专利名称：新的水解酶蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于(1S，2S)-1-烷氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的制备的新的水解酶蛋白及其用途。
背景技术：
(1S，2S)-1_烷氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸为对正在作为丙型肝炎治疗药开发的各种HCV NS3蛋白酶抑制剂等的制备有用的中间体。在非专利文献I中记载有将2-こ烯基环丙烷-1，I- ニ甲酸ニ甲酯通过酶水解，制得(1S，2S)-I-甲氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的方法，但酶的光学选择性不足，制得的(1S，2S)-1-甲氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的光学纯度为90% e. e.，不适合作为药品中间体的エ业制备方法。另外，枯草芽孢杆菌subtilis) ATCC23857的基因组序列众所周知，源于该枯草芽孢杆菌ATCC23857株的对硝基苄基酯酶(以下有时称为“PNBE23857”)的氨基酸序列登记于GenBank登录号ZP_03593235中。先前技术文献 非专利文献
非专利文献 I :c. Fliche 等，Synth. Commun. 24(20), 2873-2876 (1994)。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题在于，提供用于将2-こ烯基环丙烷-1，I-ニ甲酸ニ烷基酯通过酶水解，有效制得可用作丙型肝炎治疗药制备用中间体的(1S，2S)-I-烷氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的新的水解酶蛋白。解决课题的手段
本发明人为解决上述课题而深入研究的结果发现源于枯草芽孢杆菌的对硝基苄基水解酶蛋白可以良好的选择性水解2-こ烯基环丙烷-1，I-ニ甲酸ニこ酷，有效制得(IS, 2S)-1-こ氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸。另外，当根据已知的源于枯草芽孢杆菌的对硝基节基水解酶蛋白的DNA序列/[目息，克隆近未的枯草芽抱杆菌所具有的对硝基节基水解酶基因，确认该基因所编码的对硝基苄基水解酶蛋白的活性时，成功获得以高于已知的对硝基苄基水解酶蛋白的选择性催化上述水解反应的新的同源物。此外，当根据对硝基节基水解酶蛋白的已知的立体结构信息，进行上述新的同源物的同源建模(homologymodeling)，进行相对于底物结合部位附近的氨基酸残基的诱变试验时，成功制备以更高的选择性催化上述水解反应的水解酶蛋白。本发明基于上述见解完成。即，根据本发明，提供以下发明。[I]水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含如序列号2 5的任一项所示氨基酸序列，具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
权利要求
1.水解酶蛋白，所述蛋白包含如序列号2飞的任一项所示氨基酸序列，具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
2.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列号1飞的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、106号、107号、108号、219号、270号、271号、272号、273号、274号、275号、276号和313号氨基酸中I个以上被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
3.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列号1飞的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号188号、190号、193号、215号、216号、217号、314号、358号、362号和363号氛基酸中I个以上被侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
4.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列号1飞的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、106号、107号、108号、219号、270号、271号、272号、273号、274号、275号、276号和313号氨基酸中I个以上被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代，且氨基酸编号188号、190号、193号、215号、216号、217号、314号、358号、362号和363号氨基酸中I个以上被侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
5.权利要求2或4的水解酶蛋白，其中，在如序列号Γ5的任一项所示氨基酸序列中，至少氨基酸编号70号、270号、273号和313号氨基酸中I个以上氨基酸被取代。
6.权利要求5的水解酶蛋白，其中，在如序列号1飞的任一项所示氨基酸序列中，至少氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸中的任ー氨基酸所取代。
7.权利要求5或6的水解酶蛋白，其中，在如序列号3或4所示氨基酸序列中，氨基酸编号270号的亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
8.权利要求5或6的水解酶蛋白，其中，在如序列号1、2或5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号270号的异亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
9.权利要求5 8中任ー项的水解酶蛋白，其中，在如序列号f5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号273号的亮氨酸被精氨酸或组氨酸中的任一氨基酸所取代。
10.权利要求5、中任ー项的水解酶蛋白，其中,在如序列号I、的任一项所不氨基酸序列中，氨基酸编号313号的亮氨酸被甲硫氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的任一氨基酸所取代。
11.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列号4所示氨基酸序列中氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸所取代，270号的亮氨酸被谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任ー氨基酸所取代，第273号的亮氨酸被精氨酸所取代，且第313号的亮氨酸被甲硫氨酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
12.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含与权利要求f11的水解酶蛋白的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列，或相对于权利要求f 11的水解酶蛋白的氨基酸序列具有广数个氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
13.DNA，所述DNA编码权利要求1 12中任ー项的水解酶蛋白。
14.权利要求13的DNA，所述DNA包含以下碱基序列(a)序列号7 10中记载的碱基序列；(b)碱基序列，其为可与包含序列号7 10中记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，编码以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性；或(c)碱基序列，其为在序列号7 10中记载的碱基序列中具有f数个碱基的取代、缺失和/或添加的碱基序列，编码以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性；
15.(IS, 2S)-I-烷氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的制备方法，所述制备方法包括使权利要求广12中任ー项的水解酶蛋白作用于2-こ烯基环丙烷-1，I-ニ甲酸ニ烷基酯制备(IS, 2S) -I-烧氧基擬基-2-こ烯基环丙烧甲酸。
全文摘要
本发明的课题在于提供用于将2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯通过酶水解，有效制得可用作丙型肝炎治疗药合成中间体的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的新的水解酶。根据本发明，可提供包含如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列，具有以高于包含如序列号1所示氨基酸序列的蛋白质的选择性，催化由2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二乙酯向(1S,2S)-1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的反应的活性的水解酶蛋白。
文档编号C12P41/00GK102834515SQ201180009868
公开日2012年12月19日 申请日期2011年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者川端润, 三宅良磨, 朝田久仁子, 加藤良平 申请人:株式会社Api