专利名称：一种聚合酶链反应试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种分子生物学试剂及其制备方法，特别是涉及一种聚合酶链反应试剂及其制备方法。
背景技术：
聚合酶链反应 (PCR)是一种简单、专一、快速、灵敏地扩增特定DNA的方法，其反应液由十几种试剂组成。在PCR技术建立之初，各种PCR试剂成分均被制备为几至几十倍浓度的储存液，使用时按照需要进行配制。这种试剂盒可随意改变反应液组成成分的配比，适合用于探索PCR反应液的最佳配比。但其缺点也很明显:操作繁琐、污染几率大、实验误差大等。为了克服这些缺点，有研究者(中国专利授权号CN100393883C)制备了将PCR主要反应成分预混的通用全预混PCR反应混合液，但是这种PCR预混试剂需要在_20°C条件下才能长期保存，对运输和储存的要求均高，另外液体组分在储存过程中容易挥发，使聚合酶链反应的稳定性降低。针对这些问题，有研究者(中国专利授权号CN1110572C)进一步将PCR全预混反应液制备成冷冻干燥制剂，这种方法虽然延长了保存期，但却增加了冷冻干燥制备步骤，对生产的要求较高并可能造成酶在冷干过程中的损失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的聚合酶链反应(PCR)试剂及其制备方法，该方法操作简单，对生产条件要求低。利用该方法制备的PCR反应试剂对运输及储存条件的要求低，能在低于4°C的温度下储存较长时间。该方法能够为PCR反应提供一种操作简单、配制快速、检测结果稳定可靠的PCR试剂，从而实现快速检测的目的。本发明提供一种聚合酶链反应试剂，其组分是:PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶，其特征在于，该反应试剂通过下述方法获得:将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul IOOul/反应分装至反应管中，分装体积中预留出模板DNA体积，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2_5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul，得到分装管；将分装管开盖静置于合适的无菌条件下在15°C 50°C的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时 72小时。本发明还提供一种聚合酶链反应试剂的制备方法，其组分包括:PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶，所述制备方法包括以下步骤:(I)将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul IOOul/反应分装至反应管中；分装体积中预留出模板DNA体积，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2-5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul ；(2)将步骤(I)中制备得到的试剂开盖静置于合适的无菌条件下，在15°C 50°C的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时 72小时；(3)任选地，将步骤⑵获得的干燥试剂密封后，置于4°C或低于4°C的温度条件下储存。
本发明中所述的合适的无菌条件为GMP十万级洁净环境中或者与之相当的环境，所述的合理浓度是指各组分混匀后，加入去离子水至分装体积后，各组分的浓度，为分装后的浓度。在后续PCR反应前，加入去离子水和模板后(任选地加入其它成分后)，各组分的浓度为为PCR反应时的合适浓度。本发明中所述的GMP十万级洁净环境，具体参数要求如I表中所示；100000级区域一般控制温度为18 28°C，相对湿度为50 65%，生产工艺对温度和湿度有特殊要求时，应根据工艺要求确定。其他指标参见《药品生产质量管理规范(2010修订)》和《GB50457-2008医药工业洁净厂房设计规范》中的要求。表权利要求
1.一种聚合酶链反应试剂，其组分是=PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶， 其特征在于，该反应试剂通过下述方法获得:将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul IOOul/反应分装至反应管中，分装体积中预留出模板DNA体积，得到分装管，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2_5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul ;将分装管开盖静置于合适的无菌条件下在15°C 50°C的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时 72小时。
2.一种聚合酶链反应试剂的制备方法，其组分包括:PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶，所述制备方法包括以下步骤: (1)将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul IOOul/反应分装至反应管中；分装体积中预留出模板DNA体积，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2-5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul ； (2)将步骤(I)中制备得到的试剂开盖静置于合适的无菌条件下，在15°C 50°C的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时 72小时； (3)任选地，将步骤(2)获得的干燥试剂密封后，置于4°C或低于4°C的温度条件下储存。
3.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的合适的无菌条件为GMP十万级洁净环境中或者与之等同的环境，所述的合理浓度是分装浓度，该浓度在经过干燥处理的分装管加入合适体积的去离子水和模板后各组分的浓度达到PCR反应时的合适浓度。
4.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的反应试剂中还含有荧光探针，任选地，反应缓冲液中还含有明胶。
5.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的DNA聚合酶是HotStart DNA聚合酶，Mg2+来自MgCl2, PCR反应缓冲液中包含Tris-HCl、KCl。
6.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述组分的浓度分别为:引物10 IOOOnM,优选50 800nM，进一步优选100 500nM，特别优选300 500nM ；dNTPs 100 500uM，优选 150 300uM，进一步优选 200 250uM ；Mg2+l 10mM，优选1.5 8mM，进一步优选2 6mM，特别优选2.5 4mM ;PCR反应缓冲液中Tris-HCl 10 25mM ；KC1 20 lOOmM，优选30 70mM，进一步优选50 55mM，最优选的KCl浓度为50mM ；如果有，所述的荧光探针浓度为100 500nM，优选150 400nM，进一步优选200 300nM ；如果有，所述的DNA聚合酶的量为0.1 5U ;如果有，明胶的浓度为0.001% ;缓冲液的pH范围是8.1 8.8，优选的pH值为8.3。
7.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的引物是根据目标检测基因设计合成的寡核苷酸或其衍生物，如果有，所述的荧光探针是根据目标检测基因设计合成的荧光修饰的寡核苷酸或其衍生物。
8.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的所述引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或者SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，如果有的话，其中所述荧光探针的序列如SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示。
9.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的干燥条件为:温度37°C，湿度20% 30%，其中干燥处理的时间为2小时 72小时。
10.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其干燥条件为:在37°C的温度条件下，干燥7小时。
11.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂的使用方法，包括以下步骤:将权利要求1的聚合酶链反应试剂取出，在反应管中加入无菌去离子水至分装体积，如果需要，加入DNA聚合酶，充分溶解、混匀后加入预留体积的模板DNA，反应体系的总体积为分装体积与模板DNA体积之和；然后进行PCR 反应。
全文摘要
本发明涉及一种聚合酶链反应试剂及其制备方法，该PCR试剂的组分包括引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水等成分，可包含或不包含DNA聚合酶，任选地，其所述的试剂还可以包含荧光探针，该方法将上述组分混匀后，分装至单个PCR反应管中，将分装管开盖静置于合适的无菌环境中，干燥，去除水份，获得所述的PCR试剂。该方法操作简单，对生产条件要求低，制备的PCR试剂对运输及储存条件的要求低，可在低于4℃的条件下保存4～6个月。该方法能够为PCR反应提供一种操作简单、配制快速、检测结果稳定可靠的PCR试剂，从而实现快速检测的目的。
文档编号C12N15/10GK103088014SQ20111034918
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者刘刚, 陈忠, 侯萌萌, 秦艳芳, 吴晓东 申请人:北京金菩嘉医疗科技有限公司