专利名称：实时荧光定量pcr检测人接触蛋白-1(cntn-1)试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，通过将组织中的mRNA逆转录为cDNA，再通过实时荧光定量PCR精确的检测人接触蛋白-I (contactin-1, CNTN-1)基因的mRNA水平。
背景技术：
肿瘤严重威胁人类健康，早期诊断对提高患者的生存率和生活质量有非常重要的意义。肿瘤的早期发现，早期治疗，可降低筛查人群癌症死亡率，改善预后，提高生活质量，减少放化疗药物的使用率，降低治疗费用。然而肿瘤的早期诊断一直是一个没有攻克的难题，因而发现合适的肿瘤标志并合理的应用肿瘤标志进行早期诊断，具有重要现实意义。
肿瘤早期诊断是对患者的确认或对无症状患者的及时诊断。常用的筛查方法有子宫颈癌的巴氏涂片，结直肠癌的隐血试验，前列腺癌的肛指检查，食道癌的拉网等，但这些检查均不理想。计算机断层扫描、超声诊断、乳房摄影等检测的最小极限为lcm(109细胞)直径的肿瘤。而聚合酶链反应可以检测细胞数在IO7-IO8的实体瘤，将肿瘤的早期诊断提高了一个数量级。Real-time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过real-time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。肺癌和食管癌是全球和我国死亡率较高的恶性肿瘤，也是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率高，预后较差。人接触蛋白-I (contactin-1，CNTN-1)是一种神经细胞黏附因子(NCAM)，参与了神经系统的发育。但是近年来发现人接触蛋白-I能介导肿瘤转移的分子，作为VEGF-C的下游效应分子，可介导肺癌和食管癌等的肿瘤转移和生长(Su JL,Yang PC,Shih JY, Yang CY, Wei LH, Hsieh CY, Chou CH, Jeng YM, Wang MY, Chang KJ, Hung MC,Kuo ML. The VEGF-C/FIt-4axis promotes invasion and metastasis of cancer cells.Cancer Cell, 2006,9 (3) :209-223 ；Liu P, Zhou J, Zhu H, Xie L, Wang F, Liu B, Shen ff,Ye WiXiang B，Zhu X,Shi R，Zhang S. VEGF-C promotes the development of esophagealcancer via regulating CNTN-1 express ion. Cytokine, 2011, 55 (I) :8-17)。人接角虫蛋白-I在肺癌、食管癌细胞中呈高表达，并与肺癌、食管癌等患者预后有密切的关系。因而能灵敏、精确的检测CNTN-I基因mRNA的表达对于判断肿瘤患者的预后具有重要的意义。
发明内容
本发明的试剂盒包含逆转录反应缓冲液，不含RNA酶的水，Oligo (dT) 12，dNTP混合物，RNA酶抑制剂，逆转录酶，MgCl2溶液，聚合酶反应缓冲液，耐热的Taq DNA聚合酶，检测用上游、下游引物和阳性对照DNA。其中逆转录反应体系包括逆转录反应溶液(250mM Tris-HCl (pH 8. 3), 375mMKCl,50mM DTT)，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶，不含RNA酶的水，Oligo (dT) 12，dNTP混合物和RNA酶抑制剂。
聚合酶反应体系含有聚合酶反应缓冲液(20mM Tris-HCl)，MgCl2溶液(IOmM)，耐热的Taq DNA聚合酶，dNTP混合物，检测用上游、下游引物，逆转录的cDNA或阳性对照DNA溶液。检测用上游引物序列为5’-GAGCCCAAATATTCTCTGTTGC-3’下游引物序列为5’-TGCCTCAGTCATCATGTGTGT-3’阳性对照DNA序列为5，-AAGGAAAATCCACATCCTTGAGAAGTAAAACAGCCAAAGATCACAGAAGCATCAGAACCATGTCTTGAGCCCAAATATTCTCTGTTGCTAAAGTTATATAACTAGCTATTGACAGAACTAGAGGTGCACCCACCCTATCCCCAAGTCTTCTCGGCTTACTGCTGCCTGCCTTTGGCATCCTTGTCTACTTGGAATTCTGAATGTGTTGTGACAGCTGCTGTTCCCATCCCAGCTCAGAAGACACCTTCAACCCTGGGATGACCACAATTCCTTCCAATTTCTGCGGCTCCATCCTAAGCCAAATAAATTATACTTTAACAAACTATTCAACTGATTTACAACACACATGATGACTGAGGCATTCGGGAACCCCTTCATCCAAAAGAAT AACTTTTAAATGGATATAAATGATTTTTAACTCGTTCCAATATGCCTTATAAACCACTTAACCTGATTCTGTGACAGTTGCATGATTTAACCCAATGGGACAAGTTACAGTGTTCAATTCAATACTATAGGCTGTAGAGTGAAAGTCAAATCACCATATACAGGTGCTTTAAATTTAATAACAAGTTGTGAAATATAATAGAGATTGAAATGTTGG-3’每次实验需要设置对照品，对照品分为阴性对照样品和阳性对照样品，阴性对照样品不含有CNTN-I的mRNA ;阳性对照样品为含有与CNTN-lcDNA序列一致的DNA。本试剂盒保存于-20°C至-80°C，尽量减少反复冻融。本发明是基于实时定量PCR技术检测CNTN-I基因的mRNA水平，在引物设计上引物只与CNTN-I的编码区匹配，与基因组中其他序列的一致性小于70%，并且引物跨一个外显子，减少了 DNA的污染，提高了反应的特异性。该方法经多种肿瘤组织标本检测表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR技术，使得CNTN-I的检测敏感性大大提高。本发明试剂盒的使用方法将本试剂盒从_20°C取出，自然融化。采用TRIzol法提取组织总RNA，以DNaseI消化RNA中残留的基因组DNA.制备反转录体系配制16. 5μ I反应体系，其中总RNA10μ l(lyg)，oligo(dT)122.5y 1，不含RNAse的水4μ I ;72°C水浴7分钟；在上述反应体系中加入莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶1μ 1，逆转录反应缓冲液5μ l，dNTP2y 1，RNase抑制剂O. 5 μ I ;将总体系为25 μ I的样品于水浴锅或PCR仪进行反转录，反应条件为42°C，I小时；95°C，5分钟；将反转录制备的cDNA置于_20°C冰箱内保存备用。每次实验需要设置对照实验。将逆转录的cDNA与阴性对照和阳性对照一同进行real-time PCR反应。阴性对照样品不含有CNTN-I的mRNA ;阳性对照样品为含有与CNTN-lcDNA序列一致的DNA。引物和DNA由生物公司合成。SYBR Green实时定量PCR检测CNTN-I基因的表达配制10 μ I反应体系，其中聚合酶反应缓冲液3 μ I,MgCl2溶液(IOmM) I μ 1，耐热的Taq DNA聚合酶2 μ 1，上游和下游引物(10 μ Μ)各0.5 μ 1，上述逆转得到的cDNAl μ 1，不含RNAse的水3 μ I。按如下的反应条件进行PCR扩增和荧光定量预变性，95°C，I分钟；PCR扩增，40个循环，95°C，15秒，60°C，I分钟；溶解曲线，95°C，15秒，60°C，15秒，95°C，15秒。
图I为阴性对照的溶解曲线。图2为肺癌/癌旁组织实时荧光定量PCR的溶解曲线。图3为食管癌/正常食管组织实时荧光定量PCR的溶解曲线。
具体实施例方式本发明结合附图和具体实施方式
作进一步说明。这些实施例仅用于说明本发明的目的，不用于限制本发明的范 围。实施例I肺癌/癌旁组织中CNTN-I表达的检测4例肺癌组织和对应的4例癌旁组织,均取30mg,采用TriZol (Invitrogen)试剂抽提RNA，取2 μ g总RNA，在总体积25uL的体系中进行逆转录反应。配制16. 5 μ I反应体系，其中总 RNA 10μ l(lyg)，oligo (dT)122.5y I，不含 RNAse 的水 4 μ I ;72°C 水浴 7 分钟；在上述反应体系中加入莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶I μ 1，逆转录反应缓冲液5 μ 1，dNTP2 μ 1，RNase 抑制剂 O. 5 μ I ;将总体系为 25 μ I 的样品于 GeneAmp PCR Systems2700PCR仪进行反转录，反应条件为42°C，I小时；95°C，5分钟；将反转录制备的cDNA置于-20°C冰箱内保存备用。SYBR Green实时定量PCR检测CNTN-1基因的表达配制10 μ I反应体系，其中聚合酶反应缓冲液3 μ I,MgCl2溶液(IOmM) I μ 1，耐热的Taq DNA聚合酶2 μ 1，上游和下游引物(10 μ Μ)各O. 5 μ I，上述逆转得到的cDNA I μ I，不含RNAse的水3 μ I。按如下的反应条件进行PCR扩增和荧光定量预变性，95°C，I分钟；PCR扩增，40个循环，95°C，15秒，60°C，I分钟；溶解曲线，95°C，15秒，60°C，15秒，95°C，15秒。Real-Time PCR反应后溶解曲线显示阴性对照样品无扩增峰(图I);肿瘤组织和癌旁组织样品溶解曲线均仅有单峰，表明扩增产物单一(图2)，上述样品的Ct值分别为肿瘤组织样品ICt值27. 3687癌旁组织样品ICt值32. 7064肿瘤组织样品2Ct值22. 2871癌旁组织样品2Ct值33. 9008肿瘤组织样品3Ct值26. 4216癌旁组织样品3Ct值35. 9829肿瘤组织样品4Ct值2L 7865癌旁组织样品4Ct值31. 0657肿瘤组织中CNTN-I的mRNA表达显著高于对应的癌旁组织。实施例2正常食管/食管癌组织标本中CNTN-I表达的的检测8例食管癌组织和2例正常食管上皮组织，均取30mg，采用TriZol (Invitrogen)试剂抽提RNA，取2 μ g总RNA，在总体积25uL的体系中进行逆转录反应。TRIzol法提取组织总RNA，以DNase I消化RNA中残留的基因组DNA.制备反转录体系配制16. 5 μ I反应体系，其中总 RNA 10μ 1(1μ g), oligo(dT)122. 5μ 1，不含 RNAse 的水 4 μ I ;72°C水浴 7 分钟；在上述反应体系中加入莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶I μ 1，逆转录缓冲液5 μ 1，dNTP2 μ 1，RNase 抑制剂 O. 5 μ I ;将总体系为 25 μ I 的样品于 GeneAmp PCR Systems2700PCR仪进行反转录，反应条件为42°C，1小时；95°C，5分钟；将反转录制备的cDNA置于-20°C冰箱内保存备用。SYBR Green实时定量PCR检测CNTN-1基因的表达配制10 μ I反应体系，其中聚合酶反应缓冲液3 μ I,MgCl2溶液(IOmM) I μ 1，耐热的Taq DNA聚合酶2 μ 1，上游和下游引物(10 μ Μ)各O. 5 μ I，上述逆转得到的cDNA I μ I，不含RNAse的水3 μ I。按如下的反应条件进行PCR扩增和荧光定量预变性，95°C，I分钟；PCR扩增，40个循环，95°C，15秒，60°C，I分钟；溶解曲线，95°C，15秒，60°C，15秒，95°C，15秒。Real-Time PCR运行后所以样品溶解曲线均仅有单峰，表明扩增产物单一(图2)，上述样品的Ct值分别为肿瘤样品ICt 值 23. 8928
肿瘤样品2Ct 值 23. 8587肿瘤样品3Ct 值 23. 0513肿瘤样品4Ct 值 27. 8186肿瘤样品5Ct 值 24. 1022肿瘤样品6Ct 值 23. 7204肿瘤样品7Ct 值 22. 7273肿瘤样品8Ct 值 25. 9116正常食管组织样品ICt值34. 6233正常食管组织样品2Ct值35. 2279食管癌组织中CNTN-I的mRNA表达高于正常食管组织。
权利要求
1.实时荧光定量PCR检测人接触蛋白-l(c0ntactin-l，CNTN-1)的试剂盒，其特征是含有逆转录反应缓冲液，不含RNA酶的水，Oligo (dT)12，dNTP混合物，RNA酶抑制剂，MgCl2溶液，聚合酶反应缓冲液，耐热的Taq DNA聚合酶，检测用上游、下游引物和阳性对照DNA。
其中逆转录酶溶液含有终浓度250mM Tris-HCl (pH 8. 3), 375mM KCl和50mM DTT ’聚合酶反应缓冲液含有20mM Tris-HCl ；10mM MgCl2溶液；逆转录酶为莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶； 检测用上游引物序列为5’ -GAGCCCAAATATTCTCTGTTGC-3’ ； 下游引物序列为5’ -TGCCTCAGTCATCATGTGTGT-3’ ； 阳性对照DNA序列为
全文摘要
本发明为一种实时荧光定量RT-PCR检测人细胞接触蛋白-1(contactin-1，CNTN-1)试剂盒，该试剂盒通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中CNTN-1的mRNA表达量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测患者的组织标本中CNTN-1的表达，用以辅助诊断、指导治疗及提示预后。
文档编号C12Q1/68GK102925542SQ20111023010
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月12日
发明者刘鹏飞, 项斌, 刘兵团, 沈卫东, 王芳军 申请人:江阴市人民医院