专利名称：一种利用miRNA-210为标志物的早期低氧检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及一种利用miRNA-210为标志物的早期低氧检测试剂盒及方法。
背景技术：
低氧是当前病理学研究的热点，它包括高原低氧及多种疾病导致的体内器官缺氧等。高原低氧即随着海拔升高，氧浓度逐渐降低，形成高原低压低氧环境。高原低氧能导致人体产生一系列生理病理变化，即高原反应。疾病导致的体内缺氧则是由于血液供应不足导致的体内局部氧浓度较低，如心肌梗死，中风，粥样动脉硬化等心脑血管疾病中，低氧也是重要的治病因素之一。另一方面，低氧也是实体瘤微环境的重要特征之一，是临床上实体瘤对放疗、化疗产生耐受和预后效果差的重要原因。因此，不论是外界氧浓度的降低还是体内局部氧浓度的下降都对人体健康产生重要的影响。低氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor, HIF)是低氧感知系统的核心部件， 在转录水平协同调控数百个蛋白编码基因。虽然长期以来低氧研究关注的主要是低氧(特别是HIF)诱导升高的基因，最近低氧抑制的基因也日益受到人们关注。2007年以来，有多个研究显示低氧能诱导特异性microRNAs，并抑制一些有重要功能的基因的表达。miRNAs 在细胞生理病理过程中发挥重要调节作用。miRNAs的成熟活化形式长约19- 个核苷酸， 由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因3’非翻译区的部分互补序列配对，引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。现在普遍认为很多基因是通过这种方式调控的。目前的研究显示miRNAs通过调节一系列基因的表达能够参与细胞的所有代谢过程，包括分化、增殖、凋亡和代谢等。miR-210是低氧诱导因子(HIF)的靶基因，参与多个基因的调控，在低氧细胞中发挥重要作用。是一种潜在的能检测动物和细胞中受低氧胁迫的标志物分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测miRNA-210表达量的引物。本发明的目的还在于提供一种早期低氧检测试剂盒。本发明的目的还在于提供一种非诊断目的的早期低氧检测方法。一种检测miRNA-210表达量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示。一种早期低氧检测试剂盒，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制剂和灭菌水。所述标准样品为未经过低氧处理的动物或人的组织样品中的RNA反转录成的 cDNA。所述内参引物为根据待检测动物或人任一高表达基因序列设计的引物。一种非诊断目的的早期低氧检测方法，按照如下步骤进行
(1)提取待检样品的总RNA ；(2)将步骤(1)得到的总RNA反转录为cDNA ；(3)利用权利要求2或3所述的一种早期低氧检测试剂盒，以步骤(2)得到的cDNA 为模板，做定量PCR，检测样品中miRNA-210的表达量；(4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自早期低氧的生物组织样品。本发明的有益效果
图1是定量PCR检测海拔5000米低压低氧处理不同时间后大鼠脑脊液中mir-210
含量的结果。图2是定量PCR检测海拔5000米低压低氧处理不同时间后大鼠脑组织中mir-210
含量的结果。图3是定量PCR检测海拔5000米低压低氧处理不同时间后大鼠血液中mir-210
含量的结果。图4是定量PCR检测不同氧浓度和处理时间下神经干细胞培养液中mir-210含量的结果。图5是定量PCR检测不同氧浓度和处理时间下神经干细胞中mir-210含量的结^ ο
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例未说明的实验步骤参照《分子克隆实验指南》第三版，或参照相应试剂盒的说明书。实施例1样品准备将M只平均体重250g的SD大鼠(由军事医学科学院动物中心提供)分为4组， 分别是对照组、低氧0. 5小时组、低氧1小时组和低氧2小时组。实验组动物分别在低氧舱中给予5000米低压低氧处理不同时间。低氧舱以20米/秒的速度勻速升至5000米，实验结束后以20米/秒速度勻速降至常氧。大鼠低氧处理结束后立即用戊巴比妥钠麻醉，取脑组织、脑脊液和血液用于miRNA-210的检测。取孕13. 5天的wistar大鼠称重后用戊巴比妥纳(用量60_65mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部用75%酒精消毒，置于超净台中。剪开大鼠腹部，取出子宫置于预冷的解剖液中， 除去胎膜，分离出胎鼠。将胎鼠放于平皿中置于解剖镜下，剥去脑膜，分离出中脑，放入1毫升解剖液中，加入1毫升0. 25%的胰酶37度消化半小时。然后用含胎牛血清的DMEM/ F12培养基终止消化。700rpm离心4分钟，弃上清，用无血清DMEM/F12培养基洗一次，除去残留的血清和胰酶。用神经干细胞增殖液重悬细胞进行培养。将刚分离的第一代神经干细胞记为PO代，PO代的神经干细胞培养至四天左右即成为悬浮的神经细胞球。我们将神经球低速离心(600rpm，^iin)后弃去上清，用0. 25%的胰酶消化三分钟，然后用含胎牛血清的培养液终止消化，低速离心(eOOrpmdmin)后弃上清，再用细胞培养液重复洗两次后，用细胞增殖的完全培养液重悬细胞，计数后将细胞用完全培养液按1.5*105个/ml密度接种到培养瓶中，置孵育箱培养。传代的神经干细胞P2 至P6代用于进行以下实验的研究。将分组的神经干细胞转入离心管，900rpm离心5min，取两份250微升培养液加入 750微升Trizol LS中混勻，细胞沉淀加入1毫升Trizol裂解混勻。大鼠脑组织样品收集 将分组的大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，用1毫升注射器从椎骨大孔进针吸取脑脊液50-100微升，4度IOOOrpm离心5min，上清加入0. 5毫升Trizol LS中混勻。没IOOmg脑组织加入1 毫升Trizol在勻浆器中勻浆。按照1 1000的用量在细胞上清液和脑脊与Trizol LS的混合物中加入外参(mir-Cel-5%iimiCS)。样品与1Trizol的混合物可保存在_80度，实验时从-80度冰箱取出，室温放置20分钟。实施例2大鼠脑组织、脑脊液、血液、神经干细胞和神经干细胞培养液中RNA的抽提(1)样品(大鼠脑组织、脑脊液、血液、神经干细胞和神经干细胞培养液)室温放置 5分钟，从-80度冰箱取出的样品室温放置15分钟至融化。(2)每毫升TRIZOL加200微升三氯甲烷，剧烈晃动15秒，室温静置3分钟。(3) 4度12000g离心15分钟，上层为RNA(4)将上层水相约500微升转移到新EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混勻 10秒，置于-20冰箱沉淀两小时或过夜。(5)取出样品，4度12000g离心15分钟，倒掉上清加入1毫升75%乙醇(DEPC)洗涤沉淀，上下翻转十次，使白色RNA沉淀浮起，7500g离心5分钟，共进行两次。(6)弃上清，吸尽管中液体，使乙醇挥发干净(约2-5分钟)(7)待RNA沉淀边缘开始变干透明时，立即加入DEPC水(20微升左右)。取1微升用于定量，其它RNA与-80度保存备用。可加入1微升RNAase inhibiter防止RNA降解。实施例3反转录采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)试剂盒进行反转录。对于神经干细胞培养液、血液和大鼠脑脊液RNA样品每个样品各取10微升RNA 样品分别和mir-210(SEQ ID No. 3)及cel-M (SEQ ID No. 4)的特异性翻转引物混合，70度水浴10分钟，冰上放置两分钟。然后每个样品分别加入buffer 4微升，dNTP 2微升，反转录酶 1 微升，RNAase inhibitor 1 微升。 对于神经干细胞和大鼠脑组织RNA样品每个样品取2微克RNA分别和 miRNA-210(SEQ ID No. 3)及U6 (SEQ ID No. 5)的特异性翻转引物混合，70度水浴10分钟， 冰上放置两分钟。然后每个样品分别加入buffer 4微升，dNTP 2微升，反转录酶1微升， RNAase inhibitor 1微升。翻转好的cDNA在-20度保存，避免反复冻融。实施例4定量-PCR按照实验分组，每个样品检测内参和mir-210的含量。PCR正向引物和反向引物如序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，每个实验组三个复孔，体系为15微升，仪器为 ABI公司，sybgreen为ABI公司产品。实验体系为25微升2*sybgreen mix，21微升水，两微升引物，两微升Cdna。PCR反应条件是95度5分钟，95度10秒，60度20秒，70度15秒，40个循环，溶解曲线为70度到95度，温度间隔为0. 4度。PCR结果如图1-5所示，随着低氧时间的增加，脑脊液中的mir-210拷贝数上升，在低氧0. 5到1小时达到极显著(图1)；脑组织中mir-210的拷贝数在1到2小时内上升，达到极显著(图2)；血液中的mir-210的拷贝数在0.5小时的低氧时间内急速上升，以后略有下降，在0.5小时时达到极显著(图3)；神经干细胞上清中mir-210的拷贝数在不同低氧胁迫处理的浓度下，均在1小时达到极显著(图4)；神经干细胞中mir-210的拷贝数在 0. 5小时达到极显著(图5)；以上结果均表明，低氧胁迫处理均使mir-210的拷贝数增加。实施例5实施例1-4的结果表明，miRNA-210表达量在低氧胁迫时表达量上升，可作为检测低氧胁迫的标志物分子，根据这个结果和GeneBank上公布的miRNA-210的基因序列，设计检测miRNA-210表达量的通用引物和早期低氧检测试剂盒，引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2所示；试剂盒包含序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2所示的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制剂和灭菌水；标准样品为未经过低氧处理的动物或人的组织样品中的RNA反转录成的cDNA ；内参引物为根据待检生物体(人类和动物)任一大量稳定表达的基因的序列设计的引物。试剂盒的使用方法如下(1)提取待检样品的总RNA ；(2)将步骤(1)得到的总RNA反转录为cDNA ；(3)利用权利要求2或3所述的一种早期低氧检测试剂盒，以步骤⑵得到的cDNA 为模板，做定量PCR，检测样品中miRNA-210的表达量；(4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自早期低氧的生物组织样品。
权利要求
1.一种检测rniRNA-210表达量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示。
2.一种早期低氧检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制剂和灭菌水。
3.根据权利要求2所述一种早期低氧检测试剂盒，其特征在于，所述标准样品为未经过低氧处理的动物或人的组织样品中的RNA反转录成的cDNA。
4.一种非诊断目的的早期低氧检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行(1)提取待检样品的总RNA；(2)将步骤⑴得到的总RNA反转录为cDNA；(3)利用权利要求2或3所述的一种早期低氧检测试剂盒，以步骤(2)得到的cDNA为模板，做定量PCR，检测样品中miRNA-210的表达量；(4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自早期低氧的生物组织样品。
全文摘要
本发明公开了属于分子生物医学技术领域的一种利用miRNA-210为标志物的早期低氧检测试剂盒。本发明设计miRNA-210特异性的引物，采用定量PCR的方法检测不同浓度的低氧环境对大鼠脑脊液、血液、脑组织以及神经干细胞、神经干细胞培养液中miRNA-210的含量变化，含量显著增高为低氧胁迫组织。本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于检测动物和细胞是否处于低氧状态。
文档编号C12Q1/68GK102268483SQ20111022892
公开日2011年12月7日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者刘朝晖, 吴丽颖, 吴奎武, 朱玲玲, 王飞, 范明, 赵彤, 黄欣 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所