专利名称：一种abcg2基因多态性检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种ABCG2基因多态性检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
ABCG2 是 ABC 转运蛋白超家族(ATP-binding cassette transportersuperfamily, ABC transporter superfamily)G 亚家族第 2 成员。ABCG2 定位于细胞膜，在正常组织中分布广泛，主要分布于具有分泌和排泄功能的组织如胎盘合体滋养层、小肠和结肠上皮、肝脏小管膜、胆小管膜、乳腺小叶及血管内皮细胞中。人类ABCG 2基因位于4q22 23，编码655个氨基酸残基。ABCG 2全长66kb，由16个外显子和15个内含子组成， 外显子为60 332bp不等。目前已发现ABCG2基因有40多个SNPs，其中本发明目标检测的3个SNPs位点最为常见。本发明目标检测的ABCG2基因突变位点(多态性位点)，如表所示
序号ABCG2位点突变的内容简写
~SEQ ID NO. 27的第184位核苷酸，发生C — T突变C184T
~2SEQ ID NO. 27的第229位核苷酸，发生C — A突变C229A
~SEQ ID NO. 28的第145位核苷酸，发生C — T突变C145T目前，对ABCG2基因多态性进行检测、分析的方法很少，常见的检测方法只有直接测序法，直接测序法是基因检测的金标法，但由于存在检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供ABCG2基因多态性检测液相芯片，该液相芯片可用于检测ABCG2基因三种常见基因型C184T、C229A和C145T的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种ABCG2基因多态性检测液相芯片，包括有(A).针对ABCG2基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C184T位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对C229A位点的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 C145T 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ IDNO. 12 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 6 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有多态性突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对C184T、C229A位点的SEQ ID NO. 22及SEQ IDNO. 23 ;和 / 或针对 C145T 位点的 SEQ ID NO. 24 及 SEQ ID NO. 25。优选地，所述ASPE引物为针对C184T位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列；针对C229A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和/或针对C145T位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列。本发明的另一目的是提供一种用于ABCG2基因多态性检测的特异性引物。实现上述目的技术方案如下 一种用于ABCG2基因多态性检测的特异性引物，其为所述特异性引物序列为针对 C184T 位点的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;针对 C229A 位点的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ IDNO. 10 ;和 / 或针对 C145T 位点的 SEQ ID NO. 11 R SEQ ID NO. 12。本发明的主要优点在于I.本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的ABCG2基因多态性检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。所设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的多态性位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，三种多态性位点检测可通过一步多重PCR即可完成两条含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。5.本发明中的ABCG2基因突变检测液相芯片为多个位点多种基因型的并行检测提供了一种不同构思的技术方案，并产生了显著的技术效果。同时，由于高通量高特异性等技术特征，更加符合实际应用的需求。本发明的液相芯片技术将代表着生物靶标检测的技术发展趋势。
具体实施方式
实施例I ABCG2基因多态性检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对ABCG2基因三种常见基因型C184T、C229A和C145T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表I ABCG2基因的ASPE弓丨物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种ABCG2基因多态性检测液相芯片，其特征是，包括有 (A).针对ABCG2基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对C184T位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对C229A位点的SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 C145T 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 6 ； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应多态性位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求I所述的ABCG2基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对C184T、C229A位点的SEQ ID NO. 22及SEQ ID NO. 23 ;和/或针对C145T位点的SEQ ID NO. 24 及 SEQ ID NO. 25。
3.根据权利要求I所述的ABCG2基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对C184T位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 8组成的序列；针对C229A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和/或针对C145T位点的由SEQ ID NO. 5和SEQID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列。
4.根据权利要求I所述的ABCG2基因多态性检测液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE引物为针对C184T位点的由SEQID NO. I和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列；针对C229A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和针对C145T位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C)·针对 C184T、C229A 位点的 SEQ ID NO. 22 及 SEQ ID NO. 23 ;和针对 C145T 位点的SEQ ID NO. 24 及 SEQ ID NO. 25。
5.根据权利要求I所述的ABCG2基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10 个 T0
6.一种用于ABCG2基因多态性检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对 C184T 位点的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;针对 C229A 位点的 SEQ ID NO. 9 及 SEQID NO. 10 ;和 / 或针对 C145T 位点的 SEQ ID NO. 11 R SEQ ID NO. 12。
全文摘要
本发明公开了一种ABCG2基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对C184T位点的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；针对C229A位点的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；和/或针对C145T位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12Q1/68GK102912008SQ20111022372
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者许嘉森, 陈家欣 申请人:广州益善生物技术有限公司