专利名称：锌指核酸酶定点敲除Myostatin基因特异靶位点的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种锌指核酸酶定点敲除Myostatin基因特异靶位点。
背景技术：
传统的基因敲除技术是以Cre/LoxP系统为基础，通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。目前为止，虽然利用此技术已成功制备出多种基因敲除动物模型，但实验工作量大、周期时间长、成功率低等缺点一直制约着传统基因敲除技术应用。传统基因敲除的效率约为万分之一，甚至更低。锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)是一种由锌指蛋白和R)kl核酸内切酶的剪切结构域重组形成的嵌合蛋白，其中锌指蛋白可特异性结合目的靶序列，FokI核酸内切酶则负责对DNA序列进行特异性剪切。当两个ZFN分别结合到位于DNA的双链上间隔5 至7个碱基的目的靶序列后，可形成二聚体，进而激活R)kl核酸内切酶的功能，使DNA在特定位点产生双链断裂，再通过同源重组或非同源末端连接修复断裂双链。ZFN能够对靶基因进行定点断裂，显著提高同源重组效率，是一种高效的新型基因打靶技术，已应用于多种动植物的基因靶向敲除。ZFN技术不仅在生物医学研究中应用广泛，更因其不需向基因组中引入外源序列而在临床医学和农业等领域产生重要影响，提供合适靶位点，可合成出作用靶位点的表达锌指核酸酶的质粒。猪MSTN(Myostatin)基因对骨骼肌的生长具有负调控作用。因此，对于定点敲除 MSTN基因的研究成为研究的热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA分子。本发明提供的DNA分子，为如下(1)或⑵或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能相关蛋白的 DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能相关蛋白的DNA分子。所述严格条件为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1由32个核苷酸组成。含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。所述的DNA分子、所述的重组载体在抑制MSTN基因表达或导致MSTN功能丧失中的应用也是本发明保护的范围。含有所述DNA分子的表达锌指核酸酶的质粒在抑制MSTN基因表达或导致MSTN功能丧失中的应用也是本发明保护的范围。所述MSTN的核苷酸序列为序列表中的序列4。所述抑制MSTN基因表达或导致MSTN功能丧失通过改变MSTN的编码框体现。所述改变MSTN的编码框体现在MSTN编码框的定点敲除、突变和/或定点插入。本发明的实验证明，本发明定位了 MSTN基因中一段特异的靶序列位点DNA片段， 并针对此特异位点构建ZFN质粒，将此质粒核转染猪胎儿成纤维细胞可以定点敲除或突变MSTN基因中特异的靶序列，并彻底破坏MSTN基因的表达。本发明的显著优势表现在针对MSTN序列中特异的靶序列位点构建的ZFN质粒可以按照设计人员的需求精确定点敲除或突变猪胎儿成纤维细胞中MSTN基因的靶位点序列，基因敲除效率高，能大大提高研究效率，能为研究MSTN基因的功能、制备定点敲除或突变MSTN转基因猪提供保证。
图1为ZFN的特异结合位点和特异敲除靶位点序列图2为ZFN定点敲除MSTN基因载体3为ZFN定点敲除MSTN特异位点原理4为菌液PCR鉴定5为阳性克隆定点敲除、突变和插入测序结果图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、针对猪MSTN基因特异靶位点序列ZFN质粒的设计与构建1、针对猪MSTN基因特异靶位点序列的设计构建定点敲除梅山猪MSTN基因靶序列特异位点的锌脂核酸酶(ZFN)质粒pZFN质粒，ZFN由一个DNA结合域和DNA切割结构域组成，ZFN对特异识别结合彡编码区内Mbp碱基，保证ZFN切割MSTN基因的高度精确与高效。锌脂核酸酶(ZFN)特异敲除靶位点序列位于MSTN基因(MSTN的核苷酸序列为序列4)第二外显子，特异靶位点序列为CCTTCCCAGGAC cagga GAAGATGGGCTGGTA(人工合成， 序列1，序列1为序列4的自5’末端第3770-3801位核苷酸)，具体见图1所示，两端部分序列(CCTTCCCAGGAC与GAAGATGGGCTGGTA)是ZFN的特异结合位点，中间部分序列(cagga) 是ZFN特异敲除的靶序列位点。2、重组质粒pZFN的构建pZFN质粒购自sigma公司(为一对质粒)，质粒的示意图为图2所示，其中ZFN为含有靶位点序列序列1的片段。原理如图3所示，在MSTN序列上设计打靶效率最高的目的敲除位点，锌指核酸酶能够识别并结合指定的位点，双体i^okl高效且精确地切断靶DNA产生双链DNA的断裂，随后细胞通过“同源定向修复”或“非同源末端连接” -DNA天然修复过程来治愈靶的断裂，从而造成MSTN基因切口处特异片段的敲除或在切口处插入突变的碱基序列进而对基因组进行定向编辑，改变动物的特异性状。实施例2、锌指核酸酶定点敲除MSTN基因1、猪胎儿成纤维原代细胞分离培养(1)选取怀孕35天的纯种梅山妊娠母猪(太仓市种猪场)作为实验动物，通过手术方式取出含有胚胎的子宫，置于无菌烧杯中，封口膜封口带入实验室；(2)在无菌超净台内将胚胎周围的包膜剔除，将胚胎放于无菌的加有PBS的烧杯中；(3)将胚胎逐个转移至小的无菌培养皿中，用无菌的剪刀和镊子去除胚胎的头、尾及四肢后，将组织剪成Imm3大小的小块，并加入少许血清使组织湿润；(4)将小块均勻涂布于瓶壁，每小块间距约0. 2cm-0. 5cm,小块涂布好之后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后向瓶内加入适量培养基，盖好瓶塞，放置于37°C培养箱中；(5)培养约8小时，待小块贴壁后，将培养瓶缓慢翻转平放，待细胞覆盖培养皿 80%左右即可冻存或传代。2、冻存细胞的复苏与培养从液氮中取出装有梅山猪胎儿成纤维细胞的冻存小管，立即投入37°C的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在anin内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入 5mL培养液，轻轻吹勻；将细胞悬液lOOOr/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入ImL完全培养基，轻轻吹勻，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。3、细胞培养条件及传代培养细胞培养条件培养基组成成分DMEM (Invitrogen catalog no. 11965-092)10%>20% FBS(Invitrogen catalog no. 8114318)PS (Invitrogen catalog no.15140)IXMEM NEAA (Invitrogen catalog no. 11140—050)IXHT Supplement (Invitrogen catalog no. 11067-030)1X Sodium Pyruvate (Invitrogen catalog no.11360-070)2ng/mL bFGF(Human, Recombinant catalog no. 132560029)传代培养(1)猪的胎儿成纤维细胞融合率达约80%左右；(2)吸去培养基，加入 IOmL 预热至 37°C 的 DPBS (Invitrogen REF :C14190500BT) 冲洗一遍，吸除DPBS ；(3)加入 2mL 预热至 37°C 的胰酶(Invitrogen catalog no. 25200)溶液，室温消化约3min ；(4)加入2mL培养基(含10% FBS)终止消化，用移液器反复吹打数次，至细胞全部均勻重悬在培养基中；
(5)将细胞转移至15mL离心管中，取部分细胞进行细胞计数，剩余细胞IOOOg离心 5min ；(6)弃上清，加入2mL培养基重悬细胞，分两份铺到加有培养基的培养皿中；(7)晃动平皿使细胞分布均勻后，至37°C、5% CO2培养箱中培养。4、核转染方法^ffi Lonza ^^11^ ^ Amaxa Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fibroblasts及核转染仪进行转染实验，具体操作(1)将核转染溶液(Nucleofector Solution)与添加物(Supplement)(试剂盒中含有)按体积比4.5 1的比例配制核转染溶液室温预热，单个样品转染可取82uL核转染溶液加入ISuL添加物配制成IOOuL核转染溶液；(2)六孔板中每孔加入1. 5mL培养基(含20% FBS)，置37°C、5% CO2培养箱中预执.
y 、人 (3)纯种梅山猪原代成纤维细胞复苏后传代2次，至细胞融合率90% ；(4)吸去培养基，加入IOmL预热至37°C的DPBS冲洗一遍，吸除DPBS ；(5)加入2mL预热至37°C的1 %胰酶溶液，室温消化约^iin ；(6)加入2mL含10 % FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器反复吹打数次，至细胞全部均勻重悬在培养基中；(7)将细胞转移至15mL离心管中，取部分进行细胞计数，剩余细胞IOOOg离心 5min ；(8)弃上清液，用微量加样器出去残留培养基，加入提前室温预热的核转染溶液， 重悬细胞，使细胞密度在ι χ IOfVlOOuL ；(9)向细胞悬液中加入pZFN质粒，使质粒浓度为5ug/100uL，轻轻吹吸混勻；(10)打开核转染仪，选择进入已优化好的程序(T-016)；(11)将细胞与质粒DNA的混合悬液转移到电击杯中，注意样品必须能够覆盖电击杯底部且避免生成气泡；(12)将电击杯放入电击槽中，按enter键开始电击；(13)程序结束后取出电击杯，沿电击杯内壁缓缓加入500uL预热的培养基，迅速将样品转移到加有培养基的6孔板中(步骤0))。37°C、5% CO2培养箱中培养48小时后进行检测及筛选工作。5、细胞总DNA提取按照SIGMA哺乳动物基因组DNA提取试剂盒(货号G1N70)操作说明，提取步骤4 得到的培养48小时的各组细胞总DNA，具体操作如下(1)将上述细胞培养液中含有约5X IO6个细胞收集于1. 5ml离心管中，300Xg离心5分钟，完全去除培养液；(2)加200 μ L的重悬液(Resuspension Solution)将沉积的细胞重新悬浮起来， 并在其中加入20 μ L去RNA酶液(RNase A Solution)，常温下温育2分钟；(3)加入20 μ L的蛋白酶K和200 μ L的裂解液(Lysis Solution C)，充分涡旋， 70°C条件下温育10分钟，使细胞充分裂解；(4)将吸附柱连接到收集管中，并在吸附柱中加入500μ L吸附柱准备液，12000 Xg离心1分钟，丢弃收集管中的液体；(5)细胞充分裂解后，加入200 μ L乙醇(纯度为100% )，充分涡旋10分钟；(6)将涡旋后1.5ml离心管中所有的样品转移到吸附柱中，用宽枪头吸取， 12000 Xg离心1分钟，丢弃收集管中的液体；(7)加入500 μ L的漂洗液12000 Xg离心1分钟，丢弃收集管中的液体；(8)加入500 μ L的漂洗液13000 Xg离心3分钟，丢弃收集管中的液体，并重新连接新的收集管，室温(25°C )晾干几分钟至乙醇完全挥发；(9)在吸附柱中心加入200 μ L的洗脱液，室温温育5分钟，12000 Xg离心1分钟得到细胞基因组DNA，-20°C保存备用。6、目的片段PCR扩增反应以上述步骤5得到的单克隆细胞基因组DNA为模板，以下表1所列的引物进行目的片段 PCR 扩增反应。反应体系为 50 μ 1，10 μ L 5 XBufferU μ L IOmM dNTPU μ L 25 μ M 弓I物 Sence primerU 1 μ L 25 μ M 弓丨物 Anti-sence primerUO. 5 μ L Roche Expand High Fidelity 5 Polymerase、200ng 基因组 DNA，加超纯水至 50 μ L。PCR 扩增程序95°C 5min ； 94°C 20、退火温度581(见表1)，72°C 30s，循环30次，最后72°C延伸5min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。表1扩增MSTN-基因组DNA目的片段引物表
扩增MSTN-基因组DNA目的片段引物目的片段Tm
Sence primerl5' TACAAGGTATACTGGAATCCGATCT 3' (序列2)397bp58 °CAnti-sence5，GCAAAGTAAAAGTATCAAGAGGGTA 3'primerl(序列3)7、PCR产物回收纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下仅含目的片段的凝胶，放入1. 5mL Ependorff管中，然后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒OiIAGEN)纯化目的片段，按照试剂盒说明书操作。具体步骤为向Ependorff管中加入相当于胶块3倍体积的溶胶液PN，50°C水浴IOmin至胶完全溶解；将所得溶液转入一个吸附柱中，12 OOOr/m离心30s，弃废液；吸附柱放回收集管并加入700uL漂洗液PW，12 000r/m离心30s，弃废液，再次向吸附柱中加入500uL漂洗液PW， 12 000r/m离心30s，弃废液；将吸附柱放入收集管中，12 000r/m离心^iin后，将吸附柱置于一个干净的离心管中并在室温放置数分钟使吸附柱中的酒精完全挥发，向吸附柱膜中央加入洗脱缓冲液EB，室温放置anin后，12 000r/m离心lmin，收集DNA溶液。8、纯化产物的连接使用TakaRa D101A试剂盒，连接反应体系总体积是10yL。分别将IyL的 PMDR18-T Vector，3 μ L纯化的 PCR 产物，1 μ L dH20,5y L Solution I 无菌离心管中，轻轻混勻，于4°C过夜。9、转化
取出DH5 α感受态细胞，放在冰上融化；将10 μ L连接产物加入100 μ L感受态细胞中，轻轻混勻，在冰上放置30min ；将离心管放置42°C水浴，热击90s，注意勿摇动离心管；快速将离心管转移至冰浴中，放置anin ；每管加500 μ L LB培养基，在37°C摇床温和摇动温育45min，使细菌复苏；取适当体积已转化细菌均勻涂布于适当的选择性培养基平板上；倒置培养皿，于37°C培养16h，得到重组菌。采用相同的方法将pMDR18-T Vector转入DH5 α感受态细胞中，得到对照重组菌。10、菌液PCR鉴定随机挑取几个重组菌的单菌落接种于ImL含100mg/L Amp的LB液体培养基中， 370C 300r/min摇动培养过夜；吸取1 μ L过夜培养的菌液为模板进行PCR鉴定，PCR反应体系和程序与步骤6—致。以对照重组菌为对照。PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照，结果如图4所示，可以看出，对照重组菌没有397bp目的片段，而得到397bp目的片段条带的为阳性重组菌。11、测序与鉴定随意挑取800个重组菌单菌落接种于ImL含100mg/L Amp的LB液体培养基中并送公司分别测序，测序成功的约为700个克隆。将测序所得的序列结果与MSTN基因中的靶位点序列(序列1)进行同源性比较分析，以鉴定转染ZFN质粒猪胎儿成纤维细胞基因组DNA 中靶位点是否被定点敲除。测序结果如图5所示，与靶位点序列(对照，序列1，序列表中序列4的第 3770-3801位核苷酸)相比，共获得7个定点敲除、突变或定点插入的阳性克隆，具体如下 3号阳性克隆定点敲除CAGG碱基，并将AGAAG突变为CAGGA ；967号阳性克隆定点敲除A碱基；455号阳性克隆特异敲除A碱基，并将G突变为T ；495号阳性克隆定点敲除CAG碱基； 939号阳性克隆定点敲除CAGG和A碱基，并将AGAAG突变为GAAGA ；781号阳性克隆，在特异靶位点定点插入C碱基；779号阳性克隆，在特异靶位点定点插入CAGGA碱基。因此，此靶位点序列可被定点敲除、突变或定点插入的效率约为1%，极大的提高了特异敲除的效率。阳性克隆菌落中特异靶位点的定点敲除、突变和定点插入都导致了猪MSTN基因读码框的变化，从而导致MSTN基因功能的突变或丧失。测序结果显示，MSTN靶位点序列确实可被定点敲除、突变和定点插入，从而突变 MSTN基因的功能，为制备定点敲除、插入和突变MSTN基因转基因克隆猪做好准备。
权利要求
1.一种DNA分子，其为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能相关蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能相关蛋白的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.权利要求1所述的DNA分子作为靶点、权利要求2所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抑制MSTN基因表达或导致MSTN功能丧失中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述MSTN的核苷酸序列为序列表中的序列4。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述抑制MSTN基因表达或导致MSTN 功能丧失通过改变MSTN的编码框体现。
6.根据权利要求3-5中任一所述的应用，其特征在于所述改变MSTN的编码框体现在 MSTN编码框的定点敲除、突变和/或定点插入。
全文摘要
本发明公开了一种锌指核酸酶定点敲除Myostatin基因特异靶位点。本发明提供一种DNA分子，其为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能相关蛋白的DNA分子；本发明的实验证明，本发明定位了MSTN基因中一段特异的靶序列位点DNA片段，并针对此特异位点构建ZFN质粒，将此质粒核转染猪胎儿成纤维细胞可以定点敲除或突变MSTN基因中特异的靶序列，并彻底破坏MSTN基因的表达。
文档编号C12N15/85GK102296073SQ201110229828
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者崔文涛, 李奎, 汤茂学, 钱丽丽 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所