专利名称：一种发酵制柠檬酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵制柠檬酸的方法。
背景技术：
柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。目前的柠檬酸发酵采取的主流技术是二级液体深层发酵技术，在发酵过程中需要通入较大量的压缩空气(O. 18-0. 3MPa)、种子罐和发酵罐的罐压控制在0. 05-0. IMPa之间以供应黑曲霉种子的生长和发酵产酸。因黑曲霉在生长和产酸阶段对氧气较为敏感，在溶氧不足或缺氧的条件下，黑曲霉菌体的代谢途径将发生改变，抑制而且是不可逆的影响产酸速率及产酸率。而柠檬酸发酵过程中由于柠檬酸发酵液的性质导致氧传递系数不高。因此在柠檬酸发酵过程中需要通入大量的压缩空气，以供应黑曲霉种子柠檬酸发酵生产柠檬酸。由此导致在柠檬酸发酵过程中因供氧而增加的能耗占生产成本的很大比例，而发酵尾气直接排放到空气中也是一种能源浪费。因此，迫切需要开发一种能够有效利用柠檬酸发酵过程中所产生的尾气，并能够降低柠檬酸生成成本的柠檬酸发酵的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的发酵制柠檬酸的方法。采用本发明的方法不仅能够有效利用柠檬酸发酵过程中所产生的尾气，而且还大大降低了因供氧而增加柠檬酸发酵的能耗，从而降低柠檬酸的生产成本。本发明的发明人意外地发现，将柠檬酸种子培养过程中得到尾气以及柠檬酸发酵培养过程中得到尾气，替代柠檬酸发酵过程中通常使用的空气，不仅不会对柠檬酸的发酵水平带来不利的影响，反而有利于提高柠檬酸发酵的产酸率，从而完成本发明。即本发明提供一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入第一气体的条件下， 将柠檬酸发酵菌接入到种子罐内的种子培养基中进行种子培养后得到种子培养液和第一尾气，在通入第二气体的条件下，将种子培养液接入到发酵培养罐内的发酵培养基中进行发酵培养，得到柠檬酸发酵液和第二尾气，其中，所述第一气体为空气，部分或全部所述第二气体为所述第一尾气和/或第二尾气，且剩余部分所述第二气体为空气。根据本发明的发酵制柠檬酸的方法，不仅能够减少空气的用量，解决尾气的排放问题，而且由于上述尾气压力在0. 05-0. IMPa的范围内，该尾气还具有非常可观的能量，被直接排放到空气中是一种非常大的能量浪费，将其进行稍微的压缩后，就可以达到发酵培养的压力要求，因此与现有技术在柠檬酸发酵过程中使用空气相比，还可以大大降低因压缩气体而增加的能耗。另外，通过使用该尾气，还可以提高柠檬酸发酵的产酸率。
具体实施方式
本发明提供一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入第一气体的条件下，将柠檬酸发酵菌接入到种子罐内的种子培养基中进行种子培养后得到种子培养液和第一尾气，在通入第二气体的条件下，将种子培养液接入到发酵培养罐内的发酵培养基中进行发酵培养，得到柠檬酸发酵液和第二尾气，其中，所述第一气体为空气，部分或全部所述第二气体为所述第一尾气和/或第二尾气，且剩余部分所述第二气体为空气。根据本发明的方法，所述部分或全部所述第二气体为所述第一尾气和/或第二尾气，且剩余部分所述第二气体为空气是指可以将第一尾气和/或第二尾气全部替代在发酵培养过程中需要通入的空气进行发酵；也可以将第一尾气和/或第二尾气部分替代在发酵培养过程中不同阶段需要通入的空气进行发酵；还可以是将第一尾气和/或第二尾气和空气进行混合后替代在发酵培养过程中需要通入的空气进行发酵。优选将第一尾气和/ 或第二尾气部分替代在发酵培养过程中不同阶段需要通入的空气进行发酵。即，在发酵培养的过程中的某一个或多个阶段，将第一尾气和/或第二尾气替代在该阶段需要通入的空气。根据本发明的方法，以通入的第二气体的总量为基准，所述第一尾气和第二尾气的总量为70-100体积％ ；优选所述第一尾气和第二尾气的总量为70-85体积％。根据本发明的方法，该方法可以有多种实施方式，例如可以是在经过种子培养、发酵培养得到柠檬酸发酵液的过程中，将种子培养得到第一尾气以及发酵培养前期得到的第二尾气用于发酵培养后期进行发酵。即通入第二气体的一种实施方式为在发酵培养的前期，通入空气，在发酵培养的后期，通入第一尾气和/或第二尾气。所述发酵培养前期、后期可以根据得到的第一尾气和第二尾气的量来适当地选择。所述发酵培养的前期为从开始发酵到发酵培养tl时间之间的时间段，tl与发酵培养总时间t2的比例为1 3-7 ；优选tl 与发酵培养总时间t2的比例为1 3.5-6。所述发酵培养的后期为发酵培养tl时间到发酵培养结束之间的时间段。例如，所述发酵培养前期为8-16小时，发酵培养的总时间可以为50-65小时。另外，也可以是将种子培养得到第一尾气以及发酵培养得到的第二尾气收集后，替代下次柠檬酸发酵培养中需要通入的空气。根据本发明的方法，一般情况下，所述第一尾气和/或第二尾气的氧气的含量为 20. 6-20. 9体积％，所述第二气体中的二氧化碳的含量为0. 035-0. 038体积％。优选的情况下，所述第二气体中的二氧化碳的含量为0. 037-0. 038体积％。根据本发明的方法，由于种子培养得到的第一尾气和发酵培养得到的第二尾气中含有微量的菌体，为了降低尾气中的菌体对压缩机设备的伤害，优选将所述第一尾气和/ 或第二尾气中的菌体进行处理，以使所述第一尾气和/或第二尾气中的菌体的含量不超过 IOwppm0上述将所述第一尾气和/或第二尾气中的菌体进行处理的方法为本领域所公知， 只要能够有效地除去所述第一尾气和/或第二尾气中的菌体即可。例如可以将所述第一尾气和/或第二尾气经过滤网后再经过过滤器后得到菌体的含量不超过IOwppm的第一尾气和/或第二尾气。所述滤网的孔径可以为0. 5-2um，该滤网可以通过商购获得。例如购于石家庄东力公司的滤网。所述过滤器为空气过滤器，也可以通过商购获得，例如购于上海环升公司的365型号的空气过滤器。根据本发明的方法，该方法还包括将所述第一尾气和/或第二尾气经过二次压缩后得到压力为0. 18-0. 3MPa的压缩气体。由于所述第一尾气和第二尾气的压力在 0. 05-0. IMI^a之间，将第一尾气和/或第二尾气压缩到0. 18-0. 3ΜΙ^的能耗要远远低于将常压空气压缩到0. 18-0.3ΜΙ^的能耗。因此，能够大大降低因供氧而增加柠檬酸发酵的能耗。根据本发明的方法，发酵培养罐内的压力可以为0.06-0. IMPa，所述第二气体的通气量可以为0. 1-0. 3体积(体积·分钟)；优选的情况下，发酵培养罐内的压力为 0. 08-0. IMPa，所述第二气体的通气量为0. 2-0. 3体积(体积·分钟)。根据本发明的方法，所述种子罐内的压力可以为0. 06-0. IMPa,所述第一气体的通气量可以为0. 2-0. 5体积(体积·分钟)；优选的情况下，所述种子罐内的压力为 0. 06-0. 08MPa,所述第一气体的通气量为0. 3-0. 4体积(体积·分钟)。术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(ν/ν ·π η)，例如通气比为1 0. 1-1，简称通气量为0. 01-1体积(体积 分钟)。在本发明中，所述种子培养基可以为本领域所公知的各种柠檬酸种子培养基。优选的情况下，使用淀粉质原料酶解液，以该淀粉质原料酶解液的总量为基准，淀粉质原料酶解液中的总糖为8-14重量％、以氮元素计，氮源为0. 1-0. 5重量％ ；优选地，该淀粉质原料酶解液中的总糖为9-12重量％、氮源为0. 1-0. 25重量％。根据需要，还可以向种子培养基中添加补充氮源。所述补充氮源的添加量可以为培养基总重量的0.01-0. 05重量％。所述补充氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述补充氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵等中的一种或多种。上述淀粉质原料酶解液可以通过将水、粉碎后的淀粉质原料以及淀粉酶混合酶解而得到。具体地，以每克粉碎后的淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为15-40个酶活力单位，所述水的用量为1-6克；优选地，所述淀粉酶的用量为20-30个酶活力单位，所述水的用量为2-5克。本发明所述酶的酶活力单位的定义为在ρΗ值为6. 0、温度为70°C的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-115°C，更优选为90-95°C。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟， 更优选为100-120分钟。所述酶解的ρΗ值可以在很大范围内改变，优选为5. 0-7.0，更优选 PH 值为 5. 8-6. 2。淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。α-淀粉酶又称淀粉1，4_糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的 α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。β -淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4_糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6_糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、 拟内孢霉、红曲霉。异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。根据本发明，优选使用α -淀粉酶和/或异淀粉酶。根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或多种。优选地，所述含有淀粉的原料为玉米。 根据本发明，所述柠檬酸发酵菌可以为本领域所公知的柠檬酸发酵菌。具体地，可以为黑曲霉、酵母或细菌。优选地，所述柠檬酸发酵菌为黑曲霉。本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827 (上海工业微生物研究所)和黑曲霉TOl (天津工业微生物所)。根据本发明，在被接种至所述发酵培养基中之前，将所述发酵菌经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到所述发酵培养基中。发酵菌种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和PH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2. 0-2. 5、酸度 0. 5-2. 0%、菌球大小均勻、菌丝粗壮伸出时停止培养。上述种子培养的条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件还包括培养的温度可以为30-45°C，pH值可以为2-6，培养的时间可以为20-40小时；更优选的情况下， 培养的温度可以为34-38°C，pH值可以为2. 0-4. 5，所述培养的时间可以为22-30小时。在本发明的种子培养中，所述柠檬酸发酵菌的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每毫升种子培养基为基准，发酵菌的接种量为1 XIO5 1 X IO6个菌落形成单位。所述菌落形成单位的定义为将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在培养基平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。即每毫升菌液中含有的单细胞的数目。所述菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。根据本发明，所述将柠檬酸发酵菌接种至所述发酵培养基中进行发酵的条件可以在很大范围内改变，例如所发酵的条件可以包括培养的温度可以为30_42°C，pH值可以为 1-6，培养的时间可以为50-65小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括培养的温度可以为；34-39°C，pH值可以为1.5-3.0，所述培养的时间可以为51-60小时。所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。根据本发明，所述发酵培养基中各组分的含量可以在很大范围内改变。优选地，所述发酵培养基中碳源(糖)含量为13-21重量％，氮源含量为0. 06-0. 14重量％，磷源含量为0. 005-0. 07重量％，无机盐含量0. 1-2. 6重量％，水含量为77-86重量％。优选所述发酵培养基中总糖为13-18重量％，更优选发酵培养基中总糖为14-16 重量％。优选情况下，还可以根据需要向所述发酵培养基中添加补充氮源，所述补充氮源(如尿素)的添加量可以为发酵培养基总重量的0.01-0. 05重量％。根据本发明，所述补充氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述补充氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵等中的一种或多种。在本发明中的发酵培养中，所述柠檬酸发酵菌的接种量可以在很大范围内改变， 优选情况下，以每毫升发酵培养基为基准，发酵菌的接种量为1XIO4-I X IO5个菌落形成单位。下面通过实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明并不仅限于下述实施例。以下实施例中柠檬酸的酸度采用酸碱中和的方法测定。以下实施例中所使用的空气压缩机购于MAN-Turbo公司的单轴压缩机；以下实施例中所使用的滤网购于石家庄东力公司；以下实施例中所使用的过滤器购于上海环升公司的365型号。以下实施例中的玉米粉酶解液的制备方法为将55吨玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎产物。将粉碎后的产物与230m3自来水和淀粉酶(相当于每克粉碎的玉米使用25个酶活力单位的淀粉酶，诺维信公司，α-淀粉酶)混合均勻后，进入喷射器，在95°C、ρΗ为6. 0的条件下酶解100分钟后得到258m3酶解液。实施例11)向种子罐中投入^m3上述得到的酶解液后，对种子罐的种子培养基进行121°C 灭菌30分钟，降温到36°C接入黑曲霉种子，接种量为每毫升酶解液2X IO5个菌落形成单位，在温度36°C、通气量为0.3体积(体积 分钟)的空气(由第一压缩机(空气压缩机) 提供，压力0. 23MPa)，罐压0. IMPa的条件下培养27小时，得到培养成熟的种子液和第一尾气，将第一尾气通过带有滤网(滤网孔径为Ium)的管网，再通过过滤器后进入第二压缩机， 控制压缩后尾气的压力为0. 23MPa，并将压缩尾气存于储气罐中。2)将上述得到的酶解液向发酵罐中投入20m3，其余的210m3进行过滤后得到的 200m3酶解清液，将该酶解清液投入发酵罐中后，加入37. 5kg尿素。在80°C灭菌IOmin后降温到38°C，开搅拌、通气量为0.2体积(体积 分钟)的空气(所述空气压缩机提供，压力 0. 23MPa)，接入上述培养成熟的种子液，罐压控制在0. OSMPa进行发酵生产柠檬酸。来自发酵罐的第二尾气被引入步骤1)的带有滤网的管网中，通过过滤器后进入第二压缩机，控制压缩后尾气的压力为0. 23MPa，并将压缩尾气存于储气罐中。在发酵16小时时将发酵罐的进气改为由第二压缩机提供的压缩尾气，通气量为0. 2体积(体积 分钟)。发酵罐58小时糖耗尽停止发酵，得到柠檬酸发酵液，该柠檬酸发酵液的酸度、体积、压缩机电耗见表1。对比例1采用实施例1的方法进行，不同的是在发酵16小时时继续采用第一压缩机提供空气。发酵罐57小时糖耗尽停止发酵，得到柠檬酸发酵液和由第一尾气和第二尾气压缩得到的压缩尾气，该柠檬酸发酵液的酸度、体积、压缩机电耗(不包括压缩尾气所消耗的电能) 见表1。实施例21)向种子罐中投入^m3上述得到的酶解液后，对种子罐的种子培养基进行121°C 灭菌30分钟，降温到36°C接入黑曲霉种子，接种量为每毫升酶解液IO5个菌落形成单位，在温度36°C、通气量为0. 45体积(体积·分钟)的空气(由第一压缩机(空气压缩机)提供，压力0. 23MPa)，罐压0. IMPa的条件下培养27小时，得到培养成熟的种子液和第一尾气， 将第一尾气通过带有滤网(滤网孔径为0.5um)的管网，再通过过滤器后进入第二压缩机， 控制压缩后尾气的压力为0. 23MPa，并将压缩尾气存于储气罐中。2)将上述得到的酶解液向发酵罐中投入20m3，其余的210m3进行过滤后得到的 200m3酶解清液，将该酶解清液投入发酵罐中后，加入37. 5kg尿素。在80°C灭菌IOmin后降温到38°C，开搅拌、通气量为0. 25体积(体积·分钟)的压缩尾气(该压缩尾气为对比例1中得到的压缩尾气以及步骤1)中得到的压缩尾气，压力0. 23MPa)，接入培养成熟的种子液，罐压控制在0. OSMI^a进行发酵生产柠檬酸。来自发酵罐的第二尾气被引入带有滤网(滤网孔径为2um)的管网中，再通过过滤器后进入第二压缩机，控制压缩后尾气的压力为0.23MPa，并将压缩尾气存于储气罐中(用于下一次发酵培养)。发酵罐60小时糖耗尽停止发酵，得到柠檬酸发酵液，该柠檬酸发酵液的酸度、体积、压缩机电耗(包括对比例中压缩尾气所消耗的电能)见表1。实施例3采用实施例2的方法进行，不同的是步骤2)中开始通入压缩尾气的时间为发酵10 小时时。发酵罐56小时糖耗尽停止发酵，得到柠檬酸发酵液，该柠檬酸发酵液的酸度、体积、压缩机电耗(包括压缩种子培养所产生尾气所消耗的电能)见表1。实施例4采用实施例2的方法进行，不同的是步骤幻中通入的尾气为发酵培养得到的第二尾气。发酵罐59小时糖耗尽停止发酵，得到柠檬酸发酵液，该柠檬酸发酵液的酸度、体积、 压缩机电耗(包括压缩发酵培养所产生尾气所消耗的电能)见表1。表 权利要求
1.一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入第一气体的条件下，将柠檬酸发酵菌接入到种子罐内的种子培养基中进行种子培养后得到种子培养液和第一尾气，在通入第二气体的条件下，将种子培养液接入到发酵培养罐内的发酵培养基中进行发酵培养，得到柠檬酸发酵液和第二尾气，其特征在于，所述第一气体为空气，部分或全部所述第二气体为所述第一尾气和/或第二尾气，且剩余部分所述第二气体为空气。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以通入的第二气体的总量为基准，所述第一尾气和第二尾气的总量为70-100体积％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通入第二气体的方式为在发酵培养的前期， 通入空气，在发酵培养的后期，通入第一尾气和/或第二尾气。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述发酵培养的前期为从开始发酵到发酵培养 tl时间之间的时间段，tl与发酵培养总时间t2的比例为1 3-7 ；所述发酵培养的后期为发酵培养tl时间到发酵培养结束之间的时间段。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，第一尾气和/或第二尾气中的菌体的含量不超过lOwppm。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，发酵培养罐内的压力为 0. 06-0. IMPa，第二气体的通气量为0. 1-0. 3体积(体积·分钟)。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述发酵培养的条件包括以每毫升发酵培养基为基准，发酵菌的接种量为1 X IO4 1 X IO5个菌落形成单位，培养的温度为 30-42°C，pH值为1-6，培养的时间为50-65小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，种子罐内的压力为0.06-0. IMPa，第一气体的通气量为0. 2-0. 5体积(体积·分钟)。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其中，所述种子培养的条件包括以每毫升种子培养基为基准，发酵菌的接种量为1 X IO5 1 X IO6个菌落形成单位，培养的温度为30-45°C， pH值为2-6，培养的时间为20-40小时。
全文摘要
本发明提供一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入第一气体的条件下，将柠檬酸发酵菌接入到种子罐内的种子培养基中进行种子培养后得到种子培养液和第一尾气，在通入第二气体的条件下，将种子培养液接入到发酵培养罐内的发酵培养基中进行发酵培养，得到柠檬酸发酵液和第二尾气，其中，所述第一气体为空气，部分或全部所述第二气体为所述第一尾气和/或第二尾气，且剩余部分所述第二气体为空气。采用本发明的方法不仅能够有效利用柠檬酸发酵过程中所产生的尾气，而且还大大降低了因供氧而增加柠檬酸发酵的能耗，从而降低柠檬酸的生产成本。
文档编号C12P7/48GK102373243SQ20111034992
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者卢宗梅, 杨儒文, 满云, 章辉平, 童丽 申请人:中粮生物化学(安徽)股份有限公司