实时荧光定量pcr检测方法

专利名称：实时荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及实时荧光定量PCR领域，特别地，涉及一种实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是通过对基因的选择性片段进行体外扩增，以对靶基因进行检测的技术。根据扩增策略和检测产物手段的不同，PCR可分为定性禾口定量。实时定量 PCR (Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction， RQ-PCR)是在对靶基因的扩增过程中加入荧光标记探针，同时将核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现对靶基因的准确定量检测。RQ-PCR具有高灵敏性、高精确性和高通量性。临床中实时定量PCR检验相对于其它临床检验技术而言，虽然具有极高的检测灵敏度，但仍易出现“假阴性”的结果。产生假阴性结果的原因中有一些是可以通过调节仪器、 试剂避免的如靶基因提取过程中的丢失、提取试剂(如有机溶剂等)残留、标本中抑制物去除不彻底、扩增仪孔间温度差异等。现有技术中为进一步的避免假阴性结果最有效的措施是设立“内标”。非竞争性内标是指内标与靶基因具有不同的引物序列。非竞争性内标与待测靶基因之间不存在引物竞争关系。但使用非竞争性内标时，需要单独设计针对内标的引物、探针。多对引物、探针在反应管中形成多重PCR。使得引物、探针之间出现相互干扰的概率增大。为避免干扰，常用手段为调节引物、探针和内标的浓度。这些手段会加重测试过程优化的难度。“竞争性”内标是指具有与靶基因相同的引物序列和具有与靶基因不同的探针检测区序列的片段。该内标与靶基因采用相同的引物、内标在扩增过程中，该内标必然与靶基因相互竞争，含量低的一方受到抑制，从而检测待测基因中是否存在抑制。当该内标与靶基因的浓度相差100倍以上时，浓度低的一方就无法扩增。由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少。

发明内容
本发明目的在于提供一种实时荧光定量PCR检测方法，以解决当靶基因浓度较高时，使用竞争性内标法时内标受抑制，无法扩增，易出现假阴性的技术问题。为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤(1)选取目的基因上的同源保守区段，设计与同源保守区段5’端和3’端特异配对的上、下游引物，选取同源保守区段中的第一区段，设计与第一区段配对的第一探针，第一探针的5’端标记第一荧光报告基团；(2)构建同源保守区段的竞争性内标，并设计竞争性内标的内标探针，内标探针的
35’端标记第二荧光报告基团；(3)在同源保守区段上选取与第一区段间隔的第二区段，设计与第二区段特异互补配对的增补探针；(4)提取纯化样本基因，合成上下游引物、内标基因的质粒、第一探针、内标探针和增补探针后用于对样本基因进行实时荧光定量PCR扩增；(5)记录所得荧光信号，判断结果；增补探针的5’端标记第二荧光报告基团，第二区段和第一区段均位于上、下游引物之间；增补探针的浓度为第一探针的浓度的1/2 1/10。进一步地，内标探针的Tm值与第一探针的Tm值差值的绝对值小于1°C，内标探针的GC碱基含量百分比与第一探针的GC碱基含量百分比差值为0 8%。进一步地，内标探针与第一探针的长度相同。进一步地，内标探针、增补探针在软件primer premier 5· 0中的Hairpin的| AG < 4. 5，Dimer 的 | AG| < 10,上、下游引物在软件 primer premier 5. 0 中的 Cross Dimer 的 I AGl < 10。进一步地，第一、第二荧光报告基团为6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、2， 7-二甲基-4、六氯-6-甲基荧光素、CY3、CY5、LightCycler Red610,LightCycler Red640 中的任一种，当第一荧光报告基团为其中一种时，第二荧光报告基团为与之区别的另一种；第一探针、内标探针和增补探针的3’端标记荧光淬灭基团，荧光淬灭基团同时为TAMRA、BHQ、 Eclipse、Dabcyl 中任一。进一步地，内标探针、增补探针的长度为20 30bp，Tm值为65 73°C;内标探针、 增补探针的Tm值比上、下游引物的Tm值高5 10°C;内标探针、增补探针的GC碱基含量百分比为35% 70%。进一步地，内标探针、增补探针的5’端的起始碱基为A碱基、T碱基或C碱基中任
ο进一步地，内标探针、增补探针中C碱基的含量高于G碱基的含量。本发明具有以下有益效果本发明提供的方法增加了一个起内标作用的增补探针，增补探针针对目的基因序列的第二区段，第二区段异于第一探针针对的第一区段。当样本中不含目的基因或目的基因浓度较低时，由于内标质粒的加入，内标与目的基因同时扩增；当样本中含有较高浓度的目的基因时，由于增补探针的存在，如果此时增补探针对应的目的基因的第二区段序列仍有扩增，则可避免由于配置PCR反应液时未考虑样本中目的基因浓度较高的因素造成的假阴性。而且通过使用发现增设增补探针后，增补探针的扩展曲线的Ct (Cycle threshold) 值与目的基因的含量成正相关。因此，这两种探针的存在可以有效监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，避免假阴性结果。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将参照实施例，对本发明作进一步详细的说明。


构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中图1本发明优选实施例的HBV-DNA阴性样本检测时目的基因和内标的扩增图；图2是本发明优选实施例的低浓度HBV-DNA样本检测时目的基因及内标的扩增图；图3是本发明优选实施例高浓度HBV-DNA样本检测时内标的扩增图；图4是本发明优选实施例高浓度HBV-DNA样本检测时目的基因的扩增图；图5是对比例高浓度HBV-DNA样本检测时采用非竞争性内标得到的内标扩增图； 以及图6是对比例高浓度HBV-DNA样本检测时采用非竞争性内标得到的目的基因的扩增图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。具体的本文中的增补探针起类似内标的监测作用，监测目的基因是否发生扩增， 防止假阴性的出现。第一探针是指现有技术中常用于指示目的基因扩增的探针。内标探针是面向内标的探针，用于检测内标是否发生扩增，其作用也是防止出现假阴性。第一探针和内标探针均为现有技术中常用的探针。本发明提供的实时荧光定量PCR检测方法中采用三条探针第一探针、增补探针和内标探针，使用第一探针和内标探针后即可在现有PCR扩增仪的基础上对样本基因进行检测。而增补探针起到内标的作用，避免由于样本基因中目的基因浓度过大时，对内标扩增的抑制，而出现假阴性的结果。而且该检测方法能定量测定样本中目的基因的浓度，从而对患者的病情做出进一步的辅助诊断。实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤(1)选取目的基因上的同源保守区段，设计与同源保守区段5’端和3’端特异配对的上、下游引物，选取同源保守区段中的第一区段，设计与第一区段配对的第一探针，第一探针的5’端标记第一荧光报告基团；(2)构建同源保守区段的竞争性内标，并设计竞争性内标的内标探针，内标探针的 5’端标记第二荧光报告基团；(3)在同源保守区段上选取与第一区段间隔的第二区段，设计与第二区段特异互补配对的增补探针；(4)提取纯化样本基因，合成上下游引物、内标基因的质粒、第一探针、内标探针和增补探针后用于对样本基因进行实时荧光定量PCR扩增；(5)记录所得荧光信号，判断结果；首先按常规方法获得目的基因中的同源保守区段，并根据该同源区段设计常规的第一探针。第一探针与同源保守区段的中的第一区段基因序列互补配对。所得第一探针的 5’端标记第一荧光报告基团。设计的上、下游引物分别与同源保守区段的两端的基因序列互补配对。构建内标基因。内标基因序列具有与目的基因序列相同的上、下游引物。根据内标基因的序列设计与之配合的内标探针。或者先设计一个与目的基因碱基数相同的内标探针，再根据这一内标探针的序列得到内标基因的序列，合成内标质粒。内标的设计方法均为常用的方法。选取同源保守区段的第二区段按照常规设计第一探针的方法设计增补探针。该第二区段既要位于同源保守区段的上、下游引物之间，同时也不能与第一区段重合。从而实现在样本扩展过程中对样本同源保守区段的不同位置同时进行检测的目的。常规的竞争性内标只有一个内标探针，即构建一个内标序列，合成内标质粒，并配合针对该内标质粒的探针使用。由于这个内标序列使用的上、下游引物和目的基因相同，存在一个竞争性关系，当目的基因浓度很高时，内标质粒受到抑制，就没有扩增曲线了，此时就无法发挥内标的作用。本发明中的增补探针就是为了在出现这种情况时仍然能准确检测到样本中的目的基因，避免假阴性出现而设计的。增补探针的序列和目的基因的序列互补， 但是位置、序列及标记的荧光基团与第一探针均不同。由于增补探针的检测对象也是目的基因，所以即使目的基因浓度很高时，增补探针也能有荧光信号产生，并且通过实验发现增补探针的扩增曲线和目的基因的浓度成正相关。这样能更有效的检测目的基因浓度。所设计的内标探针、增补探针在常用探针设计软件primer premier 5. 0中的 Hairpin 的 | AG| <4.5，Dimer 的 | AG| < 10，上、下游引物在软件 primer premier 5.0 中的Cross Dimer的| AG| < 10。优选的，该Hairpin的| AG| < 1。此时效果最优。这些都为涉及探针的常规工艺参数。为了增加所设计增补探针的可靠度还可以采用常规软件 Blast，对所设计的探针的特异性进行核实。增补探针的5’端与内标探针的5’端标记的荧光报告基团相同均为第二荧光报告基团。而第一探针5’端标记的荧光报告基团则与第二荧光报告基团不同，为第一荧光报告基团，从而在扩增时获得两个有明显区别的荧光信号。第一、第二荧光报告基团为6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、2，7-二甲基-4、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、 CY3、CY5、LightCycler Red610、LightCycler Red640 中的任一种，当第一荧光报告基团为其中一种时，第二荧光报告基团为与之区别的另一种。HEX也可以为5- 二氯-6-羧基荧光素(JOE)或VIC。例如当第一荧光报告基团为FAM时，第二荧光报告基团为HEX。这样就能实现得到两个不同的荧光信号的目的。第一探针、内标探针和增补探针的3’端标记荧光淬灭基团，荧光淬灭基团同时为TAMRA、BHQ、Eclipse、Dabcyl中任一。仅有上述条件内标探针、增补探针对应的内标还不能实现与目的基因同步扩增， 而如果不能同步扩增则无法实现对同源保守区段的检测以及内标的监测作用。因而还需要内标探针与第一探针的长度相同，增补探针、内标探针的Tm值与第一探针的Tm值差值的绝对值小于1°C，GC碱基含量百分比与第一探针的GC碱基含量百分比差值为0 8%。由于增补探针和第一探针均为面对目的基因进行扩增的，因而二者必然能实现同步扩增。而内标探针按上述条件设计后就能实现与第一探针和增补探针同步扩增的目的，按此参数设计探针扩增效果最优。优选地，内标探针、增补探针的Tm值为65 73°C，内标探针、增补探针的Tm值比上、下游引物的Tm值高5 10°C ；内标探针、增补探针的GC碱基含量百分比为35 70%。 内标探针与第一探针的长度相同时，能更好的实现同步扩增的目的。优选为内标探针、增补探针的长度为20 30bp，以保证内标探针、增补探针与目的基因实现特异性的结合。
优选的，内标探针、增补探针的5’端的起始碱基为A碱基、T碱基或C碱基中任一。 内标探针、增补探针中C碱基的含量高于G碱基的含量。前述参数为设计探针时所要求的常规参数，按此设计的探针才能在满足常规要求的基础上发挥其正常的作用。提取纯化样本基因，合成上、下游引物、内标质粒、第一探针、增补探针和内标探针后配制反应体系用于对样本基因进行实时荧光定量PCR扩增；记录所得荧光信号，判断结果。PCR的操作步骤、操作参数和所用试剂均为常规工艺所规定的。所加入的增补探针的浓度为第一探针的浓度的1/2 1/10。为了防止增补探针所产生荧光信号过强对第一探针荧光信号的干扰，因而需将增补探针的浓度限定在第一探针浓度的1/2 1/10。这样才能保证用于PCR时，所得结果准确。这样的浓度范围选择不是仅通过数次实验就可发现的。根据使用增补探针的目的，正常的符合逻辑的想法是认为增补探针的浓度应该较第一探针为高，这样才能更有效的避免假阴性的出现，但发明人创造性的发现反而是增补探针的浓度较低时才能降低干扰，提高实验的准确性。本发明提供的实时荧光PCR定量检测方法，在普通的竞争性内标法基础之上增加了增补探针。在实时荧光定量PCR中内标与目的基因同步扩增。含目的基因的高浓度样本时，增补探针对应的内标也得以同步扩增，且内标Ct与目的基因的含量相关；内标探针的加入，含有阴性或低浓度目的基因的样本，内标探针对应的内标均有扩增，且Ct基本一致， 从而可以有效监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，从而避免假阴性结果。
实施例以下实施例中核酸提取按照现有技术中的煮沸法的常规操作步骤进行。以下实施例中阈值线0与扩增曲线相交点对应的横坐标值为该荧光检测通道的Ct值。实施例1 血清中阴性及低浓度HBV-DNA的实时荧光定量PCR检测应用DNA Star软件包中的kq Man、Meg Align等软件对Gen bank中检索到的 HBV各基因型(A H)的序列进行同源性比较，找出同源保守区段，保守区段序列为5’-GT GTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAA GGTATGTTGCCCGTTTGT-3，。在引物设计软件Primer Express 3. 0和Primer Premier 5. 0软件的辅助下，并通过GenBank数据库中Blast工具的检索分析，设计出一套引物和第一探针，第一探针的5’ 端采用第一荧光报告基团FAM标记，3’端采用非荧光淬灭剂(Dabcyl)标记，以降低背景干扰。上游引物 HBV-Fl 序列为 5，-GTG TCT GCG GCG TTT TAT CAT-3，，下游引物 HBV-Rl 序列为 5，-ACA AACGGG CAA CAT ACC TTG-3，，探针序列 HBV-Pl 为5，FAM-CAT CCT GCT GCT ATG CCTCAT CTT CTT-Dabcyl 3，。选择人工合成基因为内标基因，在HBV DNA保守区段序列的基础上，部分碱基发生突变，内标基因碱基序列为5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCT TCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。在引物设计软件Primer Express 3. 0和Primer Premier 5.0软件的辅助下，设计内标探针和增补探针，内标探针和增补探针的5’端均采用第二荧光报告基团HEX标记， 内标探针和增补探针的3’端均采用非荧光淬灭剂Dabcyl标记，以降低背景干扰。增补探针ICPl 针对目的基因，其碱基序列为5，HEX-CCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACT-Dabcyl 3，； 内标探针ICP2针对内标基因，其碱基序列为5‘ HEX-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-Dabc yl 3’。表1中列出各探针和上、下游引物基因序列及长度，表2中列出各探针和上、下游引物在Primer Premier 5.0中的参数。表1各探针和上、下游引物基因序列及长度
权利要求
1.一种实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤(1)选取目的基因上的同源保守区段，设计与所述同源保守区段5’端和3’端特异配对的上、下游引物，选取所述同源保守区段中的第一区段，设计与所述第一区段配对的第一探针，所述第一探针的5’端标记第一荧光报告基团；(2)构建所述同源保守区段的竞争性内标，并设计所述竞争性内标的内标探针，所述内标探针的5’端标记所述第二荧光报告基团；(3)在所述同源保守区段上选取与所述第一区段间隔的第二区段，设计与所述第二区段特异互补配对的增补探针；(4)提取纯化样本基因，合成上下游引物、内标基因的质粒、第一探针、内标探针和增补探针后用于对所述样本基因进行实时荧光定量PCR扩增；(5)记录所得荧光信号，判断结果；所述增补探针的5’端标记第二荧光报告基团，所述第二区段和所述第一区段均位于所述上、下游引物之间；其特征在于，所述增补探针的浓度为所述第一探针的浓度的1/2 1/10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标探针的Tm值与第一探针的Tm值差值的绝对值小于1°C，所述内标探针的GC碱基含量百分比与第一探针的GC碱基含量百分比差值为0 8%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述内标探针与所述第一探针的长度相同。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述内标探针、增补探针在软件primer premier 5. 0中的Hairpin的 AG <4. 5，Dimer的 AG < 10，所述上、下游引物在软件 primer premier 5. 0 中的 Cross Dimer 的 AG <10。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一、第二荧光报告基团为6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、2，7-二甲基-4、六氯-6-甲基荧光素、CY3、CY5、LightCycler Red610,LightCycler Red640中的任一种，当所述第一荧光报告基团为其中一种时，所述第二荧光报告基团为与之区别的另一种；所述第一探针、内标探针和增补探针的3’端标记荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ、Eclipse、Dabcyl中任一。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述内标探针、增补探针的长度为20 30bp，Tm值为65 73°C;所述内标探针、增补探针的Tm值比所述上、下游引物的Tm值高5 IO0C ；所述内标探针、增补探针的GC碱基含量百分比为35% 70%。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述内标探针、增补探针的5’端的起始碱基为A碱基、T碱基或C碱基中任一。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内标探针、增补探针中C碱基的含量高于G碱基的含量。
全文摘要
本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测方法，在常规的PCR检测方法的基础上增加了一个面向目的基因同源区段的增补探针，以发挥类似内标的监测作用。采用该法进行实时荧光PCR能避免假阴性的出现。
文档编号C12Q1/68GK102424852SQ20111044469
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者戴立忠, 熊晓燕, 邓中平 申请人:戴立忠