专利名称：带有荧光素酶标签的ev71型全长感染性克隆的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种带有IUuc标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法，同时还涉及一种带有mUC标签的EV71全长感染性克隆在制备病毒的能力及药物筛选中的应用。
背景技术：
肠道病毒71 型(Enterovirus 71，EV71)属于小 RNA 病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，其基因组为单股正链RNA，长度约为7. 5kb,编码约2200个氨基酸。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个前体蛋白(P1、P2、P3)。其中，Pl前体蛋白可切割4种病毒结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)。P2和P3前体蛋白可切割为7个非结构蛋白 (2A、2B、2C、3A、;3B、3C、3D) ；P3区在进化过程中高度保守。ORF的两侧分别为5，和3，非编码区，另外在3’非编码区末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸(polyA)。EV71的感染能够引起人的手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病，严重时可危及生命。其传播途径主要经由胃肠道或呼吸道传播，也可经由接触病人皮肤水泡的疱疹液而受到感染。自1974年，EV71被首次报道以来，已在马来西亚、澳大利亚、新加坡、日本，中国台湾和中国大陆等国家和地区爆发和流行。在我国，很多地区都曾有散发病例的报道，直到2008年EV71的爆发流行(手足口病病例488955例，死亡1 例)，才引起了整个社会的关注。因此，2008年4月，国家卫生部颁发了《肠道病毒(EV71)感染诊疗指南(2008版)》和《手足口病预防控制指南(2008版)》， 并在同年5月将手足口病纳入丙类法定传染病管理。2009年，我国部分地区手足口病病例呈现增多的趋势。针对严峻的现状，广大的科学工作者以EV71为对象，从病毒的生物学特性、致病机理、诊断试剂和疫苗的研究等方面做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏特效的治疗手段。因此，继续深入的开展相关的研究，如病毒的分子生物学特性、复制机制、致病机理等，将有利于人类更加全面透彻的了解EV71，从而为设计有效的药物、准确的诊断方法和试剂以及良好的疫苗提供理论依据。随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。目前，该技术已经应用到了许多不同的病毒研究中，如西尼罗病毒，登革病毒，狂犬病毒，牛病毒性腹泻病毒等，建立了相应病毒的反向遗传学平台(全长感染性克隆)，以这些平台为基础开展了关于病毒的复制机制、 致病机理和疫苗的相关研究，并取得了突破性的进展。同时，相关的科学工作者在构建的全长感染性克隆的基础上进一步的设计了带有不同标签的全长感染性克隆。这一新的反向遗传学平台为开展相关的科学研究提供了相比于不带标签的病毒全长感染性克隆更便捷的优势。因此，本发明提供了一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆，为深入开展EV71 的基础研究和应用研究提供了有效的平台。本发明具有十分重要的理论意义和现实意义，同时具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆的制备方法。通过该方法，可获得带有mUC标签的EV71全长感染性克隆。将获得的EV71全长感染性克隆体外转录为RNA，并将其转染Vero细胞，通过细胞病变的观察、Rluc活性的检测和病毒蚀斑实验证明了带有IUuc基因的EV71全长感染性克隆具有稳定产生EV71的能力，并且产生的EV71的生物学特性与亲代病毒相似。本发明的另一个目的是在于提供了一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆在制备病毒的能力和药物筛选中的应用，EV71的感染能够引起人的手足口病、疱疹性咽峡炎、 无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病，严重时可危及生命。实验证明，以构建的带有mUC标签的EV71全长感染性克隆为平台，使用已知对EV71具有抑制作用的盐酸胍测试本发明所构建的平台在抗病毒药物筛选中的有效性，结果表明本发明能够很好的应用抗病毒的药物筛选。另外，本发明也在研究EV71的动物模型、病毒的复制机制与致病机理、药物的作用机制、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案一种带有IUuc标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法，其步骤是1.总RNA的提取取 140ul 的 EV71 ^(Yong Zhang, Jitao Wang, Wanshen Guo, Haiyan Wang, Shuangli Zhu, Dongyan Wang, Ruyin Bai, Xingle Li, Dongmei Yan, Huiling Wang, Yan Zhang, Zhen Zhu, Xiaojuan Tan, Hongqiu An, Aiqiang Xu, and Wenbo Xu. Emergence and Transmission Pathways of Rapidly Evolving Evolutionary BranchC4a Strains of Human Enterovirus 71in the Central Plain of China. PLoS One. 2011 ；6 (11) e27895.)，按照QIAamp Viral RNA (购自Qiagen公司)试剂盒说明书的要求抽提EV71的总 RNA，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (购自 Thermo 公司)测定 RNA 的浓度，并使用浓度为(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，于-80°C保存备用。2. EV71 的 RT-PCR 扩增将EV71的全基因组分成四个部分设计引物(这四个片段分别命名为F1、F2、F3和 F4)。以上述步骤1中的EV71的总RNA为模版，采用RT-PCR试剂盒(购自Takara公司)分别获得 DNA 片段 F1、F2、F3 和 F4。片段 Fl、F2、F3 和 F4 序列如 SEQ ID NO =USEQ ID N0: 2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示。使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR 产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别回收DNA片断，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1 % (w/v) 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于_20°C保存备用。PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。DNA片段Fl的引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，DNA片段F2的引物SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物SEQID NO 9 和 SEQ ID NO :10，DNA 片段F4的引物SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12。另外SEQ ID NO :5含有T7 RNA聚合酶启动子序列SEQ ID NO :13ο
SEQ ID NO 55’ -CTAGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACT-3’SEQ ID NO 65’ -CTAGAAGCTTCCTCAAATTAATCCACTGGT-3，SEQ ID NO 75’ -CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，SEQ ID NO 85’ -CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3‘SEQ ID NO 95’ -CTAGTCTAGACTCAGAACCTGGTGATTGC-3’SEQ ID NO: 105， -CTAG AAGCTTAATTTTATCAATCGAGCGCAG-3，SEQ ID NO: 115’ -CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3’SEQ ID NO :125， -CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，SEQ ID NO :13TAATACGACTCACTATAGGRT-PCR 的反应体系均为PrimeScript 1 Step Enzyme Mix :2 μ 1， 2 X IStepBuffer :25μ 1，引物1μ 1，引物1μ 1，模板 RNA 为3μ 1，无 RNase 水18μ 1。扩增条件为50°C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C IOmin, 28个循环。3. EV71亚克隆的构建将上述步骤2中获得的DNA片段Fl、F2、F3、F4和载体pUC19 (购自美国ftOgema 公司)分别用)(bal (购自美国NEB公司)和HindIII (购自美国NEB公司)酶切。使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测酶切的产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)分别回收DNA片断，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，并电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶(购自美国^ffiB公司)分别连接经过酶切的F1、F2、F3、F4和pUC19，并将连接产物转化感受态HBlOl (购自美国Progenia公司)， 挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为=IOXbuffer :2μ 1, dNTP :0. 4 μ 1，引物 0. 2μ 1，引物0. 2 μ 1，模板0. 2μ l，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。扩增条件为:94°C 2min， 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循环。将 PCR 鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F1、pUC19-F2、pUC19_F3 和 pUC19-F4。鉴定pUC19-Fl所用的引物为片段Fl的引物为SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6 ；鉴定pUC19-F2所用的引物为片段F2的引物为SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8 ；鉴定pUC19-F3所用的引物为片段F3的引物为SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10;鉴定PUC19-F4所用的引物为片段F4的引物为SEQ ID NO 11和SEQ IDNO :12。4.含有EV71基因的重组克隆的构建
EV71部分基因(F1-F2)的拼接用BsiwI (购自美国NEB公司)和HindIII酶切 (前面已述)上述步骤3中得到的pUC19-Fl和pUC19-F2，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收PUC19-F1的大片段和pUC19-F2的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用1 % (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4 DNA连接酶(前面已述)连接pUC19-Fl的大片段和pUC19_F2的小片段， 并将连接产物转化感受态HBlOl (前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定，PCR的反应体系均为10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，) 0· 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3，):0. 2 μ 1，模板:0. 2 μ IJaq 酶: 0. 2μ 1，水:16. 8μ 1。扩增条件为94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72 °C 3min，72°C IOmin, 16°C IOminJSf循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F1-F2。EV71部分基因(F3-F4)的拼接用SpeI (购自美国NEB公司)和HindIII (前面已述)酶切上述步骤3中得到的pUC19-F3和pUC19-F4，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收PUC19-F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用1 % (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的质量。然后使用T4DNA连接酶(前面已述)连接pUC19-F3的大片段和pUC19_F4的小片段，并将连接产物转化感受态HBlOl (前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为 IOXbuffer :2μ 1，dNTP 0. 4μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTT ΤΤ-3，) 0. 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。扩增条件为94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72°C 3min,72°C 10min,16°C循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F3-F4。EV71全长基因(F1-F2-F3-F4)的拼接用AatII (购自美国NEB公司)和 HindIII (前面已述)酶切PUC19-F1-F2和pUC19_F3_F4，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收PUC19-F1-F2的大片段和pUC19-F3-F4的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶(前面已述)连接pUC19_Fl_F2的大片段和 PUC19-F3-F4的大片段，并将连接产物转化感受态HBlOl (前面已述)，挑取克隆并进行PCR 鉴定。PCR 的反应体系均为10 Xbuffer :2μ l，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATG GCAGACAAGGTTTT-3，)0. 2 μ 1，引物(5，-CTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。扩增条件为=94 °C 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循环。将 PCR 鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F1-F2-F3-F4。拼接的全基因插入pACYC177 用)(bal (前面已述)和HindIII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177(购自美国NEB公司)，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收经过酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和经过酶切的pACYC177，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶(前面已述)连接经过酶切的产物， 并将连接产物转化感受态HB101 (前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定PCR的反应体系
7均为10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3， ):0.2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0.2 μ 1，Taq 酶 0. 2μ 1，模板0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。扩增条件为-MV 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min, 72°C 10min,16°C IOminJSf循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PACYC-EV71-FL。5.带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆的构建以带有Rluc基因的质粒(购自Promega公司)为模版，使用I^rimeSTAR HS酶 (购自Takara公司)，使用特异引物扩增IUuc基因片段，序列如SEQ ID N0:14所示，扩增 Rluc的引物为SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16。使用浓度为1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别回收DNA 片断，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为 1% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20°C保存备用。SEQ ID NO: 155 ‘ -ACATGCATGCATGGCTTCCAAGGTGTACGACC-3‘SEQ ID NO: 165 ‘ -CGACGCGTCTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTC-3‘PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR的反应体系均为5XPS buffer :10μ l，dNTP :4μ 1，引物0. 5μ 1， 引物0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶0. 5 μ 1，水34 μ 1。扩增条件为:98°C 30s， 94°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，72°C IOmin, 16°C 10min，30 个循环。将获得的Rluc基因片段和pACYC177-EV71-FL分别为用SphI和MluI酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的mUC基因片段和PACYC177-EV71-FL，使用浓度为 1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的产DNA 片段，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pACYC177-EV71-Rluc-FL。一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆在制备EV71病毒的能力的中应用其步骤是1.带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆制备病毒的能力①用)(bal酶切 pACYC177-EV71-Rluc-FL 并体外转录为 RNA，转染细胞，37°C，5 % (v/v) CO2培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞对照组，显微镜下每天观察实验组和对照组的细胞状态。②体外转录的pACYC177-EV71-IUuc-FL的RNA采用电转的方法转入Vero细胞，然后接种3 X IO5转染了 RNA的Vero细胞于12孔细胞培养板中，并在转染后2、6、14、16、18、 20,22,24,48和60h使用显微镜观察细胞的状态，同时设置一组转染时不含RNA的对照组。③体外转录的pACYC177-EV71-IUuc-FL的RNA采用电转的方法转入Vero细胞，然后接种3 X IO5转染了 RNA的Vero细胞于12孔细胞培养板中，分别在转染后2、6、14、16、 18、20、22、24和4 收集孔中培养基(即PO代不同时间点的病毒液)，并于_80°C保存，每次收集上清完毕后分别向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ 1细胞裂解液处理细胞，分别混勻孔中的细胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能读板仪检测IUuc的活性。2.带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆产生稳定携带IUuc基因的EV71的能力转染体外转录的pACYC177-EV71-Rluc-FL的RNA进入Vero细胞，在转染后2、6、 14、16、18、20、22和24h的PO代病毒感染Vero细胞，37°C、5% (v/v) CO2的培养箱中培养24h 后，分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ 1细胞裂解液处理细胞并混勻孔中的细胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能读板仪检测IUuc的活性。3.带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆制备的病毒与亲代病毒的生物学特性在6孔细胞培养板的各孔中分别接种3X IO5个Vero细胞，待细胞覆盖孔底 80-90%时，吸弃孔中的培养基，接入DMEM培养基10倍比稀释的转染后60h的病毒100 μ 1， 37°C吸附lh。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入新鲜的37°C预热的覆盖物，于37°C、 5% (v/v)CO2的培养箱中培养4天；待噬斑形成后用含有(w/v)结晶紫和3. 7% (ν/ν) 甲醛的染色液染色，室温，30min。取出孔中的覆盖物，并用流水冲洗孔底，500C，5min后观察斑点。一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆在制备病毒药物筛选中的应用1.盐酸胍对Vero细胞的毒性分析在96孔细胞培养板中接种2 X IO4Vero细胞， 在37°C，5% (v/v) CO2培养条件下，待汇合度达到90%;吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100 μ 1用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0、0. 0625， 0. 125、0. 25、0. 5、1、2、4、8、16、32 和 64mM)的盐酸胍，对照孔加 ΙΟΟμΙ 含 2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培养基；培养48小时后，使用MTT检测试剂盒检测盐酸胍对Vero的细胞毒性。2.盐酸胍对携带IUuc基因的EV71的抑制作用在96孔细胞培养板中接种 2 X IO4Vero细胞，在37°C，5% (v/v) CO2培养条件下，待汇合度达到90%时，分别向每孔加入pACYC177-EV71-IUuC-FL转染Vero细胞后60h收集并保存于_80°C的病毒液，感染复数为1，37°C吸附Ih;吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基2倍系列稀释的盐酸胍(浓度分别为0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1和2mM) (已经报道对EV71具有抑制作用)，于37°C，5% (v/v) CO2的培养箱中培养24h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ 1细胞裂解液处理细胞并混勻孔中的细胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照 Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能读板仪检测Rluc的活性。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1.该全长感染性克隆是以低拷贝的载体pACYC177为对象，将EV71的全基因组插入到pACYC177中，同时在与病毒5’端非编码区上游的连接区域引入T7RNA聚合酶的启动子序列，并且在5’端非编码区和VP4基因之间插入IUuc基因片段。一方面，这些特点使得能够在体外高效的获得EV71的RNA ；另一方面，能够采用电转或者脂质体转染的方法将RNA 转进细胞，并有效的产生EV71病毒，另外，能够通过检测IUuc的表达情况即可指示病毒的产生情况。2.本发明结合了细胞病变、荧光素酶的检测、病毒蚀斑和药物抑制等实验证明了本发明所构建的EV71全长感染性克隆具有很强的产生EV71病毒的能力，并且也证明了本发明所建立的EV71全长感染性克隆所产生的EV71病毒与亲代病毒具有相似的生物学特性。本发明所建立的EV71全长感染性克隆可以用来开展EV71的相关研究，具有广泛的应用价值。3.以本发明为基础，将为深入开展EV71的动物模型、病毒的复制机制与致病机理，抗病毒药物筛选和药物的作用机制、疫苗和诊断试剂等方面具有广泛的应用价值，因此具有十分重要的理论意义和现实意义。
图1为一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆的构建示意2为一种重组病毒产生的细胞病变示意图A 未转染RNA的Vero细胞；B 转染 pACYC177-EV71-Rluc_FL 的 RNA 的 Vero 细胞；图3为一种重组病毒与亲代病毒产生空斑的形态比较示意图A :pACYC177-EV71-Rluc-FL 病毒产生的空斑形态；B :pACYC177-EV71-FL病毒产生的空斑形态；图4为一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆产生病毒的能力示意图在RNA转染Vero细胞后2、6、14、16、18、20、22和24h分别收集样品，然后按照 Luciferase Assay System试剂盒说明书的要求检测各个时间点的IUuc活性。图5为一种带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆稳定产生的病毒能力的分析示意图将？40丫(1774￥71-1 111(；呼1^转染￥61~0后2、6、14、16、18、20、22和24h 收集且保存于_80°C的病毒感染Vero细胞，并分别在感染后24h使用Luciferase Assay System试剂盒检测IUuc的活性。图6为一种盐酸胍对Vero细胞的毒性分析示意图使用MTT试剂盒检测不同浓度的盐酸胍(0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1、2、4、8、 16,32和64mM)对Vero细胞的毒性。图7为一种盐酸胍对EV71的抑制作用示意图分别使用不同浓度的盐酸胍(0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1和2mM)作用于含有 pACYC177-EV71-Rluc-FL病毒的Vero细胞，感染后24h检测Rluc的活性。
具体实施例方式实施例1 一种带有IUuc标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法，其步骤是(1)总 RNA 的提取取140ul的EV71病毒液(前面已述)，按照QIAamp Viral RNA (购自Qiagen公司)试剂盒说明书的要求抽提EV71的总RNA，使用Hiermo Scientific NanoDrop 2000(购自Thermo公司)测定RNA的浓度，并使用浓度为1 % (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，于-80°C保存备用。(2) EV71 的 RT-PCR 扩增将EV71的全基因组分成四个部分设计引物(这四个片段分别命名为F1、F2、F3和F4)。以上述步骤(1)中的EV71的总RNA为模版，采用RT-PCR试剂盒(购自Takara公司) 分别获得DNA片段Fl、F2、F3和F4。片段Fl F4序列如SEQ ID NO :1 4所示。使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别回收DNA片断，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20°C保存备用。PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。DNA片段Fl的引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，DNA片段F2的引物SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物SEQID NO 9 和 SEQ ID NO :10，DNA 片段F4的引物SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12。另外SEQ ID NO :5含有T7RNA聚合酶启动子序列SEQ ID NO :13οSEQ ID NO 55 ’ -CTAGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACT-3’SEQ ID NO 65’ -CTAGAAGCTTCCTCAAATTAATCCACTGGT-3，SEQ ID NO 75’ -CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，SEQ ID NO 85’ -CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3‘SEQ ID NO 95’ -CTAGTCTAGACTCAGAACCTGGTGATTGC-3’SEQ ID NO: 105， -CTAG AAGCTTAATTTTATCAATCGAGCGCAG-3，SEQ ID NO :115’ -CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3’SEQ ID NO :125， -CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，。SEQ ID NO :13TAATACGACTCACTATAGGRT-PCR 的反应体系均为PrimeScript 1 Step Enzyme Mix :2 μ 1， 2 X IStepBuffer :25μ 1，引物1μ 1，引物1μ 1，模板 RNA 为3μ 1，无 RNase 水18μ 1。扩增条件为50°C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C IOmin, 28个循环。(3)EV71亚克隆的构建将上述步骤(2)中获得的DNA片段F1、F2、F3、F4和载体pUC19(购自美国ftOgema 公司)分别用)(bal (购自美国NEB公司)和HindIII (购自美国NEB公司)酶切。使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测酶切的产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)分别回收DNA片断，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，并电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶(购自美国^ffiB公司)分别连接经过酶切的F1、F2、F3、F4和pUC19，并将连接产物转化感受态HBlOl (购自美国Progenia公司)， 挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为10Xbuffer :2 μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物: 0. 2μ 1，引物0. 2 μ 1，模板0. 2μ l，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。扩增条件为-MV 2min， 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循环。将 PCR 鉴定为阳性的克
隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F1、pUC19-F2、pUC19_F3 和 pUC19-F4。鉴定PUC19-F1所用的引物为片段Fl的引物为SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6 ；鉴定pUC19-F2所用的引物为片段F2的引物为SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8 ；鉴定pUC19-F3所用的引物为片段F3的引物为SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10;鉴定pUC19-F4所用的引物为片段F4的引物为SEQ ID N0:11和SEQ IDNO :12。(4)含有EV71基因的重组克隆的构建EV71部分基因(F1-F2)的拼接用BsiwI (购自美国NEB公司)和HindIII酶切 (前面已述)上述步骤(3)中得到的PUC19-F1和pUC19-F2，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收PUC19-F1的大片段和pUC19-F2的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用1 % (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶(前面已述)连接pUC19-Fl的大片段和pUC19_F2的小片段， 并将连接产物转化感受态HBlOl (前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定，PCR的反应体系均为10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，) 0· 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3，):0. 2 μ 1，模板:0. 2 μ IJaq 酶: 0. 2μ 1，水:16. 8μ 1。扩增条件为94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72 °C 3min，72°C IOmin, 16°C IOminJSf循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F1-F2。EV71部分基因(F3-F4)的拼接用SpeI (购自美国NEB公司)和HindIII (前面已述)酶切上述步骤3中得到的pUC19-F3和pUC19-F4，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收PUC19-F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的质量。然后使用T4DNA连接酶(前面已述)连接pUC19-F3的大片段和pUC19_F4的小片段，并将连接产物转化感受态HB101 (前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为 IOXbuffer :2μ 1，dNTP 0. 4μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTT ΤΤ-3，) 0. 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板0. 2μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。扩增条件为94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72°C 3min,72°C IOmin, 16°C循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F3-F4。EV71全长基因(F1-F2-F3-F4)的拼接用AatII (购自美国NEB公司)和 HindiII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2和pUC19_F3_F4，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收PUC19-F1-F2的大片段和pUC19-F3-F4的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶(前面已述)连接pUC19_Fl_F2的大片段和 PUC19-F3-F4的大片段，并将连接产物转化感受态HBlOl (前面已述)，挑取克隆并进行PCR10/12 页
鉴定。PCR 的反应体系均为10 Xbuffer :2μ l，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATG GCAGACAAGGTTTT-3，)0. 2 μ 1，引物(5，-CTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。扩增条件为=94 °C 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循环。将 PCR 鉴定为阳性的克隆进行培
养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F1-F2-F3-F4。拼接的全基因插入pACYC177 用)(bal (前面已述)和HindIII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177(购自美国NEB公司)，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收经过酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和经过酶切的pACYC177，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶(前面已述)连接经过酶切的产物， 并将连接产物转化感受态HBlOl (前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定PCR的反应体系均为10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3， ):0.2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0.2μ 1，Taq 酶 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。扩增条件为-MV 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min, 72°C 10min,16°C IOminJSf循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PACYC-EV71-FL。(5)带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆的构建为了获得IUuc基因片段，使用I^rimeSTAR HS酶(购自Takara公司)，使用引物特异引物扩增Rluc基因片段，序列如SEQ ID NO 14所示，扩增Rluc的引物为SEQ ID NO 15-16。使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别回收DNA片断，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1 % (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20°C保存备用。SEQ ID NO: 155' -ACATGCATGCATGGCTTCCAAGGTGTACGACC-3'SEQ ID NO :165' -CGACGCGTCTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTC-3'PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR的反应体系均为5XPS buffer :10μ l，dNTP :4μ 1，引物0. 5μ 1， 引物0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶0. 5 μ 1，水34 μ 1。扩增条件为:98°C 30s， 94°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，72°C IOmin, 16°C 10min，30 个循环。将获得的Rluc基因片段和pACYC177-EV71-FL分别为用SphI和MluI酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的mUC基因片段和PACYC177-EV71-FL，使用浓度为 1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的产DNA 片段，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pACYC177-EV71-Rluc-FL。实施例2 带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆制备EV71病毒的能力，其步骤是(1)质粒的线性化取10μ g质粒pACYC177-EV71-Rluc_FL，用XbaI(前面已述)酶切，然后向酶切产物中加入100 μ 1饱和酚(购自国药集团化学试剂公司)，混勻，17000g离心5min，吸取上层液体于新的离心管中，并向原离心管中加入100 μ 1无菌水混勻，17000g 离心5min ；吸取上层液体与上一步所得液体合并(总体积约200 μ 1)，加入200 μ 1氯仿(购自国药集团化学试剂公司)混勻，17000g离心5min ；吸取上层液体于无菌进口离心管管中 (约100μ 1)，加入10μ 1的pH5.2，3mol/l醋酸钠(购自国药集团化学试剂公司)和250 μ 1 体积无水乙醇(购自国药集团化学试剂公司)混勻，-20°C放置30min，17000g离心5min ； 吸弃上清，加入Iml 70% (ν/ν)乙醇洗涤，17000g离心5min，吸弃上清；室温放置5min，最后加入11 μ 1无RNAase的水溶解，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述) 测定DNA的浓度，使用1 % (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于_20°C保存备用。(2) RNA 的体外转录取 2 μ g 经过 XbaI 酶切的 pACYC177-EV71-Rluc_FL，按照 mMACHINE T7 Kit (购自美国Ambion公司)说明书的要求将其体外转录为RNA，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)测定RNA的浓度，使用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于_20°C保存备用。(3)转染Vero细胞将5 μ g体外转录的pACYC177-EV71-Rluc_FL的RNA采用电转的方法转入Vero细胞，然后接种3 X IO5转染了 RNA的Vero细胞于12孔细胞培养板中，并在转染后2、6、14、16、18、20、22、24、48和60h使用显微镜观察细胞的状态，同时设置一组转染时不含RNA的对照组。发现转染后60h，实验组的细胞出现明显的病变，而此时对照组的细胞没有观察到细胞病变(图2)，表明带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆具有拯救病毒的能力。同时分别在转染后2、6、14、16、18、20、22、对和4811收集孔中培养基(即PO代不同时间点的病毒液)，并于_80°C保存，每次收集病毒完毕后分别向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ 1细胞裂解液处理细胞并混勻孔中的细胞裂解物，取20 μ 1 于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照试剂盒说明书的要求使用多功能读板仪(购自德国Thermo)检测IUuc的活性(图3)。IUuc的活性表明了带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆已经产生了病毒。实施例3 带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆具有产生稳定携带IUuc基因的 EV71的能力，其步骤是在12孔细胞培养板中接种1. 5 X IO5Vero细胞，待汇合度达到60-70%时分别用转染 pACYC177-EV71-Rluc-FL 的 RNA 进入 Vero 细胞后于 2、6、14、16、18、20、22 和 24h 的 PO 代病毒感染Vero细胞，37°C、5% (v/v) CO2的培养箱中培养24h后，然后分别向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ 1细胞裂解液处理细胞，分别混勻孔中的细胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能读板仪检测IUuc的活性(图4)。IUuc的活性表明带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆产生的PO代病毒具有感染Vero细胞的能力，同时也表明带有IUuc 标签的EV71全长感染性克隆产生的病毒具有稳定携带IUuc基因的能力。因此，本发明构建的带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆具有产生稳定携带IUuc基因的EV71的能力。实施例4 带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆制备的病毒与亲代病毒的生物学特性，其步骤是在6孔细胞培养板中接种4X IO5Vero细胞，待汇合度达到80-90 %，吸弃孔中的培养基，接入用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的转染
14后60h的病毒100 μ 1 (包括pACYC-EV71-FL的PO代病毒(实验室制备与保存)和 pACYC177-EV71-Rluc-FL的PO代病毒)，37°C吸附Ih ；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃， 加入新鲜的37°C预热的覆盖物，其成份为2% (v/v)FBS，IXDMEM培养基，2% (w/v)的甲基纤维素。于37°C、5% (v/v) CO2的培养箱中培养4天；待噬斑形成后用含有(w/v)结晶紫和结晶紫和3. 7% (ν/ν)甲醛的染色液染色，室温，30min后；将孔中的琼脂取出，并用流水冲洗孔底，于50°C，5min，可见空斑(图5)。结果显示拯救的病毒与pACYC_EV71_FL产生的病毒在Vero细胞上产生的空斑形态相似。实验初步表明pACYC177-EV71-IUuC-FL拯救的PO代病毒与pACYC-EV71-FL拯救的PO代病毒具有相似的生物学特性。实施例5 带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆在制备病毒药物筛选中的应用(1)盐酸胍对Vero细胞的毒性分析，其步骤是在96孔细胞培养板中接种 2X IO4Vero细胞，在37°C，5% (v/v) CO2培养条件下，待汇合度达到90% ；吸弃每个孔中的 DMEM培养基，向各个孔中加入100 μ 1用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1、2、4、8、16、32 和 64mM)的盐酸胍，对照孔加 100 μ 1 含 2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培养基；培养48小时后，每孔加MTT溶液10 μ 1，在37°C，5% (v/v)CO2培养条件下继续孵育4h，然后加入溶解液，在37°C，5% (v/v)CO2培养条件下继续孵育4h，直至在普通光学显微镜下观察发现i^rmazan全部溶解；在570nm测定吸光值(图 6)，计算细胞存活率达到90 %以上时的盐酸胍的最大使用浓度，以该最大浓度作为盐酸胍对EV71的抑制实验中的最大使用浓度。实验结果表明当盐酸胍的浓度不大于2mM时，Vero 细胞的存活率不低于90%，因此，后续的实验中，盐酸胍的使用浓度为0、0. 0625,0. 125、 0.25,0. 5、1 和 2mM ；(2)带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆在制备病毒药物筛选中的应用盐酸胍对携带IUuc基因的EV71的抑制作用在96孔细胞培养板中接种2 X IO4Vero细胞，在37°C， 5% (v/v)CO2培养条件下，待汇合度达到90%时，分别向每孔加入pACYC177-EV71-Rluc-FL 转染Vero细胞后60h收集并保存于_80°C的病毒液，感染复数为1，37°C吸附Ih ；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基2倍系列稀释的盐酸胍(浓度分别为0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1和2mM) 100 μ 1 (已经报道对EV71具有抑制作用)，于37°C，5% (v/v) CO2的培养箱中培养Mh。通过对IUuc的活性检测发现随着GuHCL浓度的增加，Rluc的活性逐渐减弱，表明GuHCL与EV71的抑制关系呈现浓度依赖性。当GuHCL的浓度为ImM时，能完全抑制IUuc的活性(图7)。本实验表明本发明所有构建的pACYC177-EV71-IUuc-FL能够用于抗EV71的药物筛选研究。最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法， 并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种带有荧光素酶标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法，其步骤是(1)总RNA的提取取140ul的EV71病毒液，按照QIAamp Viral RNA试剂盒说明书的要求抽提EV71的RNA ；(2)EV71的 RT-PCR 扩增根据EV71基因的特性，将该基因分为了四个部分，分别命名为F1、F2、F3和F4，以步骤 ⑴中的总RNA为模版，采用RT-PCR分别获得DNA片段F1、F2、F3和F4，片段的序列为SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 所示，DNA 片段 Fl 的引物SEQ ID NO: 5 禾口 SEQ ID NO :6，DNA 片段 F2 的引物SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物 SEQ IDNO :9 禾口 SEQ ID NO : 10，DNA 片段 F4 的引物SEQ ID NO :11 禾口 SEQ ID NO :12。另外 SEQ ID NO 5含有T7RNA聚合酶启动子序列SEQ ID NO :13 ；RT-PCR 的反应体系均为PrimeScript 1 Step Enzyme Mix :2μ 1, 2 X IStepBuffer 25 μ 1，引物1 μ 1，引物1μ 1，模板RNA为3μ 1，无RNase水18μ 1 ；扩增条件为 500C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C 10min，28 个循环；(3)EV71亚克隆的构建将步骤O)中获得的片段F1、F2、F3、F4分别和载体pUC19连接，并将连接产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为 pUC19-Fl、pUC19-F2、pUC19-F3 和 pUC19_F4 ；(4)含有EV71基因的重组克隆的构建用BsiwI和HindIII酶切步骤(3)中获得的pUC19_Fl和pUC19_F2，回收pUC19_Fl的大片段和PUC19-F2的小片段，使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F1-F2 ；用SpeI和HindIII酶切步骤(3)中获得的pUC19_F3和pUC19_F4，回收pUC19_F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PUC19-F3-F4 ；用 AatII 和 HindIII 酶切 pUC19_Fl_F2 和 pUC19_F3_F4，回收 pUC19_Fl_F2 的大片段和PUC19-F3-F4的大片段的大片段，使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态 HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为 PUC19-F1-F2-F3-F4 ；用^CbaI和HindIII酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和经过酶切的pACYC177，使用浓度为1 % (w/v) 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PACYC-EV71-FL ；(5)带有IUuc标签的EV71全长感染性克隆的构建为了获得IUuc基因片段，基因序列为SEQ ID NO 14所示，设计引物SEQ IDNO=I5,SEQID NO 16扩增Rluc基因片段；将获得的IUuc基因片段和步骤(4)中的pACYC177-EV71-FL分别为用SphI和MluI酶切，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的mUC基因片段和pACYC177-EV71-FL，使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的产DNA片段，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pACYC177-EV71-muc-FL。
2.根据权利要求1所述的一种带有荧光素酶标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法，其特征在于所述的EV71病毒5’端非编码区上游区域插入了 T7 RNA聚合酶的启动子序列，启动子序列为SEQ ID NO 13所示。
3.权利要求1所述的一种带有荧光素酶标签的EV71型全长感染性克隆在制备病毒的能力中的应用。
4.权利要求1所述的一种带有荧光素酶标签的EV71型全长感染性克隆在筛选抗EV71 病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种带有荧光素酶标签的EV71全长感染性克隆的制备方法及应用，属于生物技术领域。其步骤是(1)总RNA的提取；(2)EV71的RT-PCR扩增；(3)EV71亚克隆的构建；(4)含有EV71基因的重组克隆的构建(5)带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆的构建。通过细胞病变、Rluc活性的检测、病毒蚀斑和药物抑制等实验证明成功获得带有标签的EV71全长感染性克隆。本发明在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。
文档编号C12Q1/70GK102559754SQ20111044437
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者史佩勇, 商宝娣, 张波, 袁志明, 许文波, 贾凡, 邓成林 申请人:中国科学院武汉病毒研究所