a)提取鸡血液基因组模板DNA，利用荧光定量PCR反应程序同时进行ADSL和LPL 基因扩增，其中，特异性引物序列为ADSL 基因上游引物5 ‘ GAAGAAGCTGCGCCATGATGTG 3 ‘ADSL 基因下游引物5 ‘ CCAGCTCTGCAGGCAGGAAAATGA 3 ‘LPL 基因上游引物5 ‘ GTGAAGGATGGGAGGGACAGC 3 ‘LPL 基因下游引物5 ‘ CCCTACAAATCAACCTGGCTCCATC 3 ‘；b)运用高分辨熔解曲线分析方法对扩增后目的基因的Tm值进行检测；c)根据ADSL和LPL基因分型标准，筛选出突变位点。进一步地，步骤b中荧光定量PCR反应体系为
权利要求
1.与鸡肉质风味相关的ADSL和LPL基因的HRM联合检测方法，其特征在于包括以下步骤a)提取鸡血液基因组模板DNA，利用荧光定量PCR反应程序同时进行ADSL和LPL基因扩增，其中，特异性引物序列为ADSL 基因上游引物5’ GAAGAAGCTGCGCCATGATGTG 3’ ADSL 基因下游引物5’ CCAGCTCTGCAGGCAGGAAAATGA 3’ LPL 基因上游引物5’ GTGAAGGATGGGAGGGACAGC 3’ LPL 基因下游引物5，CCCTACAAATCAACCTGGCTCCATC 3，；b)运用高分辨熔解曲线分析方法对扩增后目的基因的Tm值进行检测；c)根据ADSL和LPL基因分型标准，筛选出突变位点。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤b中荧光定量PCR反应体系为 灭菌蒸馏水5. 5 μ 荧光试剂7. 5 μ ADSL上游引物 0.25 μ ADSL下游引物 0.25 μ LPL上游引物 0. 25μ LPL下游引物 0. 25μ 模板 DNA1.0 μ 。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤b中荧光定量PCR反应程序包括 PCR扩增程序和产物熔解程序。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增程序为98°C预变性3分钟； 98°C变性5秒，62°C退火/延伸5秒，40个循环；产物熔解程序为初始熔解温度75°C，启动升温熔解至95°C，每10秒上升0. 2°C，熔解全程实时检测荧光信号。
5..如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤c中ADSL基因分型标准为CC野生型Tm值84. 5 "C ；CT突变型Tm值81. 2。C ；TT突变型Tm值79. 4。C ；LPL基因分型标准为CC野生型Tm值84. 2 V ；CT突变型Tm值82. 8 V ；TT突变型Tm值80. 4 V。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a中模板DNA从鸡的外周血样中提取。
全文摘要
本发明公开了一种与鸡肉质风味相关的ADSL和LPL基因的HRM联合检测方法，其特征在于包括以下步骤a)提取鸡血液基因组模板DNA，利用荧光定量PCR反应程序同时进行ADSL和LPL基因扩增；b)运用高分辨熔解曲线分析方法对扩增后目的基因的Tm值进行检测；c)根据ADSL和LPL基因分型标准，筛选出突变位点。该方法简便快速、成本低廉、结果准确，解决了多个基因分批操作的麻烦，有助于加快筛选风味物质含量较高的肉鸡个体，指导优质鸡肉质风味的分子标记选育。
文档编号C12Q1/68GK102154504SQ20111009936
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者刘军, 李庆海, 楼立峰, 章学东, 范京辉 申请人:杭州市农业科学研究院