专利名称：嗜吡啶红球菌及其催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产腈水解酶的微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，以及筛选获得的具有腈水解酶活性的菌株。
背景技术：
亚氨基二乙酸(IDA)是一种比较重要的化工原料，具有很强的络合能力能和多种金属离子络合而形成螯合物，和铜离子可以形成蓝色的鳌合物，常用作络合剂和表面活性剂，常用于有机合成，也是草甘膦(Glyphosate)生产的重要中间体。由于其分子中含有亚氨基和羧基，化学性质很活泼，广泛应用于电镀、染料、医药、电子等领域。是一种重要的化工中间体。目前制备亚氨基二乙酸一般采用化学方法，根据原料的不同主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法、氨代氯乙酸法、氢氰酸法、一乙醇胺法、二乙醇胺法等。传统的化学方法存在产生成本高、污染严重、对设备要求高，或者使用剧毒的氢氰酸等弱点。利用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸与化学水解法相比，其优势在于(1)反应条件温和。化学水解法需要在10(TC左右进行，必须配备加热和温控装置，反应条件苛刻，能耗高而且对设备要求高。而生物催化法一般都是在常温下进行，反应条件温和，设备成本相对较低。( 原料消耗大幅度减少，基本不产生可溶性盐。利用腈水解酶一步水解生成亚氨基二乙酸，省去了碱解和酸化工艺，避免了 NaOH和浓盐酸的大量使用。生物法中利用NH4OH调节转化体系的pH 值，在产物回收中采用再生技术，可以有效减少可溶性盐的排放。( 废水排放少。按照目前的化学水解工艺，生产每吨亚氨基二乙酸将至少产生废水8吨。采用生物法后，以腈水解酶酶活力10万单位计算(回用5次)，生产每吨亚氨基二乙酸的废水量可控制在2吨以下， 且废水中不存在盐类等难处理杂质，可生化性强。利用腈转化酶生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸，可以克服化学法生产亚氨基二乙酸的缺陷。生物催化是迄今为止人类所知道的最高效、最具选择性的催化体系，可以提供许多传统化学方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。而且，生物转化反应条件温和、反应产物纯度高、容易分离和纯化，在农药中间体的生产中，显示出巨大的发展潜力。
发明内容
本发明目的是微生物产酶培养得到腈水解酶催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸的制备方法。本发明所另一目的是提供筛选得到的产腈水解酶的微生物。本发明采用的技术方案是嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)ZJB09126，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No =M 209048，保藏日期 2009年3月18日。上述菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得。
本发明还涉及利用前述菌株微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法， 所述的方法是利用产腈水解酶的菌株，经产酶培养得到腈水解酶，以该酶为生物催化剂催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸。生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的过程如下
NH(CH2CN)2 月青細_ > NH(CH2COOH)2(IDA)本发明所述的制备亚氨基二乙酸的方法具体如下(A)将所述嗜吡啶红球菌CCTCC No =M 209048接种至产酶培养基，加入诱导剂a于 100 200r/min、20 35°C条件下进行发酵培养2 5d ；所述诱导剂a为正丁腈、异丁腈或己内酰胺；所述产酶培养基终浓度组成为甘油8g/L，酵母膏6g/L，NaCl lg/L, K2HP045g/ L，MgSO4O. 2g/L，溶剂为水，pH值7. 0 ；所述诱导剂a的终浓度为5g/L ；(B)取亚氨基二乙腈配制成质量浓度0. 5% 6%的水溶液，调初始pH为7. 0 7. 5，作为酶催化反应底物溶液；以步骤(A)发酵获得的湿菌体、细胞破碎获得的粗酶液或经固定化得到的固定化细胞作为酶源，酶源加入量以湿菌体计为0. 1 IOg湿菌体/IOmL 底物溶液；控制反应温度为30°C、反应pH为6. 0 9. 0，进行转化反应8 16h，反应结束后，反应液经分离纯化得到亚氨基二乙酸。上述步骤(A)所述的发酵培养优选在30°C条件下进行发酵培养3d ；步骤(B)所述的控制反应温度优选为30°C，进行转化反应10h。本发明所述的产腈水解酶的微生物由如下方法筛选获得，所述方法包括初筛和复筛(1)初筛将待筛选菌株接种至初筛培养基，25 37°C培养1 4d，挑取菌落中产生黄色变色圈的菌株，接种到LB斜面培养基，25 30°C培养2 5d后取菌株进行复筛； 所述初筛培养基终浓度组成如下亚胺基二乙腈5g/L，酵母膏6g/L，NaCllg/L，K2HP04lg/L， MgS04lg/L，溴钾酚紫lg/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 7. 0 ；即所述初筛培养基每IL按如下组成配制亚胺基二乙腈5g，酵母膏6g，NaCllg, K2HPO4Ig, MgSO4Ig,溴钾酚紫0. lg，琼脂粉20g，溶剂为水，pH7.0 ；优选步骤⑴初筛所述的培养温度洲 30°C，培养3 4d。(2)复筛将初筛获得的菌株接种至复筛培养基，100 200r/min、25 35°C下培养2 7d，收集菌体测定亚氨基二乙酸的生成量，收集生成亚氨基二乙酸含量大于10%的微生物；所述复筛培养基终浓度组成如下甘油8g/L、酵母膏6g/L、NaCllg/L, K2HP045g/L、 MgSO4O. 2g/L，正丁腈5g，溶剂为水，pH7. 0，即所述复筛培养基每IL按如下组成配制甘油 8g、酵母膏 6g、NaCllg、K2HP045g、MgSO4O. 2g，诱导剂 b5g，溶剂为水，ρΗ7· 0。优选步骤O)复筛所述的培养温度为30 32°C。本发明所述的诱导剂a与诱导剂b所表示的都是微生物培养过程中的诱导剂，这里a和b只是用以区分诱导剂出现在不同步骤。本发明的有益效果主要体现在提供了一种利用产腈水解酶的菌株经产酶培养， 得到腈水解酶，以该酶为生物催化剂催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸的方法，可高效生产亚氨基二乙酸，本发明还提供了可产腈水解酶的微生物的筛选方法，并获得了多种产腈水解酶的菌株，为采用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸提供了基础，具有重要应用前景。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 产腈水解酶菌种的初筛初筛培养基每IL按如下组成配制酵母膏6g，NaCl lg，K2HPO4Ig, MgSO4Ig,琼脂粉 20g，pH7.0水补足至lOOOmL，灭菌后冷却到50°C加入5g亚氨基二乙腈和Ig溴甲酚紫，混勻到平板。收集细菌进行筛选，涂布于平板上，在温度观 30°C，培养3 4d，挑取菌落中产生黄色变色圈的菌株，接种到LB斜面培养(25 )；黄色变色圈的微生物菌株有边缘假单胞菌ZJB09121 O^seudomonas marginal is ZJB09121)、恶臭假单胞菌 ZJB09134 (Pseudomonas putia ZJB09134)、恶臭假单胞菌 ZJB09129 (Pseudomonas putia ZJB09129) > ^fiIfi^ ZJB09135 (Pseudomonas putia ZJB09135)、荧光假单胞菌 ZJB09137 (Pseudomonas f luorescens ZJB09137)、产酸克雷伯氏菌 ZJB09123 (Kelbsiella ocytoca ZJB09123)、弗氏红球菌 ZJB09124(Rhodococcus wratislaviensis ZJB09124)、嗜吡啶红球菌 ZJB09126(Rhodococcus pyridinivorans ZJB09126)(即 CCTCC No :M 209048)、紫红红球菌 ZJB09125 (Rhodococcus rhodochrous ZJB09125)、赤红球菌 ZJB09127(Rhodococcus rubber ZJB09127)、藤黄微球菌 ZJB09131(Micrococcus luteus ZJB09131)、耐盐短杆菌 ZJB09132(Brevibacterium halotoerans ZJB09132)、敏捷食酸菌 ZJB09122(Acidovorax facilis ZJB09122)、 粪产碱杆菌 ZJB09138 (Alcaligenes faecalis ZJB09138)、节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99。实施例2 产腈水解酶菌种的复筛将实施例1中有筛选到的可产生变色反应且黄色变色圈大的菌株，接种到复筛培养基中，30 32°C，100 200r/min，500mL三角瓶装液量150mL，发酵培养3d，发酵液离心得到粗酶液或湿菌体。各取Ig湿菌体，置于500ml三角瓶中，加入50ml 2% (w/w)的反应底物亚氨基二乙腈水溶液，30°C摇床150r/min条件下反应60min，离心去除菌体，测定亚氨基二乙酸的生成量，计算转化率，结果见表1。复筛培养基每IL按如下组成配制甘油8g，酵母膏6g，NaCllg, K2HP045g, MgSO4O. 2g，正丁腈5g，pH值7. 0，水补足至IOOOmL ；诱导剂正丁腈也可以异丁腈或己内酰胺代替。表1 产腈水解酶菌种的复筛结果
权利要求
1.嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)ZJB09126，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No =M 209048，保藏日期 2009年3月18日。
2.一种利用权利要求1所述嗜吡啶红球菌CCTCC No =M 209048催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，所述方法如下(A)将所述嗜吡啶红球菌CCTCCNo =M 209048接种至产酶培养基，加入诱导剂a于 100 200r/min、20 35°C条件下进行发酵培养2 5d ；所述诱导剂a为正丁腈、异丁腈或己内酰胺；所述产酶培养基终浓度组成为甘油8g/L，酵母膏6g/L，NaCl lg/L,K2HP045g/ L，MgSO4O. 2g/L，溶剂为水，pH值7. 0 ；所述诱导剂a的终浓度为5g/L ；(B)取亚氨基二乙腈配制成质量浓度0.5% 6%的水溶液，调初始pH为7. 0 7. 5， 作为酶催化反应底物溶液；以步骤(A)发酵获得的湿菌体、细胞破碎获得的粗酶液或经固定化得到的固定化细胞作为酶源，酶源加入量以湿菌体计为0. 1 IOg湿菌体/IOmL底物溶液；控制反应温度为30°C、反应pH为6. 0 9. 0，进行转化反应8 16h，反应结束后，反应液经分离纯化得到亚氨基二乙酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(B)取亚氨基二乙腈配制成质量浓度0. 5% 6%的水溶液，以氨水、NaOH或HCl水溶液调pH为7. 0 7. 5。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(A)所述的发酵培养在30°C条件下进行发酵培养3d。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(B)所述的控制反应温度为 30°C，进行转化反应IOh。
全文摘要
本发明提供了微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法及菌株，所述的方法是利用产腈水解酶的菌株，经产酶培养得到腈水解酶，以腈水解酶做为生物催化剂生物催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸。该发明为采用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸提供了基础，具有重要应用前景。
文档编号C12N1/20GK102277321SQ201110223868
公开日2011年12月14日 申请日期2009年7月16日 优先权日2009年7月16日
发明者张涛, 徐建妙, 柳志强, 沈寅初, 薛亚平, 郑仁朝, 郑裕国 申请人:浙江工业大学