专利名称：肺癌药物筛选细胞株的建立的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，特别是涉及一种可用于肺癌药物筛选的细胞株的建立。
背景技术：
肺癌是严重威胁人类健康的疾病，也是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。我国的肺癌发病人数占全世界的第一位，且呈上升趋势。尽管到目前为止，已有数十种肺癌药物 (包括核酸类药物、小分子药物、蛋白类药物等)可以用于临床治疗，但大多数肺癌药物都只能使病情缓解，无法做到根治。因此，迫切需要筛选出新的有效的肺癌药物。高通量药物筛选是目前世界上最流行的药物研发手段，而高通量药物筛选平台的建立则需依靠高通量筛选模型的实现。由于细胞水平的药物筛选模型具有材料用料少，药物作用机制明确，可实现大规模筛选等特点，已被广泛应用于肺癌药物筛选和机理研究中 (Huang Μ, Rong Y, Ning HX,et al.Establishment of high throughput drug screening cell models based on JAK-STAT. Actapharm sin, 2004，39 :164-167)。然而，纵观国内外的人肺癌细胞药筛模型，尚缺乏一种对肺癌药物敏感、可在体内外长期稳定表达、实验重复性能高、荧光标记的肺癌细胞系，以满足肺癌新药快速筛选所
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发明内容
本发明的目的旨在提供一种新的可用于肺癌药物筛选的转基因细胞株。本发明的第一方面是提供了一种可表达慢病毒载体携带的抗生素抗性基因和报告基因的人肺癌细胞株。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株可用于筛选治疗或者预防肺癌的药物；所述治疗或者预防肺癌的药物为单克隆抗体或核糖核酸。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株可由如下方法制得(1)用携带有抗生素抗性基因和报告基因的慢病毒载体转染人胚肾细胞，获得真核表达抗生素抗性基因和报告基因的假慢病毒颗粒；(2)将(1)中得到的假慢病毒颗粒感染人肺癌Η1299细胞，经抗生素筛选得到。在另一优选例中，所述慢病毒载体为HIV-I载体系统。在另一优选例中，所述抗生素为嘌呤霉素。在另一优选例中，所述报告基因为eGFP。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株为人肺癌H1299细胞。本发明的第二方面是提供了一种制备可表达慢病毒载体携带的抗生素抗性基因和报告基因的人肺癌细胞株的方法，包括如下步骤(1)用携带有抗生素抗性基因和报告基因的慢病毒载体转染人胚肾细胞，获得真核表达抗生素抗性基因和报告基因的假慢病毒颗粒；CN 102321587 A
说明书
2/6页(2)将(1)中得到的假慢病毒颗粒感染人肺癌H1299细胞，经抗生素筛选得到。在另一优选例中，所述慢病毒载体为HIV-I载体系统。在另一优选例中，所述抗生素为嘌呤霉素。在另一优选例中，所述报告基因为eGFP。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株为人肺癌H1299细胞。本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
图1慢病毒包装质粒GV225的结构示意2慢病毒包装质粒pHelper 1. 0的结构示意3慢病毒包装质粒pHelper 2. 0的结构示意4不同传代时间的H1299-G细胞的绿色荧光表达情况(4A为第1天，4B为第30 天)图5H1299-G细胞对肺癌药物西妥昔(Cetuximab)的敏感性实验图6抗肺癌单克隆抗体对H1299-G细胞增殖的影响图7抗肺癌核酸药物对H1299-G细胞增殖的影响
具体实施例方式本发明人经过长期地研究和反复地筛选，找到一种对肺癌药物敏感的可稳定表达慢病毒载体携带的肺癌药物抗性基因和报告基因的细胞株。该细胞株是一种理想的研究肺癌药物筛选的模型。基于此完成了本发明。进而，本发明提供了一种可表达慢病毒载体携带的抗生素抗性基因和报告基因的人肺癌细胞株。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株可用于筛选治疗或者预防肺癌的药物；所述治疗或者预防肺癌的药物为单克隆抗体或核糖核酸。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株可由如下方法制得(1)用携带有抗生素抗性基因和报告基因的慢病毒载体转染人胚肾细胞，获得真核表达抗生素抗性基因和报告基因的假慢病毒颗粒；(2)将(1)中得到的假慢病毒颗粒感染人肺癌Η1299细胞，经抗生素筛选得到。在另一优选例中，所述慢病毒载体为HIV-I载体系统。在另一优选例中，所述抗生素为嘌呤霉素。在另一优选例中，所述报告基因为eGFP。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株为人肺癌H1299细胞。本发明的第二方面是提供了一种制备可表达慢病毒载体携带的抗生素抗性基因和报告基因的人肺癌细胞株的方法，包括如下步骤(1)用携带有抗生素抗性基因和报告基因的慢病毒载体转染人胚肾细胞，获得真核表达抗生素抗性基因和报告基因的假慢病毒颗粒；(2)将(1)中得到的假慢病毒颗粒感染人肺癌Η1299细胞，经抗生素筛选得到。
在另一优选例中，所述慢病毒载体为HIV-I载体系统。在另一优选例中，所述抗生素为嘌呤霉素。在另一优选例中，所述报告基因为eGFP。在另一优选例中，所述人肺癌细胞株为人肺癌H1299细胞。如本发明所用，慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-I(HIV-I)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-I基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。携带有目的基因的重组慢病毒载体成分可通过本领域的常规方法构建获得，如将真核基因表达载体的选择标记基因(如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因等)和用于快速检测的报告基因(如绿色荧光蛋白基因、氯霉素乙酰转移酶基因等)整合到慢病毒载体的多克隆位点；亦可通过商业途径购买获得，如购买上海吉凯基因化学技术有限公司生产的慢病毒载体系统产品。在本发明中，发明人先是用携带有抗生素抗性基因和报告基因的慢病毒载体转染人胚肾细胞，获得真核表达抗生素抗性基因和报告基因的假慢病毒颗粒，然后再用上述假慢病毒颗粒感染人肺癌细胞HU99，经筛选得到染色体整合型、可稳定表达抗生素抗性基因和报告基因的人肺癌细胞系。如本发明所用，抗生素抗性基因和其对应的抗生素构成一个筛选体系。利用抗生素抗性基因进行细胞转化，利用含有其对应抗生素的培养基筛选出那些转化成功的细胞。 本发明所使用的抗生素抗性的选择标记基因可以是嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、 氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因和新霉素抗性基因中的一种或多种的组合，优选为嘌呤霉素抗性基因。这些抗性基因与其对应的抗生素构成各自的筛选体系。如本发明所用，报告基因是一种编码可被快速检测的蛋白质或酶，且不依赖于外界筛选压力(如抗生素、除草剂)的基因。本发明所使用的报告基因是氯霉素乙酰基转移酶基因、人生长激素基因、分泌型碱性磷酸酶基因、绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、葡萄糖醛酸酶基因和半乳糖苷酶基因中的一种或多种的组合，优选为绿色荧光蛋白(GFP)基因， 特别优选为增强绿色荧光蛋白(eGFP)基因，后者的赖氨酸79被精氨酸替代，可有效延缓荧光淬灭时间，增加荧光的表达强度，大大提高了检测的灵敏度。本发明的用慢病毒载体感染的方法获得的高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定的人肺癌细胞系H1299-G具有持续表达高荧光强度能力，其荧光强度不会随肺癌细胞的连续传代而丢失；荧光基因的整合和表达不影响肺癌细胞的主要生物学性状，为理想的荧光示踪肺癌细胞模型。特别是，本发明人还^(喜地发现该细胞株不仅在表达外源基因后其生物学性状没有发生改变，而且还对核酸类、小分子类、单克隆抗体类等多种肺癌药物反应敏感，其中尤其是对单克隆抗体肺癌药物反应敏感，故其可用于各种肺癌药物的高通量筛选。本发明所述的高通量系统筛选是指在标记基因表达的前提下，对报告基因的表达强度、细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡等多个参数进行筛选；特别优选为对细胞增殖参数进行筛选。以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂通常按照常规条件，如[美]SambrooLJ等著；黄培堂等译，分子克隆试验指南(第三版)(北京科学出版社2002)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例1包装假慢病毒颗粒1、慢病毒包装质粒(Lentivirual vector)采用慢病毒载体系统(上海吉凯基因化学技术有限公司)。该病毒包装系统由GV225 (图1) ,pHelperl. 0 (图2)、pHelper 2.0( 3)。其中GV225 (载体成分)含有GFP基因和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，由mU6启动子驱动；pHelper 1. 0含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper2. 0含有单纯疱疹来源的VSV-G基因，提供病毒包装所要的包膜蛋白。2、质粒DNA的扩增质粒GV225、pHelper 1. 0和pHelper 2. 0按常规方法转化大肠杆菌Dffia，用相应的抗生素筛选阳性克隆，用质粒抽提试剂盒Oiiagen公司)进行质粒 DNA抽提，所得质粒溶于除菌的TE溶液中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证抽提质粒 DNA 的 A260/A280 在 1. 8-2. 0 之间。3、慢病毒的包装与纯化转染前M小时，用胰蛋白酶(上海化学试剂公司)消化对数生长期的人胚肾细胞细胞(购自ATCC)，以含10 % FBS (上海微科生化试剂有限公司，Al 1-102)的DMEM完全培养基(Hyclone)调整细胞密度为1. 5X IO5细胞/ml，接种于6孔板，371，5%0)2培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前池，吸出原有培养基，加入1. 5ml新鲜的完全培养基。然后取20ug的GV225载体、15ug的pHelper 1. 0载体和IOug的pHelper 2. 0载体，与相应体积的Opti-MEM(Invitrogen)混合均勻， 调整总体积为2. 5mL，在室温下温育5分钟。取IOOuL Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 试剂在另一试管中与2.4mL的Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。然后将稀释后的 DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，在室温下温育20分钟。将上述的DNA与 Lipofectamine 2000混合液转移至准备好的细胞的培养液中，混勻，于37°C，在5% 的(X)2细胞培养箱中培养。培养8小时换新鲜的含10% FBS的细胞培养基，继续培养48小时，收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩(工艺条件见表1)慢病毒。表1慢病毒纯化工艺条件
权利要求
1.一种可表达慢病毒载体携带的抗生素抗性基因和报告基因的人肺癌细胞株。
2.权利要求1的人肺癌细胞株，其特征在于，所述人肺癌细胞株可用于筛选治疗或者预防肺癌的药物。
3.权利要求1或2的人肺癌细胞株，其特征在于，其可由如下方法制得(1)用携带有抗生素抗性基因和报告基因的慢病毒载体转染人胚肾细胞，获得真核表达抗生素抗性基因和报告基因的假慢病毒颗粒；(2)将(1)中得到的假慢病毒颗粒感染人肺癌Η1299细胞，经抗生素筛选得到。
4.权利要求3的人肺癌细胞株，其中所述慢病毒载体为HIV-I载体系统。
5.权利要求3的人肺癌细胞株，其中所述抗生素为嘌呤霉素。
6.权利要求3的人肺癌细胞株，其中所述报告基因为eGFP。
7.权利要求3的人肺癌细胞株，其中所述人肺癌细胞株为人肺癌H1299细胞。
8.权利要求3的人肺癌细胞株，其中所述治疗或者预防肺癌的药物为单克隆抗体或核糖核酸。
9.一种制备可表达慢病毒载体携带的抗生素抗性基因和报告基因的人肺癌细胞株的方法，包括如下步骤(1)用携带有抗生素抗性基因和报告基因的慢病毒载体转染人胚肾细胞，获得真核表达抗生素抗性基因和报告基因的假慢病毒颗粒；(2)将(1)中得到的假慢病毒颗粒感染人肺癌Η1299细胞，经抗生素筛选得到。
10.权利要求9的方法，其中所述慢病毒载体为HIV-I载体系统。
11.权利要求9的方法，其中所述抗生素为嘌呤霉素。
12.权利要求9的方法，其中所述报告基因为eGFP。
13.权利要求9的方法，其中所述人肺癌细胞株为人肺癌H1299细胞。
全文摘要
本发明属于细胞生物学领域，公开了一种人肺癌细胞株；本发明还公开了该细胞株的构建方法及用途。所述的人肺癌细胞株具有高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定且对肺癌药物敏感的特点，是一种理想的研究肺癌药物筛选的模型。
文档编号C12N5/10GK102321587SQ201110245360
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者曹跃琼, 朱向莹, 杨松, 翁仕强, 谢胜华 申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司