专利名称：一种micb基因分型的pcr-sbt方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及用于人类MHC-I类链相关基因B位点(MHC class Ichain-related gene B, MICB)的扩增和分型方法，以及所述方法配套的试剂盒。
背景技术：
MHC-I 类链相关基因(MHC class I chain-related gene，MIC)，位于人 6 号染色体主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)基因区域中，长度为2Mb，所编码蛋白质分子是NK细胞、γ δ T细胞和CD8+T细胞等免疫细胞的活化性受体 NKG2D所识别的重要配体。目前已发现有7个MIC基因位点，仅MICA、MICB为功能基因，分别位于着丝粒461Λ和1401Λ位置处，靠近HLA-B位点三者高度连锁不平衡。MICB基因具有广泛的多态性，存在多个基因型。根据编码MICB分子胞外区的外显子2 5基因序列的差异，发现了 31个MICB等位基因。MICB基因编码蛋白MICB分子作为NKG2D配体参与多种感染免疫的过程，大量研究表明MICB基因多态性与多种疾病的易感相关，同时也是导致移植排斥的重要因素。当前MICB基因的分型尚无广泛普及，且无相关的商品试剂。另一方面HLA分型技术已广泛应用于多个领域，如HLA多态性的研究、HLA的生物学功能、器官和骨髓移植前供受者组织相容性配型、HLA与某些疾病的关联、亲子鉴定以及人类遗传学等方面。HLA分型技术主要由血清学分型技术、细胞学分型技术、基因分型技术等。个体的HLA遗传学差异的本质在于编码其抗原产物的基因上，所以分析个体HLA的基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法，其准确性远高于血清学与细胞血分型。目前以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法和细胞血分型技术。 基因分型方法具有独特的优点需要的血样少，标本可长期保存，相应的分型试剂可大量制备，来源不受限制。特别重要的是基因分型精确可靠，重复性好，其分型错误率远低于血清学方法，基因分型技术已在实际工作中得到了广泛的应用。目前国际上标注的HLA分型技术有PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)， PCR-SSO (聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和PCR-SBT (聚合酶链式反应产物直接测序分型)。PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) ik 禾尔 PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)，用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片段产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于MICB等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品进行多次杂交(甚至十几次)才能完成定型分析操作也十分繁琐，于是在此基础上又发展起来一种反向杂交法(reverse hybridization) 0将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物(待检测基因DNA)反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因的分析。此方法具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件必须严格统一(如温度、离子浓度)，容易出现误差；不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级；对某些杂合子分辨率也不好。很多基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式的不同，因此分辨率不及SSP和SBT。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存(三种效果比较)。PCR-SSP =PCR-SSP方法用预先设计出一整套等位基因组特异性引物(sequence specific primer, SSP)，借助PCR技术获得MICB型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定MICB型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行，分辨率可从低到高，成本低。缺点是不易自动化；不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成像仪保留原始资料，增加实验成本(三种效果比较)。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂(引物)，且不能识别新基因和假基因。针对目标序列外显子和内含子序列精细设计引物可避免这些问题。PCR-SBT 以PCR扩增所要分析的基因片段，然后对DNA序列进行分析，可直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。因此，应用SBT技术进行高分辨率基因分型是目前国际上公认的基因分型金标准。目前市面上尚无MICB基因分型试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种MICB基因分型的PCR-SBT方法以及与该方法配套的试剂盒，填补MICB位点分型的空白，进一步提高MICB分型技术的分辨率和精确性，同时降低实验的成本。为此，本发明采用以下技术方案一种MICB基因分型的PCR-SBT方法，包括以下步骤(1)、提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段MICB 的2-5外显子及之间的内含子；所述的扩增引物对为MICB-F和MICB-RMICB-F :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3，MICB-R :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’ ；所述PCR扩增反应条件依次为1)95 "C 5min ；2)重复以下19个循环940C 45s — 65°C 45s，每循环降低 0. 5°C— 72°C 2min ；3)重复以下13个循环940C 45s — 55°C 45s — 72°C 2min ；4) 72°C IOmin ；5)4°C 保持；所述PCR反应体系为20 μ 1，其组成如下浓度 4ng/ μ 1 的 DNA 10 μ 11. 49 μ 1 PCR缓冲液，(PCR缓冲液配制方法IOml PCR缓冲液含0. 8g氨基丁三醇，0. 22g硫酸氨，0. 67ml IM氯化镁，用盐酸调节pH到8. 8 ；)1. 49 μ 1 5mM dNTP ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ上游引物 MICB-F ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ下游引物 MICB-R ；
0. 49 μ 1 10% 牛血清蛋白；5. 32μ 1蔗糖/甲酚红染料；0. 12 μ 1 5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶；加双蒸水补足体积；O)、使用测序引物对步骤⑴所得PCR产物进行扩增，然后对扩增出的各序列进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；所述的用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物；MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3，MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3，MICB-CR4 :5，-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，。所述测序反应体系为10 μ 1，其组成如下2 μ 1 PCR 产物；3 μ 1 Big Dye 测序缓冲液；1 μ 1 Big Dye 测序末端；0. 25 μ 1 10 μ M 的测序引物；(每次用 MICB-CFU MICB-CR2、MICB-CF3、MICB-CR4 中的一条)3. 75 μ 1 双蒸水；所述测序扩增反应条件依次为1)重复以下对个循环96"C IOs — 50"C 5s — 60°C 4min ；2)4°C5min。上述的方法配套的试剂盒，包括扩增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外显子及之间的内含子的引物MICB-F 5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3 ’MICB-R :5，-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，；以及用于测序分析的4条引物MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3，MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3，MICB-CR4 :5，-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，。上述技术方案中，所述引物方向均从5，到3，；MICB设计模板为MICB*001所有等位基因序列均参照欧洲IMGT/HLA专业网站数据库http://WWW. ebi. ac. uk/imgt/hla/ index, html。本发明的基本原理是MICB的多态性复杂，MICB位点的等位基因位点31个，并且不断有新的等位基因被发现，因此要在有限的保守区设计能扩增MICB位点的2-5外显子的 PCR引物，并分别针对不同的外显子再设计测序引物。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.本发明MICB基因测序试剂盒以及测试条件的优化组合，其实验条件及实验体系是通过大量实验摸索获得，实验结果具有很好的稳定性。能有效的扩增MICB位点的2-5 外显子及其内含子的全长DNA片段，并对其进行测序，提高了对MICB基因分型的分辨率和精确性。2.由于本发明MICB基因测序试剂盒中主要试剂自行配置并优化，所用试剂均为常用的实验试剂，同时只用合成4条引物(因为MICB-CFl与MICB-F、MICB-CR4与MICB-R 序列相同可以通用)，并只进行4次测序反应就可以对样本进行高分辨的分型分析(最少可只对MICB-CR2与MICB-CFl进行2次测序反应，其基本涵盖了所有多态位点)，较当前现有的技术(需要合成多对引物并进行多次测序反应)大大降低了实验的成本。3.目前国内外尚无针对MICB位点检测的试剂盒，本发明具有创新性。4.本发明在测试过程中检测的对象均为中国人群，经试验证明本发明所述试剂盒进行检测的结果准确可靠，能适用于中国人群的检验。
图1是实施例1中MICB结构图上PCR扩增引物，测序引物位置示意图；图2是实施例1中所得MICB2-5外显子及其中的内含子全长PCR扩增产物；图3是实施例1中MICB-CFl测序所得测序图(涵盖MICB位点的2_3外显子全部多态位点)；图4是实施例1中MICB-CR4测序所得测序图(涵盖MICB位点的4_5外显子全部多态位点)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述，而不会限制本发明。实施例1 采用核苷酸序列表所述PCR扩增引物和测序引物(所述引物的位置如图1所示)， 对人血样进行MICB位点的高分辨率基因分型，具体步骤如下(1)提取基因组DNA按照ftx)maga公司基因组DNA抽提试剂盒操作说明书进行抽提。(2) PCR 扩增使用MICB位点扩增引物MICB-F和MICB-R进行MICB分型的扩增，上述扩增过程和扩增反应体系如下所述PCR扩增反应条件为1. 95°C for 5min2. 94°C for 45s — 65°C for 45s (每循环降低 0. 5°C ) — 72°C for 2min (重复 19 个循环)3. 94°C for 45s — 55°C for 45s — 72°C for 2min (重复 13 个循环)4. 72 °C for IOmin5. 4°C 保持所述PCR反应体系为20 μ 1，其组成如下表浓度 4ng/ μ 1 的 DNA 10 μ 1
1. 49 μ 1 PCR缓冲液，(PCR缓冲液配制方法IOml PCR缓冲液含0. Sg氨基丁三醇，0. 22g硫酸氨，0. 67ml IM氯化镁，用盐酸调节pH到8. 8 ；)1. 49 μ 1 5mM dNTP ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ上游引物 MICB-F ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ下游引物 MICB-R ；0. 49 μ 1 10% 牛血清蛋白；5. 32μ 1蔗糖/甲酚红染料；0. 12 μ 1 5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶；加双蒸水补足体积；其中dNTPs、Taq DNA聚合酶均购自北京康维世纪生物科技有限公司，引物由深圳华大基因科技公司合成。扩增所得PCR产物的电泳图如图2所示，结果表明得到目的基因片段(即MICB位点的2-5外显子及其内含子全长DNA片段)。按照常规技术对PCR扩增产物进行纯化。(3)使用测序引物进行测序扩增。测序反应采用的是不对称PCR方法，与普通PCR方法不同，其目的主要是为测序制备ssDNA，反应中只需添加一条特异性的测序引物，另一端是通用的BigDye末端。使用ABI 公司3730测序仪对步骤(2)中纯化的PCR产物进行测序，测序结果如图3至图4，首先使用测序引物MICB-CF1、MICB-CR4分别进行测序，测序结果涵盖了 MICB位点的2-5外显子所有多态位点。为了保证结果的准确可靠，采用MICB-CR2是在MICB-CFl相反的方向上测一次， MICB-CF3是在MICB-CR4相反的方向上测一次，从而保证每个多态位点都被测定了 2次，达到每个多态位点准确可靠的目的。上述测序扩增过程和测序扩增反应体系如下所述测序反应体系为10 μ 1，其组成如下表反应体系2 μ 1 PCR 产物3μ 1 Big Dye Buffer(ABI)1 μ 1 Big Dye Terminator (ABI)0. 25 μ 1 测序引物(ΙΟμΜ)3. 75 μ 1 双蒸水所述测序扩增反应条件为1. 960C for IOs — 50°C for 5s — 60°C for 4min (重复 24 个循环)2. 4°C for 5min(4)进行测序反应。通过对图3与图4进行分析，与IMGT/HLA数据库比对表明此标本的MICB位点基因型为杂合子MICB*00502-MICB*014，杂合位点在序列图中呈双峰嵌套样图形。实施例2，美国UCLA大学的国际质控和中华骨髓库质控的实验结果中华骨髓库HLA质控样本基本上是选自中国人常见的等位基因组合，而用本发明试剂也未发现漏检现象，与对照试剂结果完全一致。美国UCLA大学的HLA质控样本包括了世界范围内各人种的HLA等位基因组合，其结果也与对照试剂相符合。
权利要求
1. 一种MICB基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段MICB的 2-5外显子及之间的内含子；所述的扩增引物对为MICB-F和MICB-R MICB-F :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’ MICB-R :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，； 所述PCR扩增反应条件依次为1)95 0C 5min ；2)重复以下19个循环940C 45s — 65°C 45s，每循环降低 0. 5°C— 72°C 2min ；3)重复以下13个循环940C 45s — 55°C 45s — 72°C 2min ；4)72 °C IOmin ；5)4°C保持；所述PCR反应体系为20 μ 1，其组成如下 浓度 4ng/ μ 1 的 DNA 10 μ 11.49μ 1 PCR缓冲液，所述的PCR缓冲液配制方法10ml PCR缓冲液含0. 8g氨基丁三醇，0. 22g硫酸氨，0. 67ml IM氯化镁，用盐酸调节pH到8. 8 ；1.49 μ 1 5mM dNTP ； 0. 5μ 1 10 μ M 上游引物 MICB-F ； 0. 5μ 1 10 μ M 下游引物 MICB-R ； 0.49 μ 1 10%牛血清蛋白； 5. 32μ 1蔗糖/甲酚红染料； 0. 12 μ 1 5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶； 加双蒸水补足体积；O)、使用测序引物对步骤(1)所得PCR产物进行扩增，然后对扩增出的各序列进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果； 所述的用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物； MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3， MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’ MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3， MICB-CR4 :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于 所述测序反应体系为10 μ 1，其组成如下2 μ 1 PCR 产物； 3μ 1 Big Dye测序缓冲液； 1 μ 1 Big Dye测序末端； 0. 25 μ 1 10 μ M的测序引物；·3.75μ 1双蒸水；所述测序扩增反应条件依次为1)重复以下M个循环960C IOs — 500C 5s — 60°C 4min ；2)4°C 5min。
3. —种权利要求1所述的方法配套的试剂盒，其特征在于，包括扩增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外显子及之间的内含子的引物 MICB-F :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’ MICB-R 5' -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3‘； 以及用于测序分析的4条引物 MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3， MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’ MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3， MICB-CR4 :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’。
全文摘要
本发明提供一种MICB基因分型的PCR-SBT方法及试剂盒。对MICB基因位点2-5外显子进行基因分型，包括以下步骤(1)制备人类基因组DNA；(2)使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外显子及之间的内含子；(3)使用测序引物对步骤(2)所得的PCR产物进行扩增，然后对扩增出的产物进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；由于本发明MICB基因测序试剂盒以及测试条件的优化组合，有效的扩增MICB位点的2-5外显子的全长和部分内含子的寡聚核苷酸序列，并对相应外显子进行测序，从而能够精确的对其进行分型。
文档编号C12Q1/68GK102321749SQ201110229780
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者余平, 杜昆, 林琳, 罗奇志, 霍治, 龚拯 申请人:中南大学