专利名称：高产聚-β-羟基丁酸的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)PX-95菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术医学及生活领域，尤其涉及一株高产聚-β-羟基丁酸(PHB) 的苏云金芽孢杆菌及其用途。
背景技术：
伴随生产力的极大发展，塑料行业发展迅猛，由于其成本低、使用方便、易发展新的性能等特点已经深入到社会生活的各个方面。但就目前所使用的塑料而言，都是不可降解的、一次性的，在自然环境中降解的速度非常缓慢，通常需要20(Γ400年。为解决“白色污染”问题，国务院办公厅下发了《关于限制生产销售使用塑料购袋的通知》。自2008年6月 1日起，在超市、商场、集贸市场等商品零售场所实行塑料购物袋有偿使用制度，一律不得免费提供塑料购物袋。但调查表明，在“限制”执行的初始阶段，塑料袋的使用有所下降，而后又有所反弹，“白色污染”仍是有增无减，因此要从根本上解决污染问题，就要从塑料的可降解性方面着手。生物可降解塑料是指在使用过程中能保持与普通不降解塑料相似的力学强度和材料性能，使用后在自然环境中通过微生物的作用，在一定时间内可以降解成co2、H2O或其它无毒副产物的聚合物。一般分为三类①微生物合成型(如聚羟基脂肪酸酯)、②天然高分子型(如淀粉、纤维素、木质素和甲壳素等)和③合成高分子型(如聚乳酸、聚乙烯醇、聚丁二酸等)。其中微生物合成的聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)正是在这种情况下发展起来的一类高分子材料，微生物发酵生产有产量高、周期短、污染小、可循环等优点，具有比其它生物可降解塑料更大的发展潜力。目前，微生物合成出的PHA约有40种， 聚- β -羟基丁酸(PHB)是其中的典型代表。聚- β -羟基丁酸(？017-0-1^(11~0巧13肚7仪切，？冊)是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物(分子量50000-1000000)。作为微生物合成的可降解材料，PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质外，还具有一般化学合成高分子所没有的性质如光学活性、低透氧性、抗紫外辐射、生物可降解性、生物相容性、压电性和抗凝血性等，在工业、农业、环保、食品、医药等领域具有十分广阔的应用前景。如在医疗领域，PHB可以作为药物基质植入人体，以控制药物的释放且最终降解产物为β-羟基丁酸， 没有任何毒副作用。因此，国外的许多公司和科研机构纷纷开展可降解塑料的研发工作。但是由于其生产菌的产量不高，生产菌在生长过程中所消耗的原料价格较高，天然产物的机械性能差等缺点影响了其使用。近年来，有大量的学者对此进行研究并取得了很大的进展。目前，降低PHB生产成本主要途径有两条一是通过微生物菌种培育如菌株筛选、大肠杆菌重组技术、诱变等提高菌体中PHB的含量，从而使提取PHB成本降低；二是通过降低培养基原料的成本，使PHB生产成本降低
发明内容
为了解决生产菌的产量不高的技术缺陷，本发明的一个目的是提供一株高产聚-β -羟基丁酸(PHB)苏云金芽孢杆菌UaciBm thuringiensis) !-^菌株，本发明的另外一个目的是提供采用上述菌株制备聚-β -羟基丁酸的方法。为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
高产聚-β -羟基丁酸的苏云金芽孢杆菌(Macillus thuringiensis )PX_95菌株，该菌株保藏编号为；CCTCC NO: M2011298，保藏地为中国典型培养物保藏中心，保藏日为2011 年8月24日。本发明所涉及的苏云金芽孢杆菌(Macillus thuringiensis) !-^菌株菌落扁平呈白色，无光泽，表面较粗糙；革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，有芽孢，芽孢囊无明显膨胀，菌体大小约为(1. 1-1.2) X (3.2-5.5) μ m ；衣鞘薄而无色，有粘性，游离的单菌体常附在外边，侧生鞭毛，单菌能活跃运动；异染颗粒有且较大，占菌体的1/3，菌体内PHB颗粒较多，有的占菌体的3/4。本发明所涉及的苏云金芽孢杆菌UaciBm Aariz^im1Si1S)PX_95菌株筛选自花生地土壤。采用梯度稀释法获得纯菌种，根据形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列及扩增^jrB基因的方法鉴定为苏云金芽孢杆菌UaciBm thuringiensis、。16S rDNA电泳和测序分析结果表明，其长度为1398 bp，与苏云金芽孢杆菌UaciBm thuringiensis^kl 蜡样芽孢杆菌UaciBm ce/^As)均具有高度同源性(达99%，)，进一步采用扩增gyr BCDNA 促旋酶B亚单位)基因的方法将其鉴定为苏云金芽孢杆菌(feciBm thuringiensis),该菌株的16S rDNA基因序列已在GeneBank的登录，登录号为JN182235。为了实现上述第二个目的，本发明采用了以下的技术方案
上述的苏云金芽孢杆菌(Mcillus thuringiensis ) PX-95菌株用于发酵生产聚-β-羟基丁酸。一种聚-β-羟基丁酸的生产方法，该方法包括以下的步骤
1)将冷冻保藏的苏云金芽孢杆菌(Macillusthuringiensis) PX-95菌株接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，活化培养；
2)取2 IOmL转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基，相同条件培养作种子液；
3)再以洲 10%的接种量接入液体发酵培养基，在温度25 34 °C，摇床速度160 200 r/min,起始pH为7. 5 8. 0的条件下培养45 50 h，即可得到含PHB的菌体的发酵液。本发明PX-95菌株具有高产聚-β-羟基丁酸(PHB)、生长速度快、容易培养等多种优良特性。通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，聚-β-羟基丁酸产量最高可达10 g/ L以上，菌体干重达13 g/L 15 g/L，PHB含量约占菌体干重的66 % 76 %，属于高产PHB 的菌株。因此，本发明提供的菌株可用于聚- β -羟基丁酸(PHB)工业化生产菌株。
图1为苏云金芽孢杆菌ΡΧ-95菌株在显微镜下菌体形态特征(100Χ)。图2为苏云金芽孢杆菌ΡΧ-95菌株在显微镜下芽孢(右)形态特征(100Χ)。图3为基于16s rDNA基因序列建立的芽孢杆菌属系统发育树。图4为苏云金芽孢杆菌PX-95菌体中提取纯化制备的PHB粉末。
图5为苏云金芽孢杆菌PX-95菌体中提取纯化制备的PHB薄膜。图6为苏云金芽孢杆菌PX-95菌体中提取的PHB紫外吸收光谱图。图7为苏云金芽孢杆菌PX-95菌体中提取的PHB核磁碳谱。图8为苏云金芽孢杆菌PX-95菌体中提取的PHB氢(右)谱图。生物材料保藏说明
苏云金芽孢杆菌UaciBm thuringiensis) PX-95菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，保藏时间 2011 年 8 月 24 日，保藏号为CCTCC NO: M2011298。
具体实施例方式下面结合附图对本发明具体实施方式
做一个详细的说明。实施例1高产聚- β -羟基丁酸(PHB)苏云金芽孢杆菌ΡΧ-95菌株的分离筛选
(一)培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L， PH7-7.2;用于菌种分离；
牛肉膏蛋白胨液体培养基牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L, pH7_7. 2 ； 液体筛选培养基蔗糖 10 g/L、牛肉膏 5 g/L、MgSO4. 7H20 0.2 g/L、CaCl2O. 05 g/ L、FeCl3 0. 01 g/L、K2HPO4 0. 04 g/L、KH2PO4 0. 03 g/L、NaH2PO4. 2H20 0. 05 g/L、H3BO3 0. 005 g/L, pH7. 8 ；
液体发酵培养基蔗糖 50 g/L、牛肉膏 20 g/L、MgSO4. 7H20 0.2 g/L、CaCl2O. 05 g/ L、FeCl3 0. 01 g/L、K2HPO4 0. 04 g/L、KH2PO4 0. 03 g/L、NaH2PO4. 2H20 0. 05 g/L、H3BO3 0.005 g/L，pH7.8。(二)方法
采用梯度稀释分离法。取土样1.0 g，加9 mL无菌水稀释，80 °C水浴15 min后，进行 10_"10_4梯度稀释，取10_2浓度稀释液100 μ L涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，28 °C培养M h。挑取圆形乳白色单菌落，进一步分离、纯化后，获得纯菌株，编号保存。用苏丹黑染色法初步定性筛选产生PHB菌株，挑取初筛获得的纯菌株单菌落接种于150 mL锥形瓶(含30 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基)中，在温度30 °C，摇床速度180 r/ min，培养12 h用作发酵种子。按6 %比例转接于250 mL锥形瓶(含50 mL液体筛选培养基)中，按上述条件培养48 h用于PHB的定量分析。综合比较，筛选高产PHB原始菌株。菌液与50 %甘油1:1于-20 °C冰箱中保存，备用。用牛肉膏蛋白胨斜面培养基进行菌种活化传代，菌株每4 w转接一次；菌种使用之前需先活化。对选出的菌株依据形态学、生理生化和16S rDNA基因序列等鉴定。PX-95菌株菌落扁平呈白色，无光泽，表面较粗糙。革兰氏染色呈阳性，菌体杆状， 有芽孢，芽孢囊无明显膨胀，菌体大小约为(1. 1-1.2) X (3.2-5.5) ym (附图1、图2)；衣鞘薄而无色，有粘性，游离的单菌体常附在外边，侧生鞭毛，单菌能活跃运动；异染颗粒有且较大，占菌体的1/3，菌体内PHB颗粒较多，有的占菌体的3/4。16S rDNA电泳和测序分析结果表明，其长度为1398 bp,与苏云金芽孢杆菌 (.Bacillus thuringiensis)以及蜡样芽孢杆菌UaciB^s carets)均具有高度同源性(达99%，附图3)，进一步采用扩增gyr B (DNA促旋酶B亚单位)基因的方法将其鉴定为苏云金芽孢杆菌UaciB^s iAtfri/^ieasis )，该菌株的16S rDNA序列已在GeneBank的登录，登录号为JN182235。该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上，30°C 10 d条件下，经15代连续培养，其培养特征、形态特征和PHB产量均无明显变化，表明该菌株的生物性状基本稳定。实施例2苏云金芽孢杆菌UaciB^s iAtfri/^ieasis) PX-95菌株用于PHB合成的方法
(一)菌株苏云金芽孢杆菌UaciB^sthuringiensis) Vl-^b菌株
(二)方法
保存于的-20 °C下的甘油菌1.5mL接入牛肉膏蛋白胨液体培养基(50 mL),30 °C摇床 180 r/min培养9. 5 h(0D600 0. 6)活化后，取5 mL转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基(100 mL)，相同条件培养1.5 h (0D600 0.6)作种子液；再以6 %的接种量接入液体发酵培养液，在30 °C，摇床速度180 r/min，起始pH为7. 8的条件下培养48 h。即可得到含菌体干重约13 g/L 15 g/L，PHB 8 g/L 10 g/L (干重)的发酵液，PHB含量约占菌体干重的66 % 76 %。PHB提取和定性分析将摇瓶所得发酵液12000 r/min离心5 min,收集菌体。无菌水洗涤3次后再用丙酮、无水乙醇充分洗涤1次，之后加氯仿于60 °C下抽提PHB 60 min, 过滤后将PHB提取液用无水乙醇沉淀法可得到白色沉淀，即为PHB粗品，然后再用丙酮、无水乙醇各清洗3次，再用热氯仿溶解，最后60 ！烘干，可得白色粉末或薄膜状PHB(附图4、 图5)。PHB在浓硫酸作用下解聚成巴豆酸，在200 nm^280 nm范围内进行紫外吸收光谱扫描分析初步定性，提取物的浓硫酸处理产物在235 nm处有最大吸收峰值，这与文献报道的 PHB标准品降解和脱水产物-巴豆酸(反-2- 丁烯酸)的最大吸收峰值完全一致(附图6)； 进一步定性分析采用核磁共振法。从苏云金芽孢杆菌PX-95菌体中提取所得的PHB经溶剂氘代氯仿(CDCl3)溶解进行核磁共振分析，碳谱(14C-NMR)和氢谱(1H-NMR)图如图7、图8所不。从碳谱(14C-NMR)图碳骨架结构分析可知在76. 705 ppm、77. 024 ppm和77. 343 ppm处的吸收峰由溶剂⑶Cl3中的C元素产生，此外的4个吸收峰分别位于19. 759 ppm、 40.790 ppm、67. 612 ppm和169.143 ppm，它们分别代表聚β -羟基丁酸中的4组碳原子， 相应的分别是一CH3, -CH2, — CH, 一COO—基团中的碳原子。从氢谱(1H-NMR)图可知在7. 270 ppm处的吸收峰是由溶剂⑶Cl3的D元素产生， 而聚β-羟基丁酸中的3个基团一 CH3, -CH2, 一CH中的氢原子的吸收峰分别为(1.245 ppm> 1. 269 ppm> 1. 285 ppm), (2. 448 ppm、2· 463 ppm、2· 487 ppm、2· 502 ppm、2. 581 ppm、 2. 599 ppm、2. 620 ppm、2. 638 ppm) ； (5. 235 ppm、5. 251 ppm、5. 267 ppm、5. 283 ppm、5. 299 ppm),与PHB标准品核磁共振图谱一致。碳元素和氢元素数目及元素迁移情况与一 [―0—CH (CH3) —CH2-CO—]—n结构相一致，并且图谱整齐无异质杂峰出现(附图7、图8)，表明从苏云金芽孢杆菌PX-95菌株提取所得的PHB纯度很高。
权利要求
1.高产聚-β-羟基丁酸的苏云金芽孢杆菌、BaciIlus thuringiensis) PX-95菌株， 该菌株保藏编号为；CCTCC NO: M201U98，保藏地为中国典型培养物保藏中心，保藏日为 2011年8月24日。
2.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌UaciBmthuringiensis) !-^菌株用于发酵生产聚-β-羟基丁酸。
3.—种聚羟基丁酸的生产方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)将冷冻保藏的苏云金芽孢杆菌(Macillusthuringiensis) PX-95菌株接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，活化培养；2)取2 IOmL转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基，相同条件培养作种子液；3)再以洲 10%的接种量接入液体发酵培养基，在温度25 34 °C，摇床速度160 200 r/min，起始pH为7. 5 8. 0的条件下培养45 50 h，即可得到含PHB的菌体的发酵液。
全文摘要
本发明属于生物技术医学及生活领域，尤其涉及一株高产聚-β-羟基丁酸(PHB)的苏云金芽孢杆菌及其用途。高产聚-β-羟基丁酸的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)PX-95菌株，该菌株保藏编号为；CCTCCNO:M2011298，保藏地为中国典型培养物保藏中心，保藏日为2011年8月24日。本发明PX-95菌株具有高产聚-β-羟基丁酸(PHB)、生长速度快、容易培养等多种优良特性。通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，聚-β-羟基丁酸产量最高可达10g/L以上，菌体干重达13g/L~15g/L，PHB含量约占菌体干重的66%~76%，属于高产PHB的菌株。
文档编号C12R1/07GK102373166SQ201110259510
公开日2012年3月14日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者宋迤明, 董夏梦, 蒋冬花 申请人:浙江师范大学