专利名称：人类非梗阻性无精子症相关的精浆微小核糖核酸标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及人类非梗阻性无精子症相关的精浆微小核糖核酸(microRNA，miRNA)标志物及其应用。
背景技术：
不孕不育是一类常见的生殖疾病，在我国育龄夫妇中的发病率约为10%。其中有近一半与男方因素有关，由此被称为男性不育。在所有导致男性不育病因中，精子生成障碍是最为常见的病因，也是我国成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一。精子生成障碍的发生是一个多因素、多阶段的过程，主要临床表现为射出精液中精子密度的降低，按WHO标准可分为少精子症、无精子症等(WHO定义无精子症显微镜检未见精子的标本，经3000g离心15min，仍无精子)。目前，对于精子生成障碍程度的评估主要依靠常规的精子密度判别 (人工计数或利用计算机辅助系统分析，即CASA)，尚无其他有效的手段。而常规的精子密度分析也存在以下缺点个体精液质量波动较大，尤其易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响，从而造成精子密度测量不准确；无法及时反映治疗后的结果，且不易进行动态监测，对相应疾病的早期诊断效果也远不能满足需要；而作为男性不育的最重要表现之一的非梗阻性无精子症，其明确诊断常需进行睾丸穿刺活检，这给寻求生育帮助的人群带来极大的痛苦。尽管目前国内外研究者正努力探索非梗阻性无精子症的新型评估和监测生物标志物，并对现有评估手段进行有效的补充，但一直难以突破传统生物标志物发展和男性生殖实际应用中的瓶颈，即有创穿刺活检、精液质量分析结果波动、以及早期诊断/动态监测困难。综上所述，由于非梗阻性无精子症起病比较隐匿，现有诊疗手段还存在一些不足， 发现、应用新的诊断、监测生物标志物是本领域亟待解决的问题。另外，非梗阻性无精子症的病因还不清楚，尚缺乏有效的治疗手段，大多数精子生成障碍病人只能选择ICSI或AID 等辅助生育手段，无法满足心理上的要求，并有可能出现后代的遗传缺陷。并且，有创伤的无精子症确诊手段可对患者的生理和心理造成影响。这都要求我们寻找到灵敏、特异、易于检测的标志物，这些新的标志物及其指标变化也可以作为相应疾病药物筛选、药效评价及靶向治疗的新途径。微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约 19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选kience杂志年度十大科技突破。 现在预测miRNA至少能调控5300个人类基因，也就是所有基因的30%。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现。目前，miRNA与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNA 通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而， miRNA与男性生殖尤其是精液质量的关系研究仍十分罕见，目前仅有极少量动物实验结果， 而未见人类精浆miRNA水平的研究。最新的研究成果发现血清/血浆中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血清miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道，((Nature))杂志也在其网站首页的“最新研究进展”专栏中展示了这一最新研究进展。然而同样作为体液的精浆还未得到相应的关注，若能发现稳定的与精子生成障碍相关的特异精浆miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国男性生殖健康也将是一次强有力的推动。目前，对精子生成障碍程度的评估多局限于常规精液分析，易出现结果的波动，且难以早期诊断和动态监测，对于无精子症的确诊还有赖于睾丸穿刺活检。迄今为止，还未见关于精浆miRNA用于精液质量和男性生殖功能的评价与治疗方面的任何报道，尤其是精浆 miRNA在人类非梗阻性无精子症的评价与诊疗方面。
发明内容
本发明的目的是提供人类非梗阻性无精子症相关的精浆microRNA标志物。本发明的另一个目的是提供上述精浆microRNA标志物的引物。本发明还有一个目的是提供含有上述精浆microRNA标志物或其引物的应用。本发明再有一个目的是提供含有上述精浆microRNA标志物或其引物的人类非梗阻性无精子症诊断或监测试剂盒。本发明的目的是通过下列技术措施实现的人类非梗阻性无精子症相关的精浆microRNA标志物，选自hsa-miR-141、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-l氺中的多种。所述的精浆microRNA 标志物，由 hsa-miR-141、hsa-miR-193a_5p、 hsa-miR-590-5p 禾口 hsa-miR-7—l* 构成。所述的精浆microRNA标志物，其中hsa-miR-141的序列为SEQ ID No. 1， hsa-miR-193a-5p 的序列为 SEQ ID No. 2，hsa-miR-590_5p 的序列为 SEQ ID No. 3， hsa-miR-7-l* 的序列为 SEQ ID No. 4。所述的精浆microRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID No. 1的标志物的上游引物为SEQ ID No. 5，下游引物为SEQ ID No. 6 ；序列为SEQ ID No. 2的标志物的上游引物为 SEQ ID No. 7，下游引物为SEQ ID No. 8 ；序列为SEQ ID No. 3的标志物的上游引物为SEQ ID No. 9，下游引物为SEQ ID No. 10 ；序列为SEQ ID No. 4的标志物的上游引物为SEQ ID No. 11，下游引物为 SEQ ID No. 12。所述的精浆microRNA标志物或其引物在制备人类非梗阻性无精子症诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是指能够测定这些精浆microRNA标志物在精浆中表达量的试剂。一种人类非梗阻性无精子症诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述精浆microRNA 标志物(hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-l* 中的多种)的引物。所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6， SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10，以及 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12)中的多对。所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有引物SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10，以及 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。更进一步，本发明所述的无精子症为人类男性原发性且病因不明的非梗阻性无精子症，即所选非梗阻性无精子症样本排除了感染、药物、内分泌、梗阻等导致精子生成障碍的因素。本发明详细描述如下本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了 RT-PCR方法、Taqman miRNA Array,Real-time PCR(Taqman 探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分一、研究对象选择和分组依据A组健康生育男性对照组(n = 80，20人芯片筛选，20人一期验证，40人独立人群验证)1.年龄在对至；34岁间；2.无生殖和内分泌系统疾病；3.无其它全身性疾病；4.性功能正常；5.精液质量正常；6. 一年内有正常生育史。B组非梗阻性无精子症组(n = 80，20人芯片筛选，20人一期验证，40人独立人群验证)1.年龄在对至；34岁间；2.男性不育一年以上；3.除无精子外无其他生殖和内分泌系统疾病；4.无其它全身性疾病；5.性功能正常；6. 一次射精精液经离心无精子，排除梗阻性病因；7.重复精液质量检测/睾丸穿刺活检，确诊为无精子症。二、精浆精子分离及前处理1.从-70°C冰箱取出冷冻精液后，将精液在37°C水浴使精液完全融解，15000转离心lOmin，取上清500 μ 1至一洁净1. 5ml EP管中。2.向EP管中加入500μ1 Trizol，12000转离心30min，立即取上清至一洁净 1. 5mlEP 管中。3.向EP管中加入500μ 1三氯甲烷，12000转离心15min，取上清至一洁净1. 5mlEP管中。4.重复步骤(2)、(3)两次，离心均为12000转15min。5.-20°C保存处理后的样本。三、Taqman miRNA array 蹄选1.取经过前处理的精浆，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。按下表所示配制反转录体系
权利要求
1.人类非梗阻性无精子症相关的精浆microRNA标志物，选自hsa-miR-141、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-l氺中的多种。
2.根据权利要求1所述的精浆microRNA标志物，其特征在于由hsa-miR-141、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p 禾口 hsa-miR-7—l氺构成。
3.根据权利要求1或2所述的精浆microRNA标志物，其特征在于hsa-miR-141的序列为 SEQ ID No. 1，hsa-miR-193a-5p 的序列为 SEQ ID No. 2，hsa-miR-590_5p 的序列为 SEQ ID No. 3，hsa-miR-7-l* 的序列为 SEQ ID No. 4。
4.权利要求3所述的精浆microRNA标志物的引物，其特征在于序列为SEQID No. 1的标志物的上游引物为SEQ ID No. 5，下游引物为SEQ ID No. 6 ；序列为SEQ ID No. 2的标志物的上游引物为SEQ ID No. 7，下游引物为SEQ ID No. 8 ；序列为SEQ ID No. 3的标志物的上游引物为SEQ ID No. 9，下游引物为SEQ ID No. 10;序列为SEQ ID No. 4的标志物的上游引物为SEQ ID No. 11，下游引物为SEQ ID No. 12。
5.权利要求1或2所述的精浆microRNA标志物在制备人类非梗阻性无精子症诊断或监测试剂中的应用。
6.权利要求4所述的引物在制备人类男性非梗阻性无精子症诊断或监测试剂中的应用。
7.一种人类非梗阻性无精子症诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求 1或2所述的精浆microRNA标志物的引物。
8.根据权利要求7所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求4所述引物中的多对。
9.根据权利要求8所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有引物SEQID No. 5 和 SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10，以及 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。
全文摘要
本发明属于基因工程及生殖医学领域，公开了人类非梗阻性无精子症相关的精浆微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物选自hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*中的多种。该标志物对非梗阻性无精子症具有特异性和敏感性，可用于制备非梗阻性无精子症诊断或监测的试剂，可避免侵入性诊断，可反复检测，且易于动态监测精子生成障碍的程度。
文档编号C12N15/113GK102296112SQ201110227418
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者吴炜, 夏彦恺, 沈洪兵, 王心如, 胡志斌 申请人:南京医科大学