专利名称：培养淡水微藻及其用于生产生物柴油以及神经酸的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微藻，微藻筛选的方法，以及利用藻类生产各种不同产物的方法。具体地，本发明涉及一株淡水微藻藻株Mychonastes sp. HS0-3-1，和将所述藻株用于大规模培养和用于生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸和/或生物质成分的应用。
背景技术：
由于能源危机和全球变暖，加之人类对环境保护问题的重视，以及对未来化石燃料涨价的预期，因此急需开发一种可再生生物能源作为替代品，寻找一种可再生的绿色能源成为科研人员的研究热点，其中微藻柴油被认为是最有希望的可再生绿色能源。微藻具有光合效率高，不与粮食作物竞争土地和淡水，同时微藻还能用于污水处理以及碳捕获，因此微藻生物燃料也有利于环境保护和公共健康。微藻的大范围的培养最早始于19世纪60年代，19世纪70年代，由于能源危机，美国国家可再生能源实验室发动了水生生物物种计划(ASP)，探索利用微藻生产可再生能源的可行性，筛选到生长速度快、油脂含量高的微藻300余株；我国也在近年来开展了一系列的运用微藻生产生物燃料的项目，取得了巨大的成绩。目前成本问题成为制约微藻产油产业化道路的瓶颈问题，通过技术改进和经济化生产是降低成本的主要方式，有关微藻的收集、油脂的高效、低能提取的问题经长时间的探索与尝试尚未得到解决，故一种可规模化培养的能源微藻良种的选育、经济上可行的能源微藻的培养方式和高附加值产品的开发成为当前降低生产成本的有力途径。神经酸(C24:1)最早发现于哺乳动物的神经组织，是神经组织中生物膜的重要组成成分。目前主要来源于鲨鱼脑及鲨鱼油，是国内外高品质的保健品添加剂。神经酸是大脑神经纤维和神经细胞的核心天然成分。神经酸的缺乏将会引起脑中风后遗症、老年痴呆、脑瘫、脑萎缩、记忆力减退、失眠健忘等脑疾病。神经酸人体自身又很难生成，只能靠体外摄取来补充神经酸能完整通透过血脑屏障，直接作用于神经纤维进行修复疏通，让受损、脱落的保护鞘再生，溶解堵塞通道的坏死组织，诱导神经纤维的自我生长及分裂，使神经细胞所产生的信息及外界的信息都能顺利通过神经纤维传递，以此激活受损、病变及休眠的神经细胞，重塑神经网络，恢复病人在语言、记忆、感觉、肢体等方面的部分或全部功能。
发明内容
在第一方面，本发明的目的是针对目前生物柴油原料生产能力不足，提供一种油脂含量高、副产品经济价值高的新分离的淡水微藻藻株Mychonastes sp. HS0-3-1，其中所述分离的微藻藻株基因组包括一个以上选自由下列序列组成的组中的核酸序列SEQ ID NO :1(18S-1758),SEQ ID NO 2 (ITS1-333), SEQ ID NO :3 (ITS2-346)。所述藻株的形态特征见图4，藻细胞圆形，单细胞存在，直径2-3 μ m,大小均勻，藻细胞表面无特殊结构如鞭毛、 网状结构、突起等。所述Mychonastes sp. HS0-3-1藻株于2011年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No. 4654。在第二方面，本发明提供第一方面的微藻藻株用于大规模培养的应用。微藻藻株可以在18°C 32°C温度条件下，50 IOOOymol photons πΓ、—1光照强度下正常生长。 优选地，培养第一方面的微藻藻株的培养基为BG-Il培养基，培养方法为连续培养方法， 所述方法包括初始培养和扩大培养，所述初始培养的条件为连续光照，光照强度可以为 60-500 μ mo 1 photons nT2s4 (在一个实施方案中，光照强度可以为60-300 μ mol photons πΤΥ1。在另一个实施方案中，光照强度可以为60-80 μ mol photons πΓ2 Γ)，温度为24°C 30°C ；扩大培养的条件连续光照，光照强度可以为60-1000 μ mol photons JiT2iT1 (在一个实施方案中，光照强度可以为200 600 μ mol photons IrT2iT1。在另一个实施方案中，光照强度可以为280-320 μ mol photons mH，温度为24°C 30°C。所述微藻藻株可以在 0. 15g/L到15g/L的NaNO3浓度下培养。在一个实施方案中，所述微藻藻株可以在0. 15g/L 到3g/L的NaNO3浓度下培养。所述微藻藻株可以在0. 05g/L到lg/L的磷酸氢二钾浓度下培养。在另一个实施方案中，其中所述微藻藻株可以在约0. 08g/L的磷酸氢二钾浓度下培养。在一些实施方案中，所述NaNO3浓度可以为0. 15g/L、0. 38g/L、1.50g/L、3. 00g/L。在第三方面，本发明提供第一方面的微藻藻株用于生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸和/或生物质成分的应用。所述微藻藻株可以在0. 15g/L到15g/L的NaNO3浓度下培养。在一个实施方案中，所述微藻藻株在0. 15g/L到3g/L的NaNO3浓度下培养。所述微藻藻株可以在0.05g/L到lg/L的磷酸氢二钾浓度下培养。在另一个实施方案中，其中所述微藻藻株可以在约0. 08g/L的磷酸氢二钾浓度下培养。在一些实施方案中，所述NaNO3 浓度可以为0. 15g/L、0. 38g/L、1. 50g/L、3. 00g/L。在一个实施方案中，所述油脂包含不饱和脂肪酸亚麻酸(C18:3)和神经酸(C24:l)。所述的微藻培养方法，其具体操作步骤如下以BG-Il为培养基，向该培养基中接种该藻株HS0-3-1于三角瓶中，其中初始接种密度0075(1为0. 1-0. 3，然后在连续光照的条件下培养，光照强度为60 80 μ mol photons πι 温度为24°C 30°C，培养7 9天，扩大培养至400ml柱式培养器中，培养14天，离心藻细胞液，收获微藻细胞。所述的微藻在生物柴油中的生产应用，以微藻HS0-3-1为生物柴油原料，以BG-Il 为培养基，通过微藻的生长积累油脂。所述的微藻在神经酸中的生产应用，以微藻HS0-3-1为神经酸原料，以BG-Il为培养基，通过微藻的生长积累神经酸。与现有技术相比，本发明专利具有以下优势应用潜力巨大利用微藻生产生物柴油具有巨大的潜力，本发明的筛选的微藻藻株为Mychonastes sp. HS0-3-1，属于一种少见的藻属，与其他微藻相比，该藻对于环境中氮的需求较大，能够在高氮的环境中积累细胞内的油脂与其他报道的藻株相比具有巨大的优势。油脂产率较高本发明的微藻油脂含量最高为57% (油脂占细胞干重)，培养周期 13天，油脂含量和培养周期均较优。副产品经济价值高该微藻在一般的培养条件下，培养13天后，细胞内不饱和脂肪酸组成丰富，经济价值较高的C18:3和C24:l含量丰富，分别达到细胞内油脂含量的8.6%,4.8%,在提取油脂的同时能够加以利用，可显著提高经济效益。利用本发明公开的微藻藻株Mychonastes sp. HS0-3-1生产生物柴油和神经酸，在生产生物柴油的同时，可以获得高附加值的神经酸产品，并且达到处理污水的需要，是一种生态友好、成本低廉的生产生物柴油和神经酸的生产技术。
图1藻细胞序列1 (18S rRNA)图2藻细胞序列2 (ITSl)
图3藻细胞序列3 (ITS2)图4微藻细胞扫描电镜形态图5气相色谱分析微藻油脂报告图6硝酸钠的含量为0. 15g/L时，气相色谱分析微藻油脂报告图7硝酸钠的含量为0. 30g/L时，气相色谱分析微藻油脂报告图8硝酸钠的含量为1. 50g/L时，气相色谱分析微藻油脂报告图9硝酸钠的含量为3. 00g/L时，气相色谱分析微藻油脂报告图10硝酸钠的含量为3. 00g/L，磷酸氢二钾含量为0. 08g/L时，气相色谱分析微藻油脂报告
具体实施例方式根据下列实施例，可以更好的理解本发明专利。实施例中，所描述的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当限制权利要求书中所详细描述的本发明的范围。实施例 1 :Mychonastes sp. HS0-3-1 藻株的分离Mychonastes sp. HS0-3-1分离于济南市郊养藕池，具体过程为用无菌瓶取适量养藕池水样，在实验室无菌条件下，涂布BG-Il培养基平板，置光照培养箱，25°C条件下培养至出现藻落，挑取多个藻落再进行多次划线分离的步骤，直至得到完全纯化的藻落。其中的一株命名为HS0-3-1，经18S rDNA和ITS序列的测序分析，鉴定为Mychonastes属物种.。在无菌条件下在固体平板上挑取Mychonastes sp. HS0-3-1单藻落，经反复划线挑取获得纯化的藻落(申请人于2011年3月4日将所述藻株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 100101)，保藏编号为 CGMCC No. 4654)。实施例2 =Mychonastes sp. HS0-3-1藻液的初始培养在实 验室条件下，将上述Mychonastes sp. HS0-3-1以试管斜面培养基划线保存， 或者以三角瓶液体培养基形式保存，所用培养基为BG-Il培养基，两种保存形式都是以2个月为一周期转接保存藻种的活性。用于接种的藻液一般为在200 μ mol photons πΓ、—1以下的光照、25°C下培养7 10天的新鲜藻液，OD75tl达到2.0，以10%的接种量(体积比) 接种至含有 50ml 灭菌 BG-Il 培养液(NaNO31500mg/L ；K2HP0440mg/L ；MgSO4 · 7H20 75mg/ L ；CaCl2 · 2H20 36mg/L ；柠檬酸 6mg/L ；柠檬酸铁铵 6mg/L ；Na2EDTA lmg/L ；NaC0320mg/L ； Η3Β032· 86mg/L ；MnCl2 · 4H20 1. 8 lmg/L ；ZnSO4 · 7H20 0. 222mg/L ；NaMoO4 · 2H20 0. 39mg/L ；CuSO4 ·5Η20 0. 079mg/L ；Co (NO3)2 ·6Η20 0. 049mg/L ；去离子水 1L，调节 pH 至 7. 4)的 IOOml 的三角瓶中；然后在连续光照的条件下培养，光照强度为60 80 μ mol photons πΓ、—1，温度为24°C 30°C，培养7 9天至指数生长期末期，获得Mychonastes sp. HS0-3-1藻液的初始藻液(此时0D750值为2. 0)。实施例3Mych0naSteS sp. HS0-3-1藻液的扩大培养及其用于油脂的生产(硝酸钠的含量为0. 15g/L)将实施例2获得的初始藻液，接种于250ml的灭菌BG-Il培养液(K2HP0440mg/ L ；MgSO4 · 7H20 75mg/L ；CaCl2 · 2H20 36mg/L ；柠檬酸 6mg/L ；柠檬酸铁铵 6mg/L ；Na2EDTA lmg/L ；NaC0320mg/L ；H3B032. 86mg/L ；MnCl2 · 4H20 1. 81mg/L ；ZnSO4 · 7H20 0. 222mg/L ； NaMoO4 · 2H20 0. 39mg/L ；CuSO4 · 5H20 0. 079mg/L ；Co (NO3)2 · 6H200. 049mg/L ；去离子水 1L， 调节PH至7. 4)中，其中硝酸钠的含量为0. 15g/L，接入细胞终浓度OD75tl为0. 2，采用柱式培养器(直径为42mm，长度为600mm，壁厚2mm，材质为普通玻璃，下同)，连续光照，光照强度为280 320 μ mol photons nT2s、温度为24°C 30°C，CO2浓度在3%，通气培养14天后，收集、干燥、称重，生物量达到1. 77g/L。将培养到15天，经离心后获得的藻渣，用冷冻干燥(Alphal_2LD plus，德国 Martin Christ，温度_55°C )24小时获得干燥粉。所述干燥粉的油脂提取采用氯仿_甲醇 (2 Lv ν)体系(50mg藻粉使用6ml的氯仿-甲醇混合液)，在30°C下ISOrpm振荡过夜， 离心后取上清液，并添加适量的甲醇和水，使氯仿、甲醇、水的体积比为10 10 9，离心分层后取下层氯仿层，并采用通氮气的方法使氯仿挥发干，残留的油脂经干燥后称重分析 (具体操作方法参照文献Bligh EG,Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 1959;377:911-7.)。油脂在氮气保护下干燥，称重分析后，获得的油脂含量为43. 3%。将得到的油脂用含2. 5%浓硫酸的甲醇2. 5ml 85°C转化3小时，脂肪酸成分的分析采用气相色谱法(Varian 450-GC，美国)，色谱检测条件如下使用CP-WAX58毛细管柱(25mX0. 25mm)，进样量为1 μ 1，分流比为1 30。升温程序100°C保持2min，以10°C /min升至250°C，保持3min。进样器温度为250°C，检测器温度为280°C。以面积归一法得到各脂肪酸组分的相对含量，脂肪酸标准品为Sigma公司产品。分析结果为不饱和脂肪酸C18:3和C24:1 (神经酸)含量达到细胞内油脂含量的 8. 0%、2. 1%。气相色谱图如图6。实施例4 =Mychonastes sp. HS0-3-1用于油脂的生产(硝酸钠的含量为0. 38g/L)将实施例2中获得的Mychonastes sp. HS0-3-1初始藻液接种于250ml的灭菌 BG-Il培养液中，培养基以及培养条件与实施例3同，除了其中硝酸钠的含量为0. 38g/L， 接入细胞终浓度OD75tl为0. 2，连续光照，光照强度为280 320 μ mol photons πι 温度为24°C 30°C，CO2浓度在3%，通气培养14天后，收集、干燥、称重，生物量达到2. 52g/L。 培养到15天，用氯仿甲醇水(1 1 0.8)抽提细胞内油脂(具体提取方法同实施例3)，含量为47.3%。用含2. 5%浓硫酸的甲醇2.5ml 85°C转化3小时，脂肪酸成分的分析采用气相色谱法(Varian 450-GC，美国)，色谱检测条件如下使用CP-WAX58毛细管柱 (25mX0. 25mm)，进样量为1μ 1，分流比为1 30。升温程序100°C保持2min，以10°C / min升至250V，保持3min。进样器温度为250°C，检测器温度为280°C。以面积归一法得到各脂肪酸组分的相对含量，脂肪酸标准品为Sigma公司产品。分析结果为不饱和脂肪酸 C18:3和C24:l(神经酸)含量达到细胞内油脂含量的8. 1%、2.9%。气相色谱图如图7。实施例5 =Mychonastes sp. HS0-3-1用于油脂的生产(硝酸钠的含量为1. 50g/L)将实施例2获得的Mychonastes sp. HS0-3-1初始藻液接种于250ml的灭菌BG-11 培养液中，培养基以及培养条件与实施例3同，除了其中硝酸钠的含量为1.50g/L，接入细胞终浓度(》75(1为0. 2，连续光照，光照强度为280 320 μ mol photons πΓ、—1，温度为24°C 30CO2浓度在3%，通气培养14天后，收集、干燥、称重，生物量达到3. 10g/L。培养到 15天，用氯仿甲醇水(1 1 0.8)抽提细胞内油脂(具体方法同实施例3)，含量为 57. 0%。用含2. 5%浓硫酸的甲醇2. 5ml 85°C转化3小时，脂肪酸成分的分析采用气相色谱法(Varian 450-GC，美国)，色谱检测条件如下使用CP-WAX58毛细管柱(25mX0. 25mm)， 进样量为1 μ 1，分流比为1 30。升温程序100°C保持2min，以10°C /min升至250°C，保持3min。进样器温度为250°C，检测器温度为280°C。以面积归一法得到各脂肪酸组分的相对含量，脂肪酸标准品为Sigma公司产品。不饱和脂肪酸C18:3和C24:l(神经酸)含量达到细胞内油脂含量的6. 3%,4. 8%。气相色谱图如图8所示。实施例6 =Mychonastes sp. HS0-3-1用于油脂的生产(硝酸钠的含量为3. 00g/L)将实施例2获得的Mychonastes sp. HS0-3-1初始藻液接种于250ml的灭菌BG-11 培养液中，培养基以及培养条件与实施例3同，除了其中硝酸钠的含量为3. 00g/L，接入细胞终浓度(》75(1为0. 2，连续光照，光照强度为280 320 μ mol photons πΓ、—1，温度为24°C 30CO2浓度在3%，通气培养14天后，收集、干燥、称重，生物量达到3. 29g/L。培养到 15天，用氯仿甲醇水(1 1 0.8)抽提细胞内油脂(具体方法同实施例3)，含量为 49. 3%。用含2. 5%浓硫酸的甲醇85°C 2. 5ml转化3小时，脂肪酸成分的分析采用气相色谱法(Varian 450-GC，美国)，色谱检测条件如下使用CP-WAX58毛细管柱(25mX0. 25mm)， 进样量为1 μ 1，分流比为1 30。升温程序100°C保持2min，以10°C /min升至250°C，保持3min。进样器温度为250°C，检测器温度为280°C。以面积归一法得到各脂肪酸组分的相对含量，脂肪酸标准品为Sigma公司产品。不饱和脂肪酸C18:3和C24:l(神经酸)含量达到细胞内油脂含量的5.9%、2.9%。气相色谱图如图9。实施例7 =Mychonastes sp. HS0-3-1用于油脂的生产(硝酸钠的含量为3. 00g/L, 磷酸氢二钾含量为0. 08g/L)将实施例2获得的Mychonastes sp. HS0-3-1藻液接种于250ml的灭菌BG-11培养液中，培养基以及培养条件与实施例3同，除了其中硝酸钠的含量为3. 00g/L，磷酸氢二钾含量为0. 08g/L,接入细胞终浓度OD75tl为0. 2，连续光照，光照强度为280 320 μ mol photons HT2iT1,温度为24°C 30°C，CO2浓度在3%，通气培养14天后，收集、干燥、称重，生物量达到3. 16g/L。培养到15天，用氯仿甲醇水(1 1 0.8)抽提细胞内油脂(具体方法同实施例3)，含量为39. 1%。用含2. 5%浓硫酸的甲醇2. 5ml 85°C转化3小时，脂肪酸成分的分析采用气相色谱法(Varian 450-GC，美国)，色谱检测条件如下使用CP-WAX58 毛细管柱(25mX0. 25mm)，进样量为1μ 1，分流比为1 30。升温程序100°C保持2min，以 IO0C /min升至250°C，保持3min。进样器温度为250°C，检测器温度为280°C。以面积归一法得到各脂肪酸组分的相对含量，脂肪酸标准品为Sigma公司产品。不饱和脂肪酸C18:3 和C24:l(神经酸)含量达到细胞内油脂含量的7.3%、1.8%。气相色谱图见图10。
权利要求
1.一株淡水微藻藻株Mychonastes sp. HS0-3-1，其特征在于其保藏编号是CGMCC No.4654。
2.权利要求1的微藻藻株用于大规模培养的应用。
3.权利要求2的应用，其中所述微藻藻株在0.15g/L到15g/L的NaNO3浓度下培养。
4.权利要求2的应用，其中所述微藻藻株还在0.05g/L到lg/L的磷酸氢二钾浓度下培养。
5.权利要求2-4中任一项的应用，其中培养所述微藻藻株的培养基为BG-Il培养基，培养方法为连续培养方法，所述方法包括初始培养和扩大培养，所述初始培养的条件为连续光照，光照强度为60 500 μ mol photonsn^s—1，温度为20°C 32°C ；扩大培养的条件连续光照，光照强度为60 IOOOtmol photons πΓ、—1，温度为20°C 32°C。
6.权利要求1的微藻藻株用于生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸和/或生物质成分的应用。
7.权利要求6的应用，其中所述油脂包含不饱和脂肪酸亚麻酸C18 3和神经酸C24 1。
8.权利要求6的应用，其中所述油脂的生产在0.15g/L到15g/L的NaNO3浓度下进行。
9.权利要求6的应用，其中所述油脂的生产在0.05g/L到lg/L的磷酸氢二钾浓度下进行。
全文摘要
本发明公开了一株微藻藻株Mychonases sp.HSO-3-1，及其用于生产生物柴油的应用，同时该藻株可用于高价值的神经酸的生产。本发明还公开了上述藻株在不同培养基成分下的生长状况和油脂含量。利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸C18:3，和神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品，是一种环保、成本低廉的生产生物柴油和高附加值副产品的生产技术。
文档编号C12R1/89GK102220241SQ201110119480
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者何茹, 刘君寒, 李福利, 袁程 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所