专利名称：一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量pcr内参分子的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种适用于沙漠植物准噶尔无叶豆幼苗各种非生物胁迫下实时荧光定量PCR研究的内参分子的筛选方法
背景技术：
随着全球气候变暖和温室效应加剧，干旱区农业生产受到严峻挑战。面对我国人口不断增长、耕地和水肥资源日益减少、粮食供需矛盾日益尖锐的严峻现实，如何在节约资源和改善环境的同时，快速提高作物的产量，已成为我国农业持续高效发展的重大需求。干旱区长期进化过程中积累的抗干旱基因资源是开展种质创新的源动力！干旱区严酷的自然环境孕育了特殊的生物，其中尤以分布在流动沙丘上的极端耐旱沙生植物最具有代表性。沙生植物是一类特殊的植物类群，可在高效利用有效水分的同时，维持高效的光合作用，是宝贵的战略性植物资源。准噶尔无叶豆是沙生植物的典型代表。准噶尔无叶豆(Eremosparton songoricum(Litv. ) Vass.)系豆科无叶豆属超旱生无叶灌木，仅片断化分布于新疆古尔班通古特沙漠流动沙丘上，是典型的流沙先锋植物。该种是我国的单属种植物类群，西北荒漠植被中的标志性种，稀有种。由于长期生活在极端恶劣的流动沙丘环境中，沙漠干旱、少雨、大风、沙埋等环境塑造了准噶尔无叶豆抗旱的形态学及生理学特性，表现在该种为小半灌木，叶极端退化，以营养枝执行光合作用，故称“无叶豆”;具有超强的根吸水能力以及细胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，长期的环境压力使得该种具有抗旱，抗高温，抗风蚀沙埋等抵抗多种非生物胁迫的能力，其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源。要了解准噶尔无叶豆体内丰富的抗旱基因资源及其功能，很关键的一个方法就是要克隆抗旱基因并迅速、准确地定量检测抗旱基因在各种非生物胁迫下的表达。传统的印迹杂交，生物芯片技术和RT-PCR等手段在实时、定量检测抗旱基因表达量上，或存在缺陷， 或价格昂贵、费时费力。随着分子生物学各项技术的发展，实时荧光定量PCR已经成为目前基因表达定量检测的主要方法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶基因表达量，定量线性宽；而且可精确检测出同一处理不同组织、或者同一组织不同发育时期微小的基因表达水平差异。但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录率上可能存在的差别。以往对内参基因的研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定，在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的。若盲目的使用一个内参或几个内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能得到错误甚至是相反的结论。内参基因的稳定性问题近年来越来越受争议和关注。因此，研究和筛选特定植物中最稳定的内参分子和最合适的内参数目(或者说最优的内参组合)是进行荧光定量PCR实验的先决条件。目前，文献中用来作为植物基因表达分析的内参主要有ISSrRNA，Actin, GAPDH等。因所研究植物的系统学谱系关系不同、 生活型不同以及植物组织部位不同其选择内参也不同。目前为止，对植物抗逆基因不同胁迫下表达量的研究多盲目参考在其他植物类群中使用过的内参，如Actin，ISSrRNA等，但对其在极端耐旱沙生植物抗旱基因研究中的恒定性及其作为内参的适用性均未进行探究，并且开发新的内参分子尚未见报道。近年来，从准噶尔无叶豆中已克隆出一些抗逆基因，如脱水响应元件结合蛋白 (DREB)转录因子基因(NCBI登录号HQ687367)，这些基因的特性和功能亟待研究，但关于该种的内参基因的序列资料未见报道，最合适内参分子的研究更是空白。因此，本发明就旨在探究一种在非生物胁迫条件下准噶尔无叶豆幼苗开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参分子的筛选方法，为以后大规模开展抗逆基因克隆及功能研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法利用实时荧光定量PCR方法研究沙生植物抗逆相关基因功能时，缺少适用的、可靠的、表达恒定的内参分子，提出了一种适用于沙生植物准噶尔无叶豆在非生物胁迫条件下开展实时荧光定量PCR研究的最稳定，最合适的内参分子的筛选方法；利用同源克隆的方法对准噶尔无叶豆中的八个内参基因进行了克隆，并以这些序列为基础设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物。选取受10种非生物胁迫和没有胁迫(对照)的两周大幼苗为实验材料进行荧光定量PCR实验验证，运用geNorm软件进行荧光定量数据的分析，从而筛选出准噶尔无叶豆幼苗开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合，最稳定的内参分子是EF和α-tubulin。以干旱胁迫下的无叶豆幼苗为例，以无叶豆中的DREB转录因子基因为目的基因，用EF和α -tubulin两个最优内参组合来探讨DREB基因在干旱胁迫下的表达规律。运用本发明所述方法克隆，筛选并证实的内参分子，可避免在多种非生物胁迫下准噶尔无叶豆样本在RNA产量，质量及反转录效率上可能存在的差别，能更好的对实时荧光定量PCR检测出的数据进行校正和标准化，提高对该种基因定量研究的准确性和可靠性。本发明所述的一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，按下列步骤进行a、利用同源克隆的方法对准噶尔无叶豆幼苗中8个内参候选基因进行了克隆，并以这些序列为基础设计了 9对实时荧光定量PCR的内参基因引物；b、分别选取干旱，高盐，冷，热，脱落酸，氧化胁迫，机械损伤，重金属胁迫为硫酸铜和硫酸锌胁迫，紫外胁迫10种非生物胁迫以及无胁迫处理的的准噶尔无叶豆叶片为实验材料，进行荧光定量PCR实验；C、将实时荧光定量PCR得到的数据导入geNorm软件进行内参稳定性和内参数目分析，筛选出内参分子和内参分子组合；d、选取干旱胁迫下的准噶尔无叶豆叶片，以准噶尔无叶豆中的脱水响应元件结合蛋白基因为目的基因，用实时荧光定量PCR和geNorm软件筛选出来的内参分子来探讨DREB 基因在干旱胁迫下的表达规律。
步骤b和步骤d中，准噶尔无叶豆叶片为准噶尔无叶豆两周大幼苗的叶片。步骤b中非生物胁迫处理的条件为分别用20%聚乙二醇6000，250mM氯化钠， ΙΟΟμΜ脱落酸，0. 5mM硫酸铜，0. 5mM硫酸锌，50mM双氧水，0. 5w/m2紫外辐射来模拟干旱，高盐，脱落酸，重金属，氧化和紫外胁迫；将无叶豆幼苗分别置于温度4°C冰箱和温度40°C光照培养箱来模拟低温和高温胁迫；机械损伤胁迫是通过剪断叶片和茎来实现，所有处理均是在胁迫4h后取材，且取得的材料要立即置于液氮中，并迅速置于温度-80°C冰箱储存。步骤b中实时荧光定量PCR模板均为Iyg RNA反转得到的cDNA的5倍稀释液，且荧光定量程序为第一步是预变性温度95°C 30秒；第二步是PCR反应阶段，温度95°C _5 秒，温度58°C -30秒，40个循环，收集荧光信号；第三步是溶解曲线分析，温度65°C _95°C， 温度65°C在30s逐步升至95°C，每0. 5 °C收集一次荧光信号。步骤d中干旱胁迫处理的时间点为0h，2h，6h，12h，Mh。本发明所述的一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法中利用同源克隆的方法对准噶尔无叶豆幼苗中8个内参基因进行了克隆，其中8 个内参基因序列为18S rRNA核苷酸序列 GATTTACTATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCTTCGAGTCTGGTACTTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGGCCGGCCGGTCCGCCTTTCGGTGTGCACCGGTCGTCTCGTCCCTTCTGCCGGCGATGCGCTCCTGGTCTTAACTGGCCGGGTCGTGCCTCCGGCACTGTTACTTTGAAGAAATTAGAGTGCTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGGATACATTAGCATGGGATAACATCATAGGATTTCGGTCCAATCGAPDH核苷酸序列ATTGCTCACTTGAAGGGTGGGGCTAAGAAGGTTGTGATTTCTGCCCCTAGCAAAGATGCACCCATGTTTGTTGTAGGCGTTAACGAGAAGGAATACGAACCAGAGCTTAACATTGTTTCCAATGCTAGCTGCACTACCAATTGCCTTGCTCCTCTCGCCAAGGTTATCAATGACCGATTTGGAATAGTAGAGGGTCTTATGACCACTGTCCATGCTATCACAGCTACTCAGAAGACTGTTGATGGACCATCAAGCAAGGATTGGAGAGGTGGAAGAGCTGCTTCCTTCAACATTATTCCCAGCAGCACTGGAGCTGCCAAGGCTGTAGGAAAAGTGCTTCCAGCATTGAATGGCAAATTGACCGGAATGTCTTTCCGTGTCCCTACCGTCGATGTCTCGGTTGTTGACCTCACTGTTAGGATTGAGAAGAAAGCAACCTATGAACAAATTAAGGCTGCTATC
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权利要求
1.一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，其特征在于按下列步骤进行a、利用同源克隆的方法对准噶尔无叶豆幼苗中8个内参候选基因进行了克隆，并以这些序列为基础设计了 9对实时荧光定量PCR的内参基因引物；b、分别选取干旱，高盐，冷，热，脱落酸，氧化胁迫，机械损伤，重金属胁迫为硫酸铜、硫酸锌胁迫和紫外胁迫共10种非生物胁迫以及无胁迫处理的的准噶尔无叶豆叶片为实验材料，进行荧光定量PCR实验；C、将实时荧光定量PCR得到的数据导入geNorm软件进行内参稳定性和内参数目分析， 筛选出内参分子和内参分子组合；d、选取干旱胁迫下的准噶尔无叶豆叶片，以准噶尔无叶豆中的脱水响应元件结合蛋白基因为目的基因，用实时荧光定量PCR和geNorm软件筛选出来的内参分子来探讨DREB基因在干旱胁迫下的表达规律。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b和步骤d中，准噶尔无叶豆叶片为准噶尔无叶豆两周大幼苗的叶片。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中非生物胁迫处理的条件为分别用20%聚乙二醇6000，250mM氯化钠，100 μ M脱落酸，0. 5mM硫酸铜，0. 5mM硫酸锌，50mM双氧水，0. 5w/m2紫外辐射来模拟干旱，高盐，脱落酸，重金属，氧化和紫外胁迫；将无叶豆幼苗分别置于温度4°C冰箱和温度40°C光照培养箱来模拟低温和高温胁迫；机械损伤胁迫是通过剪断叶片和茎来实现，所有处理均是在胁迫4h后取材，且取得的材料要立即置于液氮中，并迅速置于温度-80°C冰箱储存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中实时荧光定量PCR模板均为1μ g RNA反转得到的cDNA的5倍稀释液，且荧光定量程序为第一步是预变性温度95°C -30 秒；第二步是PCR反应阶段，温度95°C -5秒，温度58°C -30秒，40个循环，收集荧光信号； 第三步是溶解曲线分析，温度65 °C -95 °C，温度65°C在30秒逐步升至95°C，每0. 5°C收集一次荧光信号。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中干旱胁迫处理的时间点为0h， 2h，6h，12h，24h。
全文摘要
本发明涉及一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法利用同源克隆对准噶尔无叶豆中的8个内参基因进行了克隆，并设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物，选取受10种非生物胁迫和没有胁迫(对照)的两周大幼苗为实验材料进行荧光定量PCR实验验证，运用geNorm软件进行荧光定量数据的分析，从而筛选出准噶尔无叶豆幼苗开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合，最稳定的内参分子是EF和α-tubulin。用本发明所述方法可避免不同非生物胁迫下的准噶尔无叶豆幼苗材料在RNA质量，产量及反转录效率等上的存在的误差，能更好的对实时荧光定量检测的数据进行校正和标准化，提高了研究的准确性和可靠性。
文档编号C12Q1/68GK102321758SQ20111023901
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者张道远, 李小双, 杨红兰, 裴金玲 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所