专利名称：细胞高富集靶向分离方法
技术领域：
本发明专利属于一种生物治疗和细胞生物的技术领域，特别涉及一种细胞高富集靶向分离方法。
背景技术：
在生物医学工程关于细胞的科研领域及医学临床应用中，主要目的是研究细胞的功能和作用。例如脐血干细胞是一种具有分化潜能的原始细胞，具备自我更新和增值的能力，并能在特定因素的影响及诱导下，可以向各种细胞或组织分化。目前，造血干细胞移植已成为最基础的治疗手段，已广泛应用于许多疾病的治疗，包括恶性血液疾病、遗传性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤放化疗后的造血支持治疗等。基于脐血干细胞取材方便，扩增量大，移植成活率高等特点，使其在临床应用方面具有重大的理论意义和潜在的应用价值。因此目前国际和国内在临床医院、实验室都在着力开发细胞治疗技术领域，细胞分离技术是提取所需细胞的基础和必要的手段，获取高质量的所需要的细胞，是在细胞治疗中增生所需细胞的一个关键前提和必要保障。如何获得高质量、种类齐全、体积小、活性强的细胞，是分离技术成败的关键。但是目前所采用的分离方法和分离材料都不能有效地获得高质量的、种类齐全、体积微小、活性强的细胞，致使活性年轻细胞回收率和提取细胞存活率低。本专利提供一种全新的高富集靶向分离新技术及专用试剂。本专利的目的在于克服上述普通分离技术中存在的“活性年轻细胞回收率和提取细胞存活率低”的不足，而提供一种细胞高富集的靶向分离方法及专用试剂，该技术程序简单、便于操作，细胞的回收率95%;细胞的存活率85%，达到国际、国内领先水平。提高了细胞提取精度和效率、节约了分离提取细胞的成本。使其在生物治疗和细胞生物临床应用方面具有重大的理论意义和潜在的应用价值。如上构思，本发明的技术方案是一种细胞高富集靶向分离方法，其特征在于包括如下步骤(一 )专用试剂的组成和制备将氯化钠NaCl、氯化钾KCl、氯化钙CaCl2 · 2H20和蒸馏水混合配制成标本稀释液 A液；将羟乙基淀粉和蒸馏水混合配制成红细胞沉降液B液；将葡聚糖和蒸馏水混合配制成高富集细胞分离液C液；将辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成高富集细胞保存液D液；( 二)分离操作方法步骤(1)将含有枸椽酸钠或肝素抗凝的骨髓、脐带血、外周血或经血与A液按照1 1 的比例充分混勻；(2)将B液全部加入步骤(1)混合后的液体中，放入容器封闭后充分混勻，室温静置 20-30min ；(3)室温静止后观察有明显的红细胞沉降至最下层时，用移液管将上清液移至离心管中，并置于离心机中，离心力1210Xg(2500rpm)，离心4-5min;或用移液管将上清液移至无菌容器中；
(4)取步骤(3)离心后的离心管，弃上清液，每管加注射用生理盐水混勻，收集离心管中底部的细胞合并到移植离心管中；(5)取新的离心管，每支加入C液，并将步骤(4)所得细胞悬液或步骤C3)移至无菌容器中的上清液沿离心管壁缓缓加入到装有C液的离心管中，同时保证两液体分界清楚；(6)将步骤(5)的离心管用离心力720Xg(1200 2000rpm)，离心20_30min ；(7)将步骤(6)离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中，每支离心管中收集液的体积< 20ml ；(8)在步骤(7)收集液中加注射用生理盐水充分混勻，离心力1210Xg(2500rpm)， 离心4-5min，弃去上清，收集；再用注射用生理盐水洗涤2次，离心条件同上，收集细胞备用。在步骤(5)的细胞悬液中加入由辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成的高富集细胞保存液D液并充分混勻，离心力1210Xg (2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集，再用D 液洗涤2次，用离心力720Xg(1200 2000rpm)，离心20_30min，收集细胞备用。上述标本稀释液A液150ml由氯化钠NaCl 4. 2g、氯化钾KCl 3. 8g、氯化钙 CaCl2 · 2H204. Ig和蒸馏水混合配制成。上述红细胞沉降液B液150ml由羟乙基淀粉6g和蒸馏水混合配制成。上述高富集细胞分离液C液IOOml由葡聚糖25g和蒸馏水混合配制成。上述高富集细胞保存液D液150ml由辅酶6g、三磷酸腺苷5g和蒸馏水混合配制成。本发明具有如下的优点和积极效果1、利用该技术及专用试剂对骨髓、脐带血、外周血、经血和脂肪进行处理，以获取所需要的有核细胞(包括干细胞)。目前细胞处理技术已广泛应用于医学及生物工程科研领域，同时也广泛应用于生物治疗和细胞生物及医学临床方面。2、由于同一机体中不同的血细胞膜电位不同，因此采用本专利的细胞高富集靶向分离技术及专用试剂，便可以将所需的有核细胞(包括干细胞、间充质干细胞)成功、有效地分离提取出来。3、本发明的专用试剂主要原材料为葡聚糖、氨基酸、能量合剂、离子、蒸馏水等。这些原材料已经作为成熟的产品或制剂产品用于临床上对疾病的诊断或输液使用。4、由于该靶向分离细胞的主要原材料如葡聚糖等是由微生物发酵制成的成熟上市产品，而不是由各种动物、病原体、人源的组织和体液等生物材料制成，因此该方法涉及到的材料也是一种无毒、安全的生化制剂，不存在生物安全性方面的风险。在销售和运输过程中无需特殊装备和特殊运输，普通包装和一般避免震动运输即可满足需要，因此对使用者和环境不会产生不利影响。5、本发明适于从人类骨髓、脐带血、外周血、经血和脂肪中分离、纯化有核细胞 (包括干细胞、间充质干细胞)。该专利将为医学科研和临床治疗提供了一种全新的细胞高富集靶向分离新的技术和专用试剂，它可以帮助科研人员更快更好地实现生物治疗和细胞生物应用的多种目的。
具体实施例方式一种细胞高富集靶向分离方法，首先配制专用试剂1、将氯化钠(NaCl)-4. 2g、氯化钾(KCl) _3. 8g、氯化钙(CaCl2 ·2Η20)_4. Ig 和蒸馏水混合配制成150ml标本稀释液A液。2、将羟乙基淀粉-6g和蒸馏水混合配制成150ml红细胞沉降液B液。3、将葡聚糖_25g和蒸馏水混合配制成IOOml高富集细胞分离液C液。4、将能量合剂(辅酶_6g、三磷酸腺苷_5g)、蒸馏水混合配制成150ml高富集细胞保存液D液。A、D液为透明液体，B液、C液为微带乳光的水溶液；A液、B液、C液、D液内毒素均< 0. 5EU/ml ；分离细胞开始前，室温应控制在20°C 且在无菌环境下，可以选择下列二种操作方法操作方法1 1、将含有枸椽酸钠或肝素抗凝的骨髓、脐带血、外周血或经血与A液1 1的比例转移至A液瓶内，充分混勻。2、再将B液全部加入第1步后的液体中，容器封闭后充分混勻，室温静置(静置期间不得再摇动容器)，约30分钟。3、30分钟后，观察有明显的红细胞沉降至最下层时，用25ml移液管将上清液(约占全容量的2/ 移至50ml离心管中，每管50ml，尽量不吸取红细胞层。4、将第3步收集到离心管中的液体，置于离心机中，离心力1210Xg (约2500rpm)， 离心5min。5、取第4步离心后的离心管，弃上清液，每管加注射用生理盐水7-10ml混勻，收集离心管中底部的细胞，总体积在40-50ml合并到移植离心管中。6、取新的50ml离心管，每支加入20 25ml C液。7、将第5步所得细胞悬液沿离心管壁缓缓加入到装有25ml C液的离心管中，注意加入速度要慢，保证两液体分界清楚。8、将第7步的离心管用离心力720Xg (约1200 2000rpm)，离心20-30分钟。9、离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中，每支离心管中收集液的体积不超过20ml。10、在第7步收集液中加注射用生理盐水至50ml充分混勻，离心力1210Xg(约 2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集。再用注射用生理盐水洗涤2次(离心条件同上)， 收集细胞备用。11、(选择步骤)在第7步收集液中加D液至50ml充分混勻，离心力1210Xg(约 2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集。再用D液洗涤2次(离心条件同第8步)，收集细胞备用。操作方法2 1、将含有枸椽酸钠或肝素抗凝的骨髓、脐带血、外周血或经血与A液1 1的比例转移至A液瓶内，充分混勻。2、再将B液全部加入第1步后的液体中，容器封闭后充分混勻，室温静置(静置期间不得再摇动容器)，约30分钟。3、30分钟后，观察有明显的红细胞沉降至最下层时，用25ml移液管将上清液(约占全容量的2/ 移至无菌容器中，尽量不吸红细胞层。4、取新的50ml离心管，每支加入20 25ml C液。5、将第3步所得细胞悬液沿离心管壁缓缓加入到装有25ml C液的离心管中，注意加入速度要慢，保证两液体分界清楚。6、将第5步的离心管用离心力720Xg (约1200 2000rpm)，离心20-30分钟。7、离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中，每支离心管中收集液的体积不超过20ml。8、在第7步收集液中加注射用生理盐水至50ml充分混勻，离心力1210Xg(约 2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集。9、再用注射用生理盐水洗涤2次(离心条件同第8步)，收集细胞备用。10、(选择步骤)在第7步收集液中加D液至50ml充分混勻，离心力1210Xg(约 2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集。再用D液洗涤2次(离心条件同第8步)，收集细胞备用。注意事项1、操作过程应在万级洁净实验室的局部百级净化工作台内完成，以保证整个过程无菌操作。2、专用试剂盒不得用紫外线消毒，打开外包装，包装瓶用酒精消毒。3、A，B，C、D液三瓶试剂如出现浑浊、沉淀或有絮状物则不能使用，C液中出现结晶属于正常现象不影响使用。4、整个分离过程中，温度应控制在20°C 且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量。5、由于不同品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件。6、配制细胞悬液所用的培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。
权利要求
1.一种细胞高富集靶向分离方法，其特征在于包括如下步骤(一)专用试剂的组成和制备将氯化钠NaCl、氯化钾KC1、氯化钙CaCl2 ·2Η20和蒸馏水混合配制成标本稀释液A液； 将羟乙基淀粉和蒸馏水混合配制成红细胞沉降液B液；将葡聚糖和蒸馏水混合配制成高富集细胞分离液C液；将辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成高富集细胞保存液D液；(二)分离操作方法步骤(1)将含有枸椽酸钠或肝素抗凝的骨髓、脐带血、外周血或经血与A液按照1 1的比例充分混勻；(2)将B液全部加入步骤(1)混合后的液体中，放入容器封闭后充分混勻，室温静置 20-30min ；(3)室温静止后观察有明显的红细胞沉降至最下层时，用移液管将上清液移至离心管中，并置于离心机中，离心力1210Xg(2500rpm)，离心4-5min;或用移液管将上清液移至无菌容器中；(4)取步骤(3)离心后的离心管，弃上清液，每管加注射用生理盐水混勻，收集离心管中底部的细胞合并到移植离心管中；(5)取新的离心管，每支加入C液，并将步骤(4)所得细胞悬液或步骤C3)移至无菌容器中的上清液沿离心管壁缓缓加入到装有C液的离心管中，同时保证两液体分界清楚；(6)将步骤(5)的离心管用离心力720Xg(1200 2000rpm)，离心20_30min；(7)将步骤(6)离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中，每支离心管中收集液的体积< 20ml ；(8)在步骤(7)收集液中加注射用生理盐水充分混勻，离心力1210Xg(2500rpm)，离心 4-5min,弃去上清，收集；再用注射用生理盐水洗涤2次，离心条件同上，收集细胞备用。
2.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于在步骤(6)的细胞悬液中加入由辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成的高富集细胞保存液D液并充分混勻，离心力1210Xg(2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集，再用D液洗涤2次，用离心力 720Xg (1200 2000rpm)，离心 20_30min，收集细胞备用。
3.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于上述标本稀释液A 液150ml由氯化钠NaCl 4. 2g、氯化钾KCl 3. 8g、氯化钙CaCl2 ·2Η20 和蒸馏水混合配制成。
4.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于上述红细胞沉降液B 液150ml由羟乙基淀粉6g和蒸馏水混合配制成。
5.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于上述高富集细胞分离液C液IMml由葡聚糖25g和蒸馏水混合配制成。
6.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于上述高富集细胞保存液D液150ml由辅酶6g、三磷酸腺苷5g和蒸馏水混合配制成。
全文摘要
一种细胞高富集靶向分离方法，1、将骨髓、脐带血、外周血或经血与标本稀释液按照1∶1混匀；2、将红细胞沉降液全部加入步骤1混合后的液体中，放入容器封闭后充分混匀，室温静置；3、用移液管将上清液移至离心管经过离心机离心或用移液管将上清液直接移至无菌容器中，将上清液加入到装有高富集细胞分离液的离心管中；4、将步骤3中的收集液离心，离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中；5、在步骤4的收集液中加注射用生理盐水混匀、离心，弃去上清，收集；再用注射用生理盐水洗涤、再离心，收集细胞备用。本发明便于操作、细胞的回收率≥95％、细胞的存活率≥85％、提高了细胞提取精度和效率，节约了分离提取细胞的成本。
文档编号C12N5/0789GK102399746SQ20111023576
公开日2012年4月4日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日
发明者丁泽荣, 任峰, 门剑龙 申请人:天津美德太平洋科技有限公司