专利名称：用禽蛋生产人类干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及干细胞生物学领域，特别是涉及用禽蛋生产人类干细胞的方法。
技术背景
个体中的器官组织是由干细胞和非干细胞组成的，非干细胞是器官组织中的一类功能细胞，通常不能自我更新，因端粒缩短、DNA突变等原因造成死亡而数量减少时可由干细胞通过分化来补充；干细胞因细胞分化、DNA突变死亡等原因造成数量的减少，也可以通过提高自我更新率来补充。
干细胞，是在人体组织中的一类可以自我更新和具有多向分化成多种组织细胞的细胞，如造血干细胞、间充质干细胞等。个体包括大脑神经元细胞在内的所有体细胞，每天平均大约有的细胞会因DNA突变、端粒缩短、细胞中的垃圾累积等等问题而发生死亡掉，但同时也有等量的细胞新生，靠的就是多能成体干细胞的自我更新和多向分化这两种功能。
特别是近年来，日本科学家在人类的骨髓和皮肤中发现了一种接近于全能的成体多能干细胞，称缪斯细胞(Muse细胞)，它们能够分化成具有内脏中外胚层、神经外中胚层和内胚层特征的细胞。但是，成体多能干细胞在组织中数量很少(一般只占所有组织细胞的百万分之一)，分裂繁殖很慢，而且随个体年龄增长其数目会越来越少。
iPS 细胞(induction of pluripotent stem cells, iPS 细胞)是日本科学家山中伸弥通过基因技术把体细胞诱导转化的一种和胚胎干细胞性状相似的干细胞。iPS细胞注射到动物的囊胚会分化成组成个体的所有细胞。
一般来说，年轻人身体比较健康，可一到老年期，就会变得体弱多病，什么癌症、糖尿病、心脑血管等等的疾病接踵而来，以及个体中受损组织的再生障碍。究其原因就是成体多向干细胞本身越来越老、数量越来越少。当成体多能干细胞数量减少到一定程度时，油尽灯熄，我们就是这样衰老死亡的！因此，向人体内补充年轻的成体多能干细胞，可以提高器官组织因衰老和病理损伤的修复水平，具有祛病延年、甚至达到返老还童的效果。发明内容
本发明的目的是提供用禽蛋生产人类干细胞的方法，以解决此类细胞的大量需求问题。
按此目的提供的用禽蛋生产人类干细胞的方法，材料包括准备好的禽蛋和需要生产的人类干细胞等。其特征是操作时，先在禽蛋的上方将蛋壳开一个小口，用显微注射管吸取人类干细胞，注射到免疫系统发育成熟之前的任意发育期的禽蛋胚胎中。显微操作完毕，用一小片状物体盖住开口。然后将操作完毕的禽蛋按孵化的标准进行孵化或继续孵化。
利用禽蛋生产人类干细胞，无需像用哺乳动物胚胎生产人类干细胞那样需要进行宫内注射，因此具有成本低，成功率高和操作简单。
具体实施方式
本发明的目的是提供用禽蛋生产人类干细胞的方法，以解决此类细胞的大量需求问题。
按此目的提供的用禽蛋生产人类干细胞的方法，材料包括准备好的禽蛋和人类干细胞等。其特征是操作时，先在禽蛋的上方将蛋壳开一个小口，用显微注射管吸取人类干细胞，注射到免疫系统发育成熟之前的任意发育期的禽蛋胚胎中，但iPS细胞要注射到囊胚中。使细胞接受者的免疫系统对人的细胞产生耐受，这样，细胞接受者以后的免疫系统就不会把自体内的人的细胞删除掉。显微操作完毕，用一小片状透明物体盖住蛋壳的开口，片状物体可以是消毒的小片盖玻片、透明的塑料膜等，并用透明胶布将片状物体与蛋壳接触处封固，或用融化的石蜡将片状物体与蛋壳接触处封固。然后将操作完毕的禽蛋按孵化的标准要求进行孵化或继续孵化。接下来就是按现成技术从整个胚胎、胎肝或成年个体的骨髓等器官组织中分离人类干细胞。
所述的禽蛋为鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋或鸵鸟蛋等。
所述的人类干细胞为缪斯细胞(Muse cells)、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、iPS细胞等。间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞是属于成体多能干细胞，在动物胚胎中能够扩增。而iPS细胞是属于囊胚内的胚胎干细胞。
所述的人类干细胞是从人的成体组织中分离的人类成体多能干细胞，或分离自人的iPS细胞所分化出的人类成体多能干细胞或直接用人类体细胞诱导的iPS细胞。
iPS细胞在胚胎发育过程会分化成各种成体细胞，包括成体多能干细胞，与动物细胞组成嵌合体胚胎。为了提高人类细胞在动物胚胎组织中的比例，可以事先对囊胚用辐射等方法进行致弱处理。一般来说，人于动物嵌合体的胚胎无法在出生后成活，但提取人类成体多能干细胞只要未出生的胚胎就可以了。
用iPS细胞生产成体多能干细胞的方法包括(1)往培养液添加特定的分化诱导因子使iPS细胞直接分化成某种成体多向干细胞，然后把成体多能干细胞分离出来；(2)把 iPS细胞注免疫缺陷的动物体内产生畸胎瘤，然后从畸胎瘤中分离出各种成体多能干细胞； (3) iPS细胞在一定的培养条件下会产生胚状体(embryoid bodies,EBs)集落，然后从胚状体集落中分离出各种成体多能干细胞。
上述由iPS细胞分化的成体多能干细胞年龄较小，注射到老年人体内能够让老年人衰老个体中的器官组织恢复活力，有返老还童的效果。但是，由于细胞过于幼稚，是属于胚胎产生免疫耐受期之前的成体多向干细胞(或者说是成体多能干细胞的前体细胞)，有一些抗原没有经过免疫识别耐受，因此，即使遗传背景与宿主相同，宿主体内的免疫系统也会把它当做异物排斥掉。造成这种后果我曾经(燕京医学通讯，1998;66:1058、1060，本文是内部刊物，要索取本文请到燕京函授医学院，地址北京市海淀区复兴路21号(公主坟西北侧卫国中学内))说过，转化(幼稚化)的干细胞可能会表达胚胎免疫系统没有识别和耐受的胚性抗原，会引发免疫排斥。如今年5月13日在《自然》杂志的一篇文章报道“重编程细胞同源移植也会排斥”，美国加州大学圣地亚哥分校的研究者把小鼠体细胞重编程的 iPS细胞分化的成体细胞移植到细胞来源的小鼠体内，本来以为遗传背景相同不会发生排斥，可小鼠却快速排斥移植来的细胞。研究者发现，由iPS细胞分化的成体细胞高表达两种基因，而这两种基因在正常小鼠体细胞内没有表达；此外，用于重编程的体细胞本身已经发生了突变，诱导转化成的iPS细胞同样携带突变的基因，再分化成的成体细胞还是携带突变的基因，以及在细胞培养的分化增殖过程DNA受到损伤(每3个细胞分裂一次就有1次突变发生，并且其突变具有累积效应)，个体的免疫系统当然会把它当做异物删除掉，这和通常个体的免疫系统删除突变的体细胞的动机是一样的，是有益的，因为我们不希望把突变的细胞植入人体。《科技日报》1999年X月X日？报道一种能抑制伤口愈合的基因， 一般伤口要5天愈合，通过抑制该基因，伤口 2天就愈合了。该基因的主要功能是促进伤口的免疫反应功能，这是因为伤口的细胞再生时DNA处于频繁的复制，此时DNA最易突变，该基因的促进免疫作用是有利于伤口再生时所产生的突变的细胞的清除，以此保证体细胞再生时的遗传纯正性。还有，把含有早期成体多向干细胞的卵黄囊移植到免疫缺陷的成年动物之后，几乎没有细胞还具有增殖能力，可能是早期的干细胞在成熟的环境下不能发挥作用(Mvller 等人，1994)。因此，对过于幼稚的成体多向干细胞，和卵黄囊一样无法在成年动物中生存。 如果把卵黄囊细胞移植到幼子的肝脏中就能够生存和增殖，然后再把它移植到成年动物体内，就能够在骨髓中产生造血功能(Yoder等人，1997)。据此，本发明把用iPS细胞生产的各种成体多向干细胞注入到禽蛋的胚胎中，可以让幼稚的成体多向干细胞继续发育成熟(就像胎肝细胞会表达甲胎蛋白，成熟的肝细胞不会表达甲胎蛋白一样)，以避免将来移植到遗传背景与成体多能干细胞相同的宿主体内也会遭到免疫排斥。以鸡蛋和人类缪斯细胞(Muse cells)为例，缪斯细胞用绿色荧光蛋白标记。操作时，选用的鸡蛋胚珠大约发育期为原肠胚，在鸡蛋的上方将蛋壳开一个小口，在显微镜下， 用显微注射管吸取人类缪斯细胞，并分别向每个鸡蛋胚珠注射50-100个缪斯细胞，缪斯细胞要注射到胚胎的外胚层之上、外胚层与内胚层之间和内胚层之下。显微注射管的内径须大于细胞直径。注意在向鸡胚胎注射时尽量避免注入培养液。当然，也可以在鸡胚胎发育到 70小时之前的任意发育阶段注射缪斯细胞，因为鸡的胚胎免疫系统发育成熟的时间大约是在孵化到75小时以后。显微操作完毕，用一小片状物体(为了便于观察，用小片透明盖玻片)盖住开口， 片状物体可以是消毒的盖玻片、透明的塑料膜等，并用用融化的石蜡等将片状物体周边封固，然后将操作完毕的鸡蛋按孵化小鸡的标准孵化。如孵化小鸡那样，按时观察小鸡胚胎发育情况，并顺便观察缪斯细胞扩增和分布 (观察绿色荧光蛋白的发布与绿光强度)。
权利要求
1.用禽蛋生产人类干细胞的方法，材料包括禽蛋和人类干细胞，其特征是操作时，先在禽蛋的上方将蛋壳开一个小口，用显微注射管吸取人类干细胞，注射到免疫系统发育成熟之前的任意发育期的禽蛋胚胎中，但iPS细胞要注射到囊胚中，使细胞接受者的免疫系统对人的细胞产生耐受，这样，细胞接受者以后的免疫系统就不会把自体内的人的细胞删除掉，显微操作完毕，用一小片状透明物体盖住蛋壳的开口，片状物体可以是消毒的小片盖玻片、透明的塑料膜等，并用透明胶布将片状物体与蛋壳接触处封固，或用融化的石蜡将片状物体与蛋壳接触处封固，然后将操作完毕的禽蛋按孵化的标准要求进行孵化或继续孵化，接下来就是按现成技术从整个胚胎、胎肝或成年个体的骨髓等器官组织中分离人类成体多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的用禽蛋生产人类干细胞的方法，其特征是所述的禽蛋为鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋或鸵鸟蛋。
3.根据权利要求1所述的用禽蛋生产人类干细胞的方法，其特征是所述的人类干细胞为缪斯细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、iPS细胞。
4.根据权利要求1所述的用禽蛋生产人类干细胞的方法，其特征是所述的需要生产的人类干细胞是从人的成体组织中分离的人类成体多能干细胞，或分离自人的iPS细胞所分化出的人类成体多能干细胞。
全文摘要
本发明涉及干细胞生物学领域，特别涉及用禽蛋生产人类干细胞的方法，操作时，先在禽蛋的上方将蛋壳开一个小口，用显微注射管吸取人类干细胞，注射到免疫系统发育成熟之前的任意发育期的禽蛋胚胎中。显微操作完毕，用一小片状物体盖住开口。然后将操作完毕的禽蛋按孵化的标准要求进行孵化或继续孵化。利用禽蛋生产人类成体多向干细胞，无需像用哺乳动物胚胎生产人类干细胞那样需要进行宫内注射，因此具有成本低，成功率高和操作简单。
文档编号C12N5/0775GK102492652SQ20111038415
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者黄必录 申请人:黄必录