Tl固定化酶及其应用的制作方法

专利名称：Tl固定化酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品和化工领域。更具体而言，本发明涉及针对TL脂肪酶的固定化酶方法及其应用。
背景技术：
酶作为一种生物催化剂，具有底物选择性，反应条件温和，污染小等优势，克服了传统工业催化剂带来的反应条件苛刻，反应副产物污染环境等缺点，具有很好的应用潜力。寻找催化活力高，反应条件温和的酶，或是对现有酶进行改造使其更适应生产应用，是未来酶工程在工业中应用的主要发展方向。固定化酶技术是将游离的酶通过物理或者化学手段将其束缚或限制于一定区域内，使其仍然能进行特有的催化反应并能回收重复使用的一种技术。由于上述优点，使得很 多科研工作者展开了对固定化酶的细致研究。在1967年，固定化酶首次被应用在拆分氨基酸工业中。近年来随着有机化学、蛋白质化学、材料科学等的发展，固定化酶技术取得了长足的进步。脂肪酶是催化油脂发生水解、酯交换、酯化反应的一类酶，它能够特异性地在油水界面上发挥催化活性，在食品、造纸、皮革、洗涤剂、制药等工业上有着巨大的应用。然而，天然酶稳定性差，反应后难以纯化，不能重复利用，不仅降低了酶的使用效率，提高了生产成本，而且难以实现连续化操作，限制了其在工业上的应用。在此背景下，固定化酶技术成为解决上述生产瓶颈的一种有效途径。TL脂肪酶是在嗜热丝孢菌(Thermomyces Lanuginosus)中发现的一类脂肪酶,其主要用于油脂的水解、三甘油酯的改性及单甘脂和甘二酯的生产。液体的TL脂肪酶主要用于水解反应。固定化的TL酶用来催化酯交换反应，其优点是可以重复利用，降低生产成本。W08906278A1描述了一种固定化TL酶的方法，通过培养腐殖霉属的真菌或经过基因改造的腐殖霉属真菌获得含有脂肪酶的发酵液，以酚醛型或者丙烯酸型树脂为固定化载体，固定化过程为将一定量的一定PH值酶液加入处理好的弱碱性大孔型离子交换树脂中，在室温下震荡8h，然后水洗，室温真空干燥，得产品。EP1239045A1描述了一种固定化TL酶的方法，具体为将脂肪酶粉末溶解在磷酸缓冲液中，加入乙醇和聚丙烯型树脂ACXUREL MP1001，室温下震荡过夜。通过过滤收集固定化酶，用缓冲液清洗，室温下进行干燥。然而，到目前为止，市场上现有的TL固定化酶并不能满足生产要求。其催化的酯交换反应中发现产物中存在大量的皂，大量浪费原料，增加成本，分析其原因可能是不同类型的载体与酶结合的过程中存在一些无法克服的技术问题造成或者载体与酶固定过程中与反应介质的冲突。因此目前固定化的TL需要大量的油脂洗脱，造成大量的原料浪费。同时为下游的分离提纯带来了巨大的困难，限制了其在油脂工业上的应用。因此，本领域中迫切需要开发出新的固定化TL酶方法，使得TL酶保持较高活力且在反应中不产生皂，从而扩大TL脂肪酶在食品工业的应用范围，并克服了现有固定化TL酶在生产中产生皂的问题。

发明内容
本发明的目的之一正是提供一种新的TL酶固定化方法。本发明的另一主要目的是提供一种固定化的TL酶。本发明的目的还在于提供本发明的固定化TL酶在工业中的应用。在本发明的第一方面中，提供了一种制备固定化脂肪酶的方法，所述方法包括步骤a)对载体进行前处理，所述载体选自离子交换树脂或骨架为聚苯乙烯的大孔吸附树脂；
b)提供脂肪酶，并任选在其中加入酶蛋白交联剂；c)将步骤a)中所得的经前处理的载体与步骤b)中所提供的脂肪酶接触，使所述脂肪酶固定于所述经前处理的载体；d)干燥步骤c)中所得的固定有脂肪酶的载体，以获得所述固定化脂肪酶。在一个优选例中，所述聚苯乙烯的大孔吸附树脂可为聚苯乙烯-二乙烯苯骨架的大孔吸附树脂。在本发明的一个实施方式中，所述载体选自极性大孔吸附树脂、非极性大孔吸附树脂、阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。在本发明的另一个实施方式中，所述非极性大孔吸附树脂选自D101、HPD100A、Amberl iteXAD-4、HPD100, HPD300、HPD700、X_5、XAD-4 或 HP20 ；所述极性大孔吸附树脂选自D201、LSA-10或Amberlite XAD7HP ；所述阳离子交换树脂选自D113、DOOl或Ambetlite IRC50 ；所述阴离子交换树脂选自D301或Styrene-DVB 201X2。在本发明的另一个实施方式中，所述大孔吸附树脂的前处理是如下进行的将载体置于水中浸泡去杂，然后用溶剂浸泡I 24h以去除有机杂质和不溶物，再用水洗去所述溶剂，其中所述溶剂为乙醇、正己烷、丙酮或石油醚；所述离子交换树脂的前处理是如下进行的用O. 05mol/L lmol/L的碱液和酸液交替浸泡或冲洗所述树脂1-5次，然后仅用O. 05mol/L lmol/L的碱液再次浸泡或冲洗树脂I次，再用水洗至水呈中性。在一个优选例中，所述水为去离子水、蒸馏水或双蒸水。在另一个优选例中，大孔吸附树脂的前处理中所用的乙醇是浓度范围为100% -50% (V/V)的乙醇。在另一个优选例中，大孔吸附树脂的前处理中所述溶剂的添加量范围为树脂体积的O. 5-10倍，优选1-5倍。在另一个优选例中，离子交换树脂的前处理中的所述酸选自HC1、H2SO4或H3PO4,所述碱选自NaOH、氨水或Κ0Η。在另一个优选例中，每次碱液和酸液浸泡或冲洗的时间为1-24小时。在另一个优选例中，所述离子交换树脂的前处理方法为以树脂与碱液或酸液
I: I I : 5、优选I : I. 5 I : 3、更优选I : 2的重量体积比(W/V)浸泡或冲洗所述树脂，顺序为先碱后酸，重复数次后最后一遍用碱液处理，然后用水洗至水呈中性。在另一个优选例中，将经过处理的载体浸泡在去离子水(或蒸馏水、双蒸水)中保存备用。在本发明的另一个实施方式中，步骤b)中所提供的脂肪酶选自嗜热丝孢菌(Thermomyces Lanuginosus)的发酵产物；通过基因工程或蛋白质工程改造而得的脂肪酶；或市售的脂肪酶。在一个优选例中，所述基因工程或蛋白质工程改造而得的脂肪酶是化学修饰的酶、蛋白质工程的突变体或基因工程菌产生的酶。在另一个优选例中，所述市售的脂肪酶优选为丹麦诺维信公司的LipozymeTLIOOLo·在本发明的另一个实施方式中，所述脂肪酶未经任何前处理而用于步骤c)中。在另一个优选例中，可对所述脂肪酶进行稀释。在本发明的另一个实施方式中，所述酶蛋白交联剂选自戊二醛溶液、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺、明胶或精胺。在一个优选例中，所述酶蛋白交联剂的用量为酶液体积的O. 001-0. I (V/V)，优选戊二醛的用量为每ml酶液中加入O. 01 O. Iml的I %戊二醛溶液或等比例其它浓度戊二
醛溶液。在本发明的另一个实施方式中，步骤c)中，所述经处理的载体与脂肪酶以g/ml计的重量/体积比为25 : I I : 25。在一个优选例中，所述比例优选为10 : I I : 10，更优选I : I。在另一个优选例中，使用水浴摇床、气浴摇床、搅拌机或磁力搅拌器使所述经处理的载体与脂肪酶接触和固定。在另一个优选例中，通过取上清测剩余蛋白含量来判断酶蛋白的固定程度，所述剩余蛋白含量的测定采用选自下组的方法进行考马斯亮蓝法、lorry法、双缩脲法、BCA法。在另一个优选例中，在剩余蛋白含量低于O. lmg/ml O. 5ml/ml时,终止固定步骤。在另一个优选例中，所述干燥是通过选自下组的方法进行的冷冻干燥、真空干燥、流化床干燥和室温干燥。在本发明的第二方面中，提供了一种固定化脂肪酶或其包装产品，所述的固定化脂肪酶是通过本发明的方法制备的。在一个优选例中，所述包装产品还包括包装物，优选容器或包装袋。在本发明的第三方面中，提供了一种进行酯交换、酯化、酸解或醇解反应的方法，所述方法包括使用本发明的固定化脂肪酶作为催化剂。在本发明的另一方面中，还提供了本发明的固定化脂肪酶在酯交换、酯化、酸解或醇解反应中的用途。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施例方式本发明人经过长期而深入的研究，发现了一种TL固定化酶方法，进一步说是一种在反应中不产生或极少产生皂的固定化酶方法。所述方法主要包括如下三个步骤载体的选择和前处理步骤、酶固定化步骤、以及干燥步骤。采用该方法制得的固定化脂肪酶在催化反应中活力较高，且不会产生大量的皂，具有极大应用前景。在此基础上，本发明人完成了本发明。I、载体的诜择及前处理本发明中采用了现有技术中未曾使用过的聚苯乙烯型大孔吸附树脂作为载体、或经处理的离子交换树脂为载体，出乎意料地使得以其固定化的脂肪酶具有高活性和稳定性，且在催化酯交换反应过程中不产生皂，操作简单，大大降低了油脂加工的成本。
如本文所用，术语“大孔吸附树脂”是指一类不含交换基团且具有大孔结构的高分子吸附树脂，其具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从溶液中有选择地吸附有机物。术语“聚苯乙烯型大孔吸附树脂”是指以聚苯乙烯为骨架的大孔吸附树脂。应理解该术语包括聚苯乙烯型大孔吸附树脂的各种亚型，例如聚苯乙烯-二乙烯苯骨架的树脂。可用于本发明中的聚苯乙烯型大孔吸附树脂可包括(但不限于)非极性的D101、HPD100A, AmberliteXAD-4、HPD100, HPD300、HPD700、X_5、XAD-4 或 HP20 ；极性的 D201、LSA-10, Amberlite XAD7HP等。在本发明中优选采用非极性的聚苯乙烯型大孔吸附树脂，更优选 D101、HPD100A、X-5。如本文所用，术语“离子交换树脂”是指带有官能团(有交换离子的活性基团)、具有网状结构、不溶性的高分子化合物，常用作离子交换层析介质。可用于本发明的离子交换树脂包括(但不限于)阴离子交换树脂，如D301、Styrene-DVB201X2等;阳离子交换树脂，如D113、D001、Ambetlite IRC50等。在本发明中优选采用阴离子交换树脂。本发明的载体还可为基于以上或其它树脂的改性或改良树脂，例如通过重氮化或氨基化改性的树脂或采用其它化学改性手段经功能化处理的树脂。可参考例如徐敬亮等，氨基功能载体固定化酶研究进展化工进展201029(3) :494-496。本领域技术人员应理解，可用于本发明中的聚苯乙烯型大孔吸附树脂和离子交换树脂除了以上用商品名所限定的具体产品以外，还包括任何具有其它商品名的市售树脂产品或通过自行制备或加工得到的树脂，只要它们具有与所述具体产品相同或相似的结构和吸附或交换性能。本发明中所用的这些载体(尤其是聚苯乙烯型大孔树脂)并不是现有商业化固定化酶中所用载体，并且本发明载体的处理方法也与常规处理方法存在差异。大孔吸附树脂的处理方法将载体置于去离子水(也可用蒸馏水，双蒸水)中浸泡去杂，然后用适当的溶剂浸泡I 24h，去除有机杂质和其它不溶物，再用去离子水(或蒸馏水、双蒸水)洗去溶剂，置于去离子水(或蒸馏水、双蒸水)中备用。其中，所用溶剂可为乙醇，优选浓度范围为100%-50% (v/v)的乙醇；或正己烷、丙酮、石油醚等有机溶剂。所述溶剂的添加量范围为树脂体积的O. 5-10倍，优选1-5倍。离子交换树脂用低浓度(O. 05mol/L-lmol/L)的碱液(例如NaOH、KOH或氨水)和酸液(例如HCl、H2SO4或H3PO4)(酸液和碱液的浓度均为O. 05mol/L-lmol/L)交替处理(处理方法可为例如先用碱液浸泡树脂I 3h (优选2h)，然后洗至中性，再用酸浸泡或冲洗I 3h (优选2h)后，洗至中性，重复该过程1-5次)树脂1-5次，最后一次处理仅用碱液，每次处理时间为1-24小时，处理完毕后用水(优选去离子水、蒸馏水或双蒸水)洗至水呈中性，再浸泡在水(优选去离子水、蒸馏水或双蒸水)中保存备用。经上述处理的离子交换树脂内部的PH保持为碱性，更有利于酶发挥其活性。2、酶固定化称取一定量处理过的载体于容器中，放入一定体积的TL酶液，于15 35°C (优选15 25°C，更优选室温)水浴摇床(可以采用气浴摇床，机械搅拌器和磁力搅拌器，涡流搅拌器的形式)中150rpm(10-200rpm)固定。固定完成后，取出吸附有酶的树脂吸去残留液体。脂肪酶的来源可以为嗜热丝孢菌在合适的培养条件下发酵而得，也可以是通过基 因工程，蛋白质工程等现代生物学手段改造而得，包括化学修饰的酶，蛋白质工程的突变体或基因工程菌产生的酶。脂肪酶的来源还可以为商业上可获得的，如丹麦诺维信公司的Lipozyme TLlOOL0用于固定化过程中的酶液可无需经过任何分离、纯化等改变其原有组成或环境的前处理。也可对酶液进行稀释或pH调节等处理，以适于反应。用于本发明的TL酶液中可包括(但不限于)I.通过培养嗜热丝孢菌(Thermomyces Lanuginosus)获得的发酵液(例如参见文献 Charlotte Pinholt, Mathias Fano, Charlotte ffiberg, Influence of glycosylationon the adsorption of Thermomyces lanuginosus lipase to hydrophobic andhydrophilicsurfaces, European Journal of Pharmaceutical Sciences 40(2010)273-281)；2.通过培养从嗜热丝孢菌得到脂肪酶基因的，用基因改性米曲霉经过发酵生产获得的脂肪酶酶液(例如参见同上文献Charlotte Pinholt, Mathias Fano, Charlotteffiberg, European Journal of Pharmaceutical Sciences 40(2010) :273-281)。3.市售的商品TL液体脂肪酶，例如诺维信公司的Lipozyme TLlOOL04.通过在如上所述的脂肪酶液或酶粉的溶液中加入酸碱调节TL酶液到合适的pH值和/或加入水(如蒸馏水、去离子水或双蒸水)调节到合适的蛋白浓度的酶液(例如参见文献 Daniel Otzen, Differential adsorption of variants of the Thermomyceslanuginosus lipase on a hydrophobic surface suggests a role for localflexibility, biointerfaces 2008 64 :223-228)。在本发明中也可在酶液中加入一定量的酶蛋白交联剂(即能起到交联酶蛋白作用的物质)，优选所述酶蛋白交联剂具有羟基或氨基，例如戊二醛溶液、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺、明胶或精胺等。所述酶蛋白交联剂的用量为每毫升酶液中添加0.0 10%(v/v)。例如戊二醛的用量为每毫升酶液中加入0.01 0. Iml的I %戊二醛溶液，也可采用等比例的其它浓度戊二醛溶液。处理过的树脂载体与TL酶液的重量(g)/体积(ml)比可为25 I I : 25，优选10 : I I : 10，更优选I : I (可根据情况适当调整比例)。
固定的方式，可采用水浴摇床或气浴摇床，搅拌机或磁力搅拌器等常规方式。固定期间，可每隔一定时间(例如5min Ih)取上清测剩余蛋白含量来判断酶蛋白的吸附/结合程度。剩余蛋白含量的测定可采用考马斯亮蓝法、lorry法、双缩脲法、BCA法等常规蛋白质定量检测方法进行。通常，在剩余蛋白含量低于O. lmg/ml O. 5ml/ml时，终止固定步骤。当然，本领域普通技术人员可根据具体的需要(如质量控制要求等)对固定程度进行调整和控制。本发明的固定化酶方法无需 对酶进行复杂的前处理(如分离、纯化等)，且出乎意料地获得了在固定化酶使用过程中显著降低皂的产生、甚至不产生皂的技术效果。3、干燥在固定化步骤进完成以后，通过干燥步骤去除体系中多余的水分，干燥的方式可选自冷冻干燥、真空干燥、流化床干燥和室温干燥等常规干燥方法。例如，冷冻干燥可在LABCNC0的冷冻干燥机(厂商美国Labcnco公司，型号freezone)上进行，参数可设置为(以下是各个步骤参数，这几个步骤构成一个降温过程)-200C 降温速率 I. 5°C /min, 2h (O. 5_5h)，-IO0C降温速率 I. 5°C /min,6h(3-10h)5°C降温速率 I. Ol0C /min, 15h, (10_24h)20°C降温速率 I. 16°C /min，20h(10-24h)真空干燥可在例如Binder真空干燥箱(厂商宾德亚太(香港)有限公司型号VD23)中进行，参数设置为在真空度为6mbar下，40°C干燥48h (24_60h)。流化床干燥可在流化床中进行(例如德国格拉特公司，型号midi glatt),参数设置为进风温度45 55°C (优选50°C )，干燥时间为O. 5 5h(优选I. 5h)。室温干燥可为将样品放在通风干燥的地方放置3 5天自然干燥。本领域普通技术人员可根据需要和条件对常规干燥方法进行选择。4、其它可诜步骤根据具体的需要，本发明的方法中还可额外具有如下的一个或多个可选步骤，例如(但不限于)I将酶液经过过滤除去小分子，以消除酶液中的小分子对酶活的影响。过滤方法可为例如在超滤膜器上进行超滤(厂商美国密理博公司，型号小型)，然后加入磷酸缓冲液(例如PH为5的O. lmol/L的磷酸缓冲液)，使得所得酶液与原酶液体系pH保持一致，并调整到适当的酶蛋白浓度。2在固定化步骤中可以加入糊精、白蛋白和/或海藻糖等物质增强酶的稳定性，它们各自的优选添加量为糊精I 20% (W/V);白蛋白O. 05 5% (W/V);海藻糖O. 1-10%(W/V)。可添加一种或多种上述物质，以获得所需的稳定效果。3对载体进行改性处理，通过化学手段接上活性基团。例如，可参考徐敬亮等，氨基功能载体固定化酶研究进展化工进展201029(3) :494-496。5、本发明的优诜实施方式本发明的一个示例性优选实施方式如下步骤一、载体的处理
将大孔吸附树脂载体置于去离子水中浸泡去杂，然后用乙醇浸泡过夜去除有机杂质和其他不溶物，用去离子水冲洗至无醇味，再浸泡在去离子水中保存备用。或者，将离子交换树脂用去离子水清洗，用5% NaOH和5% HCl交替处理2 5次，然后再用5% NaOH处理，每次处理两小时左右，然后用去离子水处理至水呈中性，于去离子水中浸泡备用。步骤二、酶固定化称取40g处理过的树脂载体于250ml三角瓶中，放入40ml TL酶液，于25°C水浴摇床中150rpm固定，期间每隔一定时间取上清测剩余蛋白含量来判断酶蛋白的吸附程度，然后取出放入培养皿中吸去残留液体。步骤三、干燥在固定化步骤进行完以后要出去体系中多余的水分即干燥，干燥可采用本领域中 常规的方式，例如冷冻干燥、真空干燥和室温干燥。应理解，上述优选实施方式只是示例性的，本领域普通技术人员基于本申请中的记载和本领域的常识可在不脱离本发明精神和范围的前提下，对各步骤及条件进行改变和优化。6、本发明固定化脂肪酶的应用可将本发明的固定化脂肪酶直接用于工业化生产中，也可将其制成包装产品以便于进行储藏、运输、销售和进一步使用。包装时，优选在无菌干燥低温的条件下灌装在洁净的容器中。储藏条件优选为低温干燥条件储藏，储存最适温度为4 20°C。优选在4°C 25°C的温度下进行运输。本发明的固定化脂肪酶或其包装产品可用于催化油脂发生水解、酯交换、酯化反应或催化酸解、醇解等，在食品、造纸、皮革、洗涤剂、制药等工业上有着巨大的应用。例如，本发明的固定化TL脂肪酶可用于水解、三甘油酯的改性及单甘脂和甘二酯的生产中，尤为优选用于催化酯交换反应。本发明的优点:I.本发明中采用提供了一种制备固定化TL酶的新方法，该方法中采用了在固定化领域不常见的大孔吸附树脂或经处理的离子交换树脂作为固定化载体，且无需对脂肪酶进行复杂的前处理，从而大大简化了生产步骤、降低了生产成本。2.解决了商品TL酶在油脂反应中产生皂的问题。3.本发明的固定化TL酶可以重复利用，从而降低了生产成本，提高了使用率。实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《生物化学与分子生物学实验教程》(梁宋平主编高等教育出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。TL酶液购自丹麦诺维信公司，商品名为Lipozyme TL 100L (pH5. O)，不经任何处理或调节pH至8. O后(O. 05mol/L lmol/L的NaOH)用于本发明的实施例中。实施例I.采用大孔吸附树脂制备固定化酶将大孔吸附树脂DlOl、HPDIOOA或X_5(D101和HPD100A购自河北沧州宝恩化工有限公司，X-5购自上海华震树脂有限公司)分别置于去离子水中浸泡约12h去杂，然后用95%乙醇浸泡过夜去除有机杂质和其它不溶物，用去离子水冲洗至无醇味，置于去离子水中备用。根据如下配方和步骤制备固定化酶1-19 I、称取处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放入冷冻干燥机内进行干燥，具体冻干参数设置为-20°C降温速率 I. 5°C /min，2h，_10°C降温速率 I. 5°C /min，6h5°C降温速率 L01°C/min，15h，·20°C降温速率 I. 16°C /min，20h干燥后得固定化酶I。2、称取处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放入真空干燥机内进行干燥(真空度为6mbar下，40°C干燥48h)，干燥后得固定化酶2。3、称取处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶3。4、称取处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH5的TL酶液和IOml蒸馏水，在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶4。5、称取处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶5。6、取出处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和0.8ml 1%的戊二醛溶液，在25°C摇床中150rpm振荡2h，树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶6。7、取出处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH5的TL酶液和IOml蒸馏水，和O. 8ml I %的戊二醛溶液，在25°C摇床中150rpm振荡2h，树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶7。8、取出处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶8。9取出处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH5的TL酶液和IOml蒸馏水，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶9。10、取出处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH8的TL酶液和IOml蒸馏水，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶10。
11、取出处理好的DlOl树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶11。12、取出处理好的HPD100A树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和O. 8ml I %的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放入通风良好的地方进行自然风干，干燥后得固定化酶12。13、取出处理好的HPD100A树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放入通风良好的地方进行自然风干，干燥后得固定化酶13。14、取出处理好的HPD100A树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和O. 8ml I %的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放入通风良好的地方进行自然风干，干燥后得固定化酶14。 15、取出处理好的HPD100A树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放入通风良好的地方进行自然风干，干燥后得固定化酶15。16、取出处理好的X-5树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和0.8ml 1%的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶16。17、取出处理好的X-5树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶17。18、取出处理好的X-5树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和0.8ml 1%的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶18。19、取出处理好的X-5树脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C摇床中150rpm振荡2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放在室内通风良好的地方进行干燥，干燥后得固定化酶19。以上处理在固定化过程结束后对上清液进行蛋白含量的测定，测定方法为考马斯亮蓝法，其剩余蛋白含量均在O. lmol/L以下(如表I所示)。酶固定化效率计算公式如下
权利要求
1.一种制备固定化脂肪酶的方法，所述方法包括步骤 a)对载体进行前处理，所述载体选自离子交换树脂或骨架为聚苯乙烯的大孔吸附树月旨; b)提供脂肪酶，并任选在其中加入酶蛋白交联剂； c)将步骤a)中所得的经前处理的载体与步骤b)中所提供的脂肪酶接触，使所述脂肪酶固定于所述经前处理的载体； d)干燥步骤c)中所得的固定有脂肪酶的载体，以获得所述固定化脂肪酶。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述载体选自极性大孔吸附树脂、非极性大孔吸附树脂、阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述非极性大孔吸附树脂选自D101、HPDIOOA, AmberliteXAD_4、HPD100, HPD300、HPD700、X-5、XAD-4 或 HP20 ； 所述极性大孔吸附树脂选自D201、LSA-10或Amberlite XAD7HP ； 所述阳离子交换树脂选自:D113、DOOl或Ambetlite IRC50 ； 所述阴离子交换树脂选自D301或Styrene-DVB201X2。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述大孔吸附树脂的前处理是如下进行的将载体置于水中浸泡去杂，然后用溶剂浸泡I 24h以去除有机杂质和不溶物，再用水洗去所述溶剂，其中所述溶剂为乙醇、正己烷、丙酮或石油醚； 所述离子交换树脂的前处理是如下进行的用O. 05mol/L lmol/L的碱液和酸液交替浸泡或冲洗所述树脂1-5次,然后仅用O. 05mol/L lmol/L的碱液再次浸泡或冲洗树脂I次，再用水洗至水呈中性。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤b)中所提供的脂肪酶选自嗜热丝孢菌(Thermomyces Lanuginosus)的发酵产物；通过基因工程或蛋白质工程改造而得的脂肪酶；或市售的脂肪酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶未经任何前处理而用于步骤c)中。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述酶蛋白交联剂选自戊二醛溶液、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺、明胶或精胺。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述经处理的载体与脂肪酶以g/ml计的重量/体积比为25 : I I : 25。
9.一种固定化脂肪酶或其包装产品，其特征在于，所述的固定化脂肪酶是通过权利要求1-8中任一项所述的方法制备的。
10.一种进行酯交换、酯化、酸解或醇解反应的方法，所述方法包括使用权利要求9所述的固定化脂肪酶作为催化剂。
全文摘要
本发明涉及TL固定化酶及其应用。具体而言，本发明中提供了一种制备固定化脂肪酶的方法，其包括步骤a)对载体进行前处理，所述载体选自离子交换树脂或骨架为聚苯乙烯的大孔吸附树脂；b)提供脂肪酶；c)将步骤a)中所得的经前处理的载体与步骤b)中所提供的脂肪酶接触，使所述脂肪酶固定于所述经前处理的载体；d)干燥步骤。本发明中还提供了用本发明方法制备的固定化脂肪酶及其应用。本发明的固定化酶具有高活性和稳定性，且在食品工业中催化酯交换反应过程中不产生皂，操作简单，大大降低了油脂加工的成本。
文档编号C12P7/64GK102839166SQ20111017070
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者郑妍, 辛本荣, 杨天奎, 徐学兵 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司