专利名称：不对称病毒纳米颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及在分子水平上用一种可控的方法操纵生物大分子的自组装，尤其涉及一种不对称病毒纳米颗粒(asymmetric VNPs)的制备方法，属于纳米生物技术领域。
背景技术：
纳米技术，是指在0. 1 100纳米的尺度里，研究电子、原子和分子运动规律和特性以及对物质和材料进行处理的技术被称为纳米技术。1981年科学家发明研究纳米的重要工具一扫描隧道显微镜，原子、分子世界从此可见。1990年首届国际纳米科技会议在美国巴尔的摩举办，纳米技术形式诞生。纳米颗粒因其独特的光、电、磁和力学等性质，又因其具有尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原子比例大等特点，在生物传感、材料科学、能源和信息技术等领域得到了广泛关注，是研究得最早和最为成熟的纳米材料，可用于发展具有特殊性质和功能的纳米器件。然而，由于表面化学各向同性，纳米颗粒作为构筑基元缺乏多样性和稳定性，因此在功能和应用上受到一定限制。故发展纳米材料和器件的关键问题之一转变成控制纳米构筑单元的组装。近年来发展了一系列针对纳米颗粒的不对称修饰方法，为组装纳米颗粒的可控性提供了一些新颖而有效的策略。这些方法可以将本身各向同性的纳米颗粒修饰成各向异性，使得常见的功能性纳米颗粒成为所需的构筑单元。近年来，基于各向异性的组装由于其优异的可控性而受到广泛关注。对于形貌不对称的纳米材料，以及有性质显著不同的晶面的纳米晶，它们很容易依靠本身的各向异性进行修饰与组装。很多计算模拟结果表明， 对纳米颗粒进行不对称修饰可以使其由各向同性变为各向异性，进而能够进行更复杂、可控和定向的组装。但正是因为纳米颗粒本身形貌和表面性质具有球对称性，一般的方法只能形成均勻的修饰层。最近几年，陆续报道了一系列有效的对纳米颗粒不对称修饰的方法，使得此瓶颈得以突破，同时也为可控组装提供了更好的策略和发展空间。蛋白质、DNA等生物大分子是天然的纳米材料，它们结构多样，可以自我复制，高度均质，易于人为操纵和大量制备。DNA在纳米技术发展中已表现出了独特优势；与DNA相比， 蛋白质携带的结构信息更加丰富，因而有望为纳米技术提供更灵活的操作平台。其中，蛋白笼形结构，像病毒衣壳，铁蛋白，热击蛋白，已经被广泛用于研究大分子自组装的模型，以及材料合成的纳米反应器。但是，在分子水平上用一种可控的方法操纵他们的自组装，以及准确分析他们的组装产物，仍然是具有挑战性的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其可在分子水平上实现生物大分子的可控自组装，从而克服现有技术中的不足。为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案 一种不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法为对病毒衣壳蛋白表面进行基因改造，使病毒衣壳蛋白同时带有耦合的功能基团和分离基团，然后将该改造后的病毒衣壳蛋白与野生型病毒衣壳蛋白充分混合，并控制该两种病毒衣壳蛋白的比例，同时根据病毒衣壳蛋白的总量加入相应无机纳米颗粒，实现病毒样纳米颗粒的可控组装，获得不对称功能化的纳米颗粒，即目标产物。进一步的讲，所述病毒衣壳蛋白包括SV40衣壳蛋白VP1，所述功能基团包括半胱氨酸，所述分离基团包括His-tag。该方法包括如下步骤
i .在SV40衣壳蛋白的VPl Loop中引入Cys，即，在第74位氨基酸突变为Cys，并在第139位插入His-tag，构建载体His-mvpl，并在生物体中实现表达，经纯化，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl ；
.取改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl与原野生型SV40衣壳蛋白wtvpl充分混合， 通过调节该两种衣壳蛋白的比例，实现对组装体病毒纳米颗粒个体中该两种衣壳蛋白成分比例的控制，根据衣壳蛋白总量与纳米颗粒物质的量比60:广180:1添加无机纳米颗粒，在低盐溶液中透析完成共组装；
iii.用金属螯合亲和层析法分离纯化组装产物，除去同种病毒衣壳蛋白自组装的产物，获得单一的不对称病毒纳米颗粒。该方法还包括如下步骤
iv .用蔗糖连续密度梯度法对步骤iii获得的不对称病毒纳米颗粒进行分离，获得大小均一的不对称结构。步骤i具体为
将His-mvpl表达质粒用氯化钙法转入五coli Rosetta (DE3)感受态细胞，在LB培养基中培养细菌并诱导表达重组蛋白His-mvpl，其后依次经离心、破碎和柱层析处理，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl ；
所述LB培养基中还含有抗生素和诱导剂，所述抗生素包括氨苄青霉素和/或氯霉素， 所述诱导剂包括IPTG。步骤i包括如下步骤
a、将His-mvpl表达质粒用氯化钙法转入五coliRosetta (DE3)感受态细胞，涂平板至少12 h后，挑取单克隆接入LB培养基中，加入抗生素，于37°C恒温振荡培养过夜，其后按照1%接种量转接于LB培养基中，加入抗生素，于37°C恒温振荡培养，并加入诱导剂，在 25°C 37°C继续诱导培养，离心收集菌体；
b、将收集到的菌体清洗后重悬于bindingbuffer中进行超声破碎，离心破碎后的菌液，取上清液进行柱层析，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl。步骤ii具体为将摩尔比l:5(Tl :11的His-mvpl与wtvpl充分混合，并添加无机纳米颗粒，无机纳米颗粒与总蛋白分子数的比例控制为60 广180:1，在低盐溶液中透析完成共组装。步骤iii中所获得的不对称病毒纳米颗粒具有正二十面体结构，其外壳是由1个 His-mVPl五聚体和11个wtvpl五聚体组成，中心是无机纳米颗粒。步骤iii具体为
采用镍亲和层析法，首先以15-30 mM咪唑溶液除去不带有改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl的组装产物，即无功能基团和分离基团的病毒纳米颗粒；然后取20(T1000 mM咪唑溶液洗脱得到组装产物中只含有一个改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl单元的病毒纳米颗粒，即不对称病毒纳米颗粒。病毒纳米颗粒(virus-based nanoparticles，VNPs)是由一种或几种病毒衣壳蛋白构成的空心颗粒，通常自组装产生，不含病毒核酸，不能自主复制。本发明通过病毒结构的对称性或病毒表面基因改造，实现病毒样纳米颗粒的可控组装，获得一种不对称功能化的纳米颗粒，从而有可能获得新的物理或化学特性，为病毒标记和示踪等提供新的结构材料。该策略的成功将为制备具有可控组装性能的纳米构筑基元提供一条有效的技术途径， 从而催生新颖的纳米器件，为基本物理学问题研究和下游应用奠定良好的基础。较之于现有技术，本发明具有的优点在于选用生物大分子-蛋白质作为纳米材料，其容易改造和人为操纵，且方便大量获取。通过遗传工程手段在病毒纳米颗粒组装模块中同时整合功能基团和分离基团。利用可自组装的病毒衣壳蛋白结构的对称性，可以将两种不同的蛋白分子混合后按预先设计进行定向组装，因此组装体具有多样性和可控性； 反应条件易控制，并且可以实现大规模生产。
图1是本发明利用SV40主要衣壳蛋白vpl包装量子点共组装制得的一种不对称病毒纳米颗粒的透射电子显微镜照片；
图2是图1所示asymmetric VNPs吸附AuNPs的透射电子显微镜图； 图3是本发明阴性对照(wtvpl包装量子点形成的VNPs)吸附AuNPs的透射电子显微镜图4是本发明阳性对照(His-mvpl包装量子点形成的VNPs)吸附AuNPs的透射电子显微镜图。
具体实施例方式本发明提供的一种不对称病毒纳米颗粒(asymmetric VNPs)的制备方法，利用生物大分子——病毒衣壳蛋白(SV40，CCMV, TMV等病毒的衣壳蛋白)与新型纳米材料共组装的模型，通过对病毒衣壳蛋白表面的基因改造，将功能基团和分离基团在结构上巧妙地耦合，然后将改造过的衣壳蛋白与野生型的蛋白按特定比例充分混合后再组装，用控制两种蛋白五聚体比例的方法实现病毒样纳米颗粒的可控组装，获得一种不对称功能化的纳米颗粒。又根据不对称颗粒上带有的分离基团，进一步实现目标产物的分离和纯化。最后将分离得到不对称功能化的纳米颗粒，并优选采用AuNPs对其功能基团进行表征。本发明制备的产物为不对称病毒纳米颗粒(asymmetric VNPs)。分具体步骤来看
1.将病毒衣壳蛋白进行基因改造，构建带有功能基团和分离基团的衣壳蛋白突变体的载体；
2.将构建好的载体转化到生物体内进行表达，纯化并鉴定得到病毒衣壳蛋白突变
体；
3.将此突变体与野生型的衣壳蛋白充分混合，然后在无机纳米粒子参与下经透析组装；
4.根据分离基团的特征选择不同分离方法纯化组装产物；
5.将得到的不对称功能化的纳米颗粒做连续密度梯度离心，制备出大小均一的不对称病毒纳米颗粒(asymmetric VNPs)；
为使本发明的不对称病毒纳米颗粒(asymmetric VNPs)的制备方法更易于理解其实质性特点及其所具的实用性，下面便结合实施例1以及图1-图4对本发明技术方案作进一步的详细说明，但以下关于实施例的描述及说明对本发明保护范围不构成任何限制。实施例1
在SV40主要衣壳蛋白vpl的Loop结构中引入Cys (即第74位氨基酸突变为Cys)，在第139位插入His-tag，构建成载体PET3^i-His-mvpl (His-mvpl)；经测序确定目的基因序列的正确性。将PET3^i-His-mvpl用氯化钙法转入五coh· Rosetta (DE3)感受态细胞，涂平板12 h后从平板上挑取单克隆接入5 mL LB试管培养基中，加入氨苄青霉素和氯霉素， 于37°C恒温，180 r/min培养过夜。按照1%接种量转接于5 ml LB试管培养基中(平行3 管)，加入相应的抗生素，于37°C恒温、180 r/min振荡培养2. 5 h左右(0D600在0. 4、. 6之间)，其中1管作为空白对照(不加IPTG)，另外两管均加入诱导剂终浓度为1 mM的IPTG，分别在25°C和37°C继续诱导培养10 h和2 h后，离心收集菌体，用SDS-PAGE检测His-mvpl 的表达情况，发现两种温度下均能表达，同时也有包涵体产生，选择25°C作为大量制备蛋白时的诱导温度。将万.co/iRosetta (DE3) / PET32a-His_mvpl 接种于 5 mL LB 试管培养基中，加入相应的抗生素在37°C恒温、180 r/min培养过夜。第二天将5 mL菌液转接入500 mL LB 三角瓶中，加入氨苄青霉素(终浓度100 ug/mL)和氯霉素(终浓度68 ug/mL)，于37°C恒温、 180 r/min振荡培养2. 5 h左右后(0D600在0.圹0. 6之间)，加入诱导剂终浓度为1 mM的 IPTG，在25°C下继续振荡诱导培养10 h，离心收集菌体。将菌体沉淀用binding buffer清洗一次后重悬于一定体积的binding buffer中进行超声破碎(条件超声功率400W，工作 3 s，间歇5 s，总超声破碎时间60 min)，破碎后的菌液以12000 r/min离心30 min，将上清液上样于经binding buffer平衡过的Ni2+-NTA亲和层析柱，然后依次用低浓度(20 mM、40 mM、60 mM)的咪唑洗柱除去杂蛋白，最后用elution buffer (500 mM咪唑)洗脱目的蛋白。His-mvpl及wtvpl五聚体的制备
纯化后的His-mvpl主要以五聚体形式存在，也有一部分以病毒纳米颗粒形式存在，故需要除去His-mvpl中的病毒纳米颗粒，制备获得纯的His-mvpl五聚体，这个过程需要两个步骤
1.在制备获得的His-mvpl五聚体中加入终浓度为10mM的DTT，然后在解聚缓冲液中透析(体积为10 mL His-mvpl蛋白在4°C 1 L解聚缓冲液中静置透析10 h，更换一次新鲜解聚缓冲液，继续静置透析10 h)；
2.将透析过的His-mvpl蛋白超速离心除去残存的病毒纳米颗粒，超速离心条件是 4°C, 55000 rpm (贝克曼Type 90Ti转子)离心1 h，取上清即为His-mvpl五聚体。His-mvpl五聚体的浓度通过试剂盒Bradford Protein Assay (考马斯亮蓝染色法)测定，步骤按照试剂盒说明书进行。同时结合SDS-PAGE验证。原野生型SV40衣壳蛋白wtvpl五聚体的制备步骤与His-mvpl五聚体的制备方法相同。His-mvpl与wtvpl混合并在量子点参与、低盐条件下共组装。具体步骤是
1.将浓度为680 ug/mL 的 wtvpl 17mg(25 mL)与浓度为 330 ug/mL 的His-mvpl 1.551 mg (4. 7 mL)五聚体混合，4°C慢速振荡5 h ；
2.稀释总蛋白液至终浓度为200ug/mL，加入浓度为3. 24 uM的量子点CdSe 1.67 mL, 此时总体积是90. 77 mL，混勻后，在组装缓冲液中透析共组装(透析20 h，10 h更新一次新的透析液)；
3.得到的包装产物含有SV40病毒纳米颗粒-量子点(纯wt-vpl五聚体组装成的 VNPs，两种五聚体混合组装的VNPsji His-mvpl组装成的VNPs等)，量子点，衣壳蛋白五聚体，空的病毒纳米颗粒和不规则聚集物的混合物。要分离出不对称病毒纳米颗粒，需要如下具体步骤
i ·加入5Xbinding buffer 22.5 mL，此时总体积为113. 27 mL，将组装液上样于经binding buffer平衡过的Ni2+___NTA亲和层析柱，只有带有突变体衣壳蛋白的病毒纳米颗粒能吸附到层析柱上，用15 30 mM咪唑除去非特异吸附在柱上的病毒纳米颗粒，然后用 200^1000 mM的咪唑洗脱得到不对称病毒纳米颗粒。该过程的原理是his- tag层析凝胶的基质上连接了一个NTA ([=Iiitrilotriacetic acid]氮基三乙酸)，可以与Ni离子结合， 而Ni离子与融合蛋白的6)(hiS氨基酸之间产生较强的螯合作用，从而将带有his-tag组氨酸标签的蛋白与其它蛋白区分开来。因此当用高浓度的咪唑溶液洗脱的时侯(如300 mM), 咪唑便与蛋白质his-tag的咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白从凝胶上洗脱下来。ii .浓缩20(Tl000 mM咪唑洗脱得到的VNPs，通过蔗糖密度梯度离心将大小均一的病毒纳米颗粒分离出来。蔗糖密度梯度的制备步骤
a)先配制包装缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH 7.2，250 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5% Glycerol)和50wt%蔗糖溶液(用包装缓冲液配制)，然后以这两者为母液配成质量/质量比为 10%、15%、20%、25%、30%、；35%、40%、45% 的蔗糖溶液。b)将透明的超速离心管最上方预留好样品体积后，剩下的长度分成等体积的9 份，用记号笔划线标记；
c )将超速离心管固定在合适的离心管架上，用吸管按从高浓度到低浓度的顺序将各梯度的蔗糖溶液贴壁缓慢加入到离心管内，吸管口要与蔗糖液面恰好接触以避免扰动； d)梯度制备好后，静置于4°C冰箱过夜，使之形成连续梯度。0超速离心将浓缩得到的产物缓慢加入到超速离心管上方预留的位置中，每管最多2 mL，在超速离心机中4°C 38000 rpm离心(贝克曼SW40Ti转子)4. 5小时，然后在紫外灯照射辅助下，照相拍下超速离心后样品在连续梯度中的位置和情况，可以看到不对称病毒纳米颗粒在离心管中形成了独立的荧光带，将其取出。0样品脱糖将荧光带部分中的蔗糖用无甘油的PBS透析，稀释至10000倍以上。 用截留分子量为100KD的超滤管对样品进行浓缩。SDS-PAGE定量并用透射电镜表征(见图 1)。4. SV40不对称病毒纳米颗粒的表征AuNPs可以高效结合到His-mvpl展示的Cys上。用AuNPs吸附实验对样品进行表征 (图2)，同时制备阴性对照(图3)和阳性对照(图4)。在AuNPs与病毒纳米颗粒2:1的情况下，不对称病毒纳米颗粒基本只吸附一个金颗粒，wtvpl形成的VNPs不能吸附金颗粒，而12 个五聚体均展示半胱氨酸的VWs则可以吸附1-3数目不等的金颗粒。该结果说明，不对称病毒纳米颗粒中只包含一个展示cys的五聚体(即His-mvpl)，其余11个为wtvpl五聚体。
以上仅是本发明众多具体应用范例中的一个实施例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或是等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
权利要求
1.一种不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法为对病毒衣壳蛋白表面进行基因改造，使病毒衣壳蛋白同时带有耦合的功能基团和分离基团，然后将该改造后的病毒衣壳蛋白与野生型病毒衣壳蛋白充分混合，并控制该两种病毒衣壳蛋白的比例，同时根据病毒衣壳蛋白的总量加入相应无机纳米颗粒，实现病毒纳米颗粒的可控组装，获得不对称功能化的纳米颗粒，即目标产物。
2.根据权利要求1所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白包括SV40衣壳蛋白VP1，所述功能基团包括半胱氨酸，所述分离基团包括His-tag。
3.根据权利要求1所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤i .在SV40衣壳蛋白的VPl Loop中引入Cys，即，在第74位氨基酸突变为Cys，并在第139位插入His-tag，构建载体His-mvpl，并在生物体中实现表达，经纯化，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl ； .取改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl与原野生型SV40衣壳蛋白wtvpl充分混合，通过调节该两种衣壳蛋白的比例，实现对组装体病毒纳米颗粒个体中该两种衣壳蛋白成分比例的控制，根据衣壳蛋白总量与无机纳米颗粒物质的量比60:广180:1添加无机纳米颗粒， 在低盐溶液中透析完成共组装；iii.用金属螯合亲和层析法分离纯化组装产物，除去同种病毒衣壳蛋白自组装的产物，获得单一的不对称病毒纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法还包括如下步骤iv .用蔗糖连续密度梯度法对步骤iii获得的不对称病毒纳米颗粒进行分离，获得大小均一的不对称结构。
5.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤i具体为将His-mvpl表达质粒用氯化钙法转入五coli Rosetta (DE3)感受态细胞，在LB培养基中培养细菌并诱导表达重组蛋白His-mvpl，其后依次经离心、破碎和柱层析处理，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl ；所述LB培养基中还含有抗生素和诱导剂，所述抗生素包括氨苄青霉素和/或氯霉素， 所述诱导剂包括IPTG。
6.根据权利要求5所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤i包括如下步骤a、将His-mvpl表达质粒用氯化钙法转入五co/iRosetta (DE3)感受态细胞，涂平板至少12 h后，挑取单克隆接入LB培养基中，加入抗生素，于37°C恒温振荡培养过夜，其后按照1%接种量转接于LB培养基中，加入抗生素，于37°C恒温振荡培养，并加入诱导剂，在 25°C 37°C继续诱导培养，离心收集菌体；b、将收集到的菌体清洗后重悬于bindingbuffer中进行超声破碎，离心破碎后的菌液，取上清液进行柱层析，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl。
7.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤ii具体为将摩尔比l:5(Tl :11的His-mvpl与wtvpl充分混合，并添加无机纳米颗粒，无机纳米颗粒与衣壳蛋白总分子数的比例控制为60 广180:1，在低盐溶液中透析完成共组装。
8.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤iii中所获得的不对称病毒纳米颗粒具有正二十面体结构，其外壳是由1个His-mVPl五聚体和11 个wtvpl五聚体组成，中心是无机纳米颗粒。
9.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤iii具体为采用镍亲和层析法，首先以15-30 mM咪唑溶液除去不带有改造后的病毒衣壳蛋白 His-mvpl的组装产物，即无功能基团和分离基团的病毒纳米颗粒；然后取20(T1000 mM咪唑溶液洗脱得到组装产物中只含有一个改造后的病毒衣壳蛋白His-mvpl单元的病毒纳米颗粒，即不对称病毒纳米颗粒。
全文摘要
本发明公开了一种不对称病毒纳米颗粒的制备方法。该方法为对病毒衣壳蛋白表面进行基因改造，使病毒衣壳蛋白同时带有耦合的功能基团和分离基团，然后将该改造后的病毒衣壳蛋白与野生型病毒衣壳蛋白充分混合，并控制该两种病毒衣壳蛋白的比例，同时根据病毒衣壳蛋白总量加入相应无机纳米粒子，实现病毒纳米颗粒的可控组装，获得不对称功能化的纳米颗粒，即目标产物。本发明选用生物大分子-蛋白质作为纳米材料，其容易改造和人为操纵，且方便大量获取。利用可自组装的病毒衣壳蛋白结构的对称性，可以将两种不同的蛋白分子混合后按预先设计进行定向组装，因此组装体具有多样性和可控性；反应条件易控制，并且可以实现大规模生产。
文档编号C12N7/04GK102321590SQ20111021496
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者李峰, 王强斌, 陈艳华 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所