专利名称：一种麦芽极限糊精酶的纯化方法
技术领域：
本发明涉及食品生物技术领域中麦芽极限糊精酶的精制，具体涉及一种麦芽极限糊精酶的纯化方法。
背景技术：
极限糊精酶(支链淀粉6-葡萄糖水解酶)，又称α -糊精6-葡聚糖水解酶或普鲁兰酶(普鲁兰6-葡聚糖水解酶)，属于淀粉水解酶。它能够专一地催化普鲁兰、支链淀粉、 α-极限糊精、极限糊精等分支点中的α-1，6糖甙键。其主要作用在于水解α-淀粉酶和β-淀粉酶所不能水解的α-1，6糖甙键，从而加快淀粉降解速度，改变终产物组成，提高淀粉的水解率。极限糊精酶作为独特降解α -1，6糖甙键的酶类，通过改良淀粉等产品，在食品、 医药、日化、纺织等行业中起着重要的作用，具有很大的商业用途。目前，市场上的极限糊精酶产品多来自于微生物酶制剂，大大限制了其在食品领域的应用。而无毒的植物来源酶则可用于食品工业领域，具有广阔的应用前景。长期以来，因麦芽中极限糊精酶活性较低且热稳定性较差，一直未受到重视。随着技术的改进，对极限糊精酶的认识越来越深入，在工业生产中的重要作用日益突显，对酶纯度的要求越来越高，市场上迫切需要高纯度的安全的极限糊精酶产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种麦芽极限糊精酶的纯化方法。该方法可得到具有优良性质、高纯度的产品，该基料可广泛应用于一般食品、化工用品、医药领域中，具有巨大的经济效益和社会效益。本发明的目的通过如下技术方案实现。一种麦芽极限糊精酶的纯化方法，包括如下步骤和工艺条件
第一步硫酸铵分步沉淀在麦芽极限糊精酶粗提液I中添加饱和度为25 35%的硫酸铵进行一次盐析后，在由离心机离心取得的上清液中补加硫酸铵至饱和度为75、5%进行二次盐析，得到麦芽极限糊精酶粗提液II ；
第二步阴离子交换层析阴离子交换树脂床体积为9(Tl00mL，用ρΗ值7.0的 15^20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，然后将5. (Γ5. 5g的麦芽极限糊精酶粗提液II溶解于 2(T25mL蒸馏水中，上样，以含有(Tlmol/L NaCl的缓冲液梯度洗脱，流速为2 4mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液I ； 第三步凝胶过滤层析凝胶过滤色谱柱床体积约为5(T60mL，用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，将第三步收集的含有极限糊精酶部分的溶液I 0. 12(T0. 125g溶于r5mL 蒸馏水中，上样，控制流速为广2mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液II ；
第四步将第四步所得的含有极限糊精酶部分的溶液II冷冻干燥，即得到纯化的极限糊精酶。本发明是利用具有阴离子交换作用的DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱和具有分子筛作用的葡聚糖凝胶柱色谱两种柱复合纯化。所述二次盐析时间为5h 24h。所述的麦芽极限糊精酶粗提液II经过阴离子交换层析柱分离后，根据洗脱曲线， 仅收集产生蛋白吸收峰且含有极限糊精酶的洗脱组分进入下一步纯化。本发明的原理
本发明利用DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱和葡聚糖凝胶柱色谱柱复合纯化，效果显著，得到的产品纯度高。其中DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱阴离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，洗脱液为流动相的层析系统。阴离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用，这些过程都是可逆的。离子交换层析依据离子交换剂对各种离子化合物的不同结合力而将各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开。特别是该介质为天然多糖化合物，具有极好的亲水性及大网架结构，与生物活性大分子有很好的相容性，具有高离子交换容量、 无非特异性吸附、快流速操作等特点，广泛用于蛋白质、核酸、多肽及多糖等的生物大分子实验室规模制备和生物制药、生物工程的大工业化制备。凝胶过滤层析又称为排阻层析或分子筛层析，其是利用带孔凝胶珠作基质，按分子大小进行分离的技术。小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当分离组分通过凝胶过滤层析柱时，组分中物质就按不同分子量筛分开了。本发明具有如下优点和有益效果
(1)本发明采用DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱和葡聚糖凝胶柱色谱柱联合法将极限糊精酶产品快速纯化，提出了采用一种制备极限糊精酶精制产品的有效方法，在食品工业领域具有广泛的应用前景；
(2)利用阴离子交换层析和凝胶色谱作为主要手段，避免了加入其他化学试剂，而且柱填料可再生，此方法重现性好；
(3)采用本发明纯化的麦芽极限糊精酶的分子量、纯化倍数较之普通麦芽极限糊精酶都高。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。实施例1
第一步极限糊精酶的提取向麦芽粉中添加含有20mmol/L L-半胱氨酸盐酸盐的pH 值为5. 5的0. lmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使得料液比为1 5g/mL,置于转速为IOOr/ min的水浴恒温振荡器中，在温度35°C条件下，提取20h后，在转速为4000r/min的离心机内离心iaiiin后，分离得到麦芽极限糊精酶粗提液I。第二步硫酸铵分步沉淀在麦芽极限糊精酶粗提液I中添加饱和度为30%的硫酸铵进行一次盐析，在由离心机离心得到的上清液中补加硫酸铵至饱和度为75%，二次盐析证后，离心得到麦芽极限糊精粗酶液II ；第三步离子交换层析阴离子交换树脂床体积为IOOmL,用pH值7. O的15mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，然后将5. 3g的麦芽极限糊精粗酶液II溶解于25mL蒸馏水中，上样， 以上述缓冲液和含有0. 6mol/L NaCl的缓冲液梯度洗脱，流速为4mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液I ；
第四步凝胶过滤层析凝胶过滤色谱柱床体积约为50mL，用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，将第三步分离得到的含有极限糊精酶部分的溶液I 0. 123g溶于5mL蒸馏水中，上样，控制流速为2mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液II ；
第五步将第四步所得的含有极限糊精酶部分的溶液II冷冻干燥，即得到极限糊精酶产品0. (^8g，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示单一条带，分子量约97Kda，纯化倍数为 29. 15。实施例2:
第一步极限糊精酶的提取向麦芽粉中添加含有22mmol/L L-半胱氨酸盐酸盐的pH 值为5. 4的0. lmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使得料液比为1 5. 37 g/mL,置于转速为 100r/min的水浴恒温振荡器中，在温度37. 5°C条件下，提取17. 5h后，在转速为3000r/min 的离心机内离心15min，分离得到麦芽极限糊精酶粗提液I。第二步硫酸铵分步沉淀在麦芽极限糊精酶粗提液I中添加饱和度为35%的硫酸铵进行一次盐析，在由离心机离心得到的上清液中补加硫酸铵至饱和度为80%，二次盐析 10h，离心得到麦芽极限糊精酶粗酶液II ；
第三步离子交换层析阴离子交换树脂床体积为90mL，用pH值7. 0的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，然后将5. 5g的芽极限糊精酶粗酶液II溶解于25mL蒸馏水中，上样， 以上述缓冲液和含有1. 0mol/L NaCl的缓冲液梯度洗脱，流速为2mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液I ；
第四步凝胶过滤层析凝胶过滤色谱柱床体积约为60mL，用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，将第三步分离得到的收集含有极限糊精酶部分的溶液I 0. 125g溶于4mL蒸馏水中，上样，控制流速为2mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定， 收集含有极限糊精酶部分的溶液II ；
第五步将第四步所得的含有极限糊精酶部分的溶液II冷冻干燥，即得到极限糊精酶产品0. 031g，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示单一条带，分子量约97Kda，纯化倍数为 29. 01。实施例3:
第一步硫酸铵分步沉淀在购买的麦芽极限糊精酶粗提液I中添加饱和度为35%的硫酸铵进行一次盐析，在由离心机离心得到的上清液中补加硫酸铵至饱和度为85%，二次盐析1 后，得到麦芽极限糊精酶粗提液II ；
第二步离子交换层析阴离子交换树脂床体积为lOOmL，用pH值7. 0的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，然后将5. Og麦芽极限糊精酶粗提液II溶解于20mL蒸馏水中，上样， 以上述缓冲液和含有0 mol/L NaCl的缓冲液(即清水)梯度洗脱，流速为3mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液I ；
第三步凝胶过滤层析凝胶过滤色谱柱床体积约为55mL，用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，将第三步分离得到的含有极限糊精酶部分的溶液I 0. 120g溶于4.5mL蒸馏水中，上样，控制流速为lmL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液II ；
第四步将第四步所得含有极限糊精酶部分的溶液II冷冻干燥，即得到极限糊精酶产品0. 025g，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示单一条带，分子量约97Kda，纯化倍数为 30.22。 实施例4:
第一步硫酸铵分步沉淀在购买的麦芽极限糊精酶粗提液I中添加饱和度为25%的硫酸铵进行一次盐析后，在离心机内离心后在上清液中补加硫酸铵至饱和度为75%，盐析 24h后，得到麦芽极限糊精酶粗提液II ；
第二步离子交换层析阴离子交换树脂床体积为90mL，用pH值7. 0的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，然后将5. 2g的麦芽极限糊精酶粗提液II溶解于20mL蒸馏水中，上样，以上述缓冲液和含有0. 35mol/L NaCl的缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液I ；
第三步凝胶过滤层析凝胶过滤色谱柱床体积约为55mL，用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，将第三步分离得到的含有极限糊精酶部分的溶液I 0. 122g溶于5mL蒸馏水中，上样，控制流速为lmL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液II ；
第四步将第四步所得的含有极限糊精酶部分的溶液II冷冻干燥，即得到极限糊精酶产品0. 027g，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示单一条带，分子量约97Kda，纯化倍数为 28. 14。
权利要求
1.一种麦芽极限糊精酶的纯化方法，其特征在于包括如下步骤第一步硫酸铵分步沉淀在麦芽极限糊精酶粗提液I中添加饱和度为25 35%的硫酸铵进行一次盐析后，在由离心机离心取得的上清液中补加硫酸铵至饱和度为75、5%进行二次盐析，得到麦芽极限糊精酶粗提液II ；第二步阴离子交换层析阴离子交换树脂床体积为9(Tl00mL，用pH值7.0的 15^20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，然后将5. (Γ5. 5g的麦芽极限糊精酶粗提液II溶解于 2(T25mL蒸馏水中，上样，以上述缓冲液和含有0.5 1.0mol/L NaCl的缓冲液梯度洗脱，流速为2 4mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液I ；第三步凝胶过滤层析凝胶过滤色谱柱床体积约为5(T60mL，用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，将第三步收集的含有极限糊精酶部分的溶液I 0. 12(T0. 125g溶于r5mL 蒸馏水中，上样，控制流速为广2mL/min，收集产生蛋白吸收峰处对应的洗脱组分，进行酶活测定，收集含有极限糊精酶部分的溶液II ；第四步将第四步所得的含有极限糊精酶部分的溶液II冷冻干燥，即得到纯化的极限糊精酶。
2.根据权利要求1所述的麦芽极限糊精酶的纯化方法，其特征在于利用具有阴离子交换作用的DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱和具有分子筛作用的葡聚糖凝胶柱色谱两种柱复合纯化。
3.根据权利要求1所述的麦芽极限糊精酶的纯化方法，二次盐析时间为^T24h。
4.根据权利要求1所述的麦芽极限糊精酶的纯化方法，其特征在于所述的麦芽极限糊精酶粗提液II经过阴离子交换层析柱分离后，根据洗脱曲线，仅收集产生蛋白吸收峰且含有极限糊精酶的洗脱组分进入下一步纯化。
全文摘要
本发明公开了一种麦芽极限糊精酶的纯化方法。该方法包括1)硫酸铵分步沉淀在酶粗提液Ⅰ中添加饱和度为25~35%的硫酸铵去除杂蛋白，然后在上清液中补加硫酸铵至饱和度为75~85%，盐析得到粗酶液Ⅱ；2)离子交换层析填料预处理并装柱后，用pH值7.0的15~20mmol/LTris-HCl缓冲液平衡，上样，再以含有0～1mol/LNaCl缓冲液梯度洗脱；3)凝胶过滤层析将离子交换层析柱分离得到的样品经过凝胶过滤色谱柱进一步纯化后，进行冷冻干燥得到纯化较高的极限糊精酶产品。该方法工艺简便、安全、成本低，产品纯度高，纯化效果佳，是一种纯化极限糊精酶的有效、可靠的方法。
文档编号C12N9/24GK102268416SQ201110223640
公开日2011年12月7日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者冯倩倩, 胡飞 申请人:华南理工大学