专利名称：具有因子ix活性的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有凝血因子IX(FIX)活性的融合蛋白。更特别地，本发明涉及包含FIX和转铁蛋白的融合蛋白(其表现出的比活性为非融合和天然FIX的比活性的两倍)、编码所述融合蛋白的基因、包含所述基因的重组载体以及包含所述重组载体的宿主细胞。
背景技术：
血友病是由X染色体上的遗传性基因突变导致凝血因子缺陷所引起的出血性疾病。凝集是阻止损伤的血管失血的过程，其中损伤的血管壁被含纤维蛋白的凝块覆盖，所述凝块通过与多种凝集因子相关的复杂凝集级联形成。在凝集因子中，在因子VIII (本文称SFVIII)和因子IX(FIX)缺陷时，它们分别与血友病A和B的发病有关。当FIX缺陷或失活的程度使得凝块形成的凝集级联不发生时，则发生血友病B。为了治疗血友病B，根据凝集因子的水平和出血类型施用不同量的FIX。为了用于治疗血友病B, FIX通常可通过两种方法产生:从人血中纯化和基因重组。虽然重组蛋白质可大量 生产，但是其活性和稳定性比通过血浆分级得到的蛋白质差。对重组蛋白质已做出了多种尝试(包括随机突变、结构-活性关系比较、PEG化和η-糖基化)以克服所述缺点，但是它们中的大多数不能实现特别的效果。转铁蛋白是运输铁通过血液的血浆蛋白。这种血浆蛋白是血液中的第三大富含蛋白，半衰期为8天，该半衰期相对来说是长的(虽然比白蛋白或免疫球蛋白G(IgG)的半衰期短)，并且转铁蛋白的特征在于受体介导的循环。虽然已有数种采用转铁蛋白作为融合伴侣的融合蛋白，但是在已公开的任何报道中既没有报道将转铁蛋白用于与FIX融合也没有报道其作用。因此，本发明人致力于提高FIX的活性和稳定性；并且发现与非融合、天然FIX相t匕，当与转铁蛋白直接或经接头连接时，FIX的比活性和血液稳定性显著增加，由此实现了本发明。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供保持天然因子IX之生物活性的融合蛋白。本发明的另一个目的是提供编码所述融合蛋白的基因。本发明的又一个目的是提供包含所述基因的重组载体。本发明的再一个目的是提供包含所述重组载体的宿主细胞。根据其一方面，本发明提供了包含人源因子IX(FIX)和人源转铁蛋白的融合蛋白。根据其另一方面，本发明提供了编码所述融合蛋白的基因。根据其又一方面，本发明提供了包含所述基因的重组载体。根据其再一方面，本发明提供了在其中包含所述重组载体的宿主细胞。
通过本发明的以下描述并结合附图，本发明的以上和其他目的和特征将变得显而易见，所述附图分别示出:图1a:阐明使用重叠PCR构建FIX片段的过程的示意图；图1b:阐明内含子I的结构和构建片段B的过程的示意图；图2:阐明由分别携带编码FIX(KOI)之cDNA和编码转铁蛋白(Tf)之cDNA的载体构建FIX-Tf表达载体的过程的示意图；图3:阐明构建FIX(KOI)-GSl-Tf表达载体的过程的示意图；图 4:阐明构建 FIX (KOI)-GS 卜 THR-GS 卜 Tf、FIX (KOI)-GS15-Tf、FIX (KOI) -GS7-THR-GS7-Tf, FIX (KOI)-GS7-FXa-GS7_Tf 和 FIX (KOI)-GS7-FXIa-GS7_Tf 表达载体的过程的示意图；图5:阐明构建 FIX (KOI)-GSl-FXa-Tf 和 FIX (KOI)-GSl-FXIa-Tf 表达载体的过程的不意图；图6:阐明构建FIX(K0I)-G6V-白蛋白表达载体的过程的示意图；图 7 =FIX(KOI)-Tf ( 不含接头)、FIX(KOI)-GSl-Tf, FIX (KOI) -GSl-THR-GSl-Tf,FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7_Tf、FIX (KOI)-GS7-FXa-GS7_Tf、FIX (KOI) -GS7-FXIa-GS7-Tf, FlX(KOI)-GSl-FXa-Tf, FIX (KOI)-GSl-FXIa-Tf 和 FIX(KOI)表达载体的Western印迹；图8a:示出如通过ELISA和显色活性测定所分析的由FIX (KOI) -Tf (不含接头)、FIX (KOI)-GS卜Tf、FIX (KOI)-GS卜THR-GS卜Tf、FIX (KOI)-GS15-Tf、FIX (KOI) -GS7-THR-GS7-Tf、FIX (KOI) -GS7-FXa-GS7_Tf、FIX (KOI) -GS7-FXIa-GS7_Tf、FIX (KOI)-GSl-FXa-Tf、FIX (KOI)-GSl-FXIa-Tf、FIX (KOI)-G6V-白蛋白、FIX(KOI)和pcDNA3.1/hygro表达载体表达之融合蛋白的FIX活性的图；图8b:示出在图8a结果的基础上计算的FIX比活性的图；图8c:示出如通过ELISA和显色活性测定所测量由FIX (KOI)-GSl-THR-GSl-Tf、FIX (KOI) -GSl-THR-GSl-del-Tf ,FIX (KOI)和 pcDNA3.1/hygro 表达载体表达之融合蛋白的FIX活性的图；和图8d:示出在图8c结果的基础上计算的FIX比活性的图。
发明详述下文详细描述本发明。本发明提供了包含因子IX(FIX)和转铁蛋白的融合蛋白。在本发明融合蛋白中使用的FIX和转铁蛋白可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。更优选地，所述FIX和转铁蛋白与其各自的天然蛋白质有95%或更高的同源性。最优选地，所述FIX和转铁蛋白分别具有SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可包含FIX和转铁蛋白的功能等价物或衍生物。“功能等价物”可以在SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列上具有一个或更多个氨基酸缺失、插入、非保守或保守替换或其组合，只要所述突变不引起负责FIX生物活性之活性部位或结构域的实质改变，则其可在任何序列位置中发生。根据情况，本发明的融合蛋白可经历这些修饰以升高或降低其物理和化学性质，例如磷酸化、硫酸化、丙烯酸化(^I^EL^^^acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等。只要它们保持FIX的基本生物活性，则所修饰的融合蛋白在本发明的范围内。 在本发明的融合蛋白中，转铁蛋白的N端可连接至FIX的C端。或者，本发明的融合蛋白还可在FIX与转铁蛋白之间包含接头。也就是说，FIX的C端可通过接头连接至转铁蛋白的N端。通过使两种融合伴侣之间的潜在干扰最小，接头可增加融合蛋白的FIX的活性。所述接头优选是长度为I至100个氨基酸的肽，但不限于此长度。只要它将融合蛋白中的FIX与转铁蛋白分隔开，可采用任何肽作为本发明的接头。虽然对接头的氨基酸序列没有具体限制，但是其可优选地包含重复或随机模式的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。例如，所述接头可优选地包含氨基酸序列(GGGGS)n (其中N是I或更大的整数，优选I至20)，更优选SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列(参见表2)。而且，所述接头可具有可被大量存在于损伤组织中的蛋白酶识别并消化的切割位点。选自凝血酶、因子Xa和因子XIa的蛋白酶可识别消化位点。在作用位点上，包含具有这种蛋白酶消化位点的接头的融合蛋白被分为融合伴侣，FIX和转铁蛋白，它们可执行其各自的功能。优选地，所述接头具有SEQ ID NO:5至11中任一个的氨基酸序列(参见表2)。根据本发明的FIX-转铁蛋白融合蛋白具有为非融合、天然FIX的至少1.5倍的FIX比活性。在一个实施方案中，发现本发明的融合蛋白表现出的FIX比活性为与非融合、天然FIX相比的约0.5至2倍(参见表3-1和3-2，和图7B和7D)。根据其另一方面，本发明提供了编码所述融合蛋白的基因。编码本发明融合蛋白的基因在不改变融合蛋白氨基酸序列的程度内可在编码区中有多种修饰(由于密码子简并性或者考虑到待表达其的生物体优选的密码子)，并且多种修饰或改变甚至可引入除编码区之外的区域中，只要它们对基因的表达没有影响。突变基因也在本发明范围内。优选地，所述基因可包含部分FIX内含子的以增加FIX表达。更优选地，所述基因可包含FIX内含子15’端区域的981bp序列和FIX内含子13’端区域的443bp序列，两个序列均插入到FIX外显子I的第88位碱基位点处。在一个实施方案中，本发明的基因可包含编码接头的基因。在本发明中，编码融合蛋白的基因优选具有SEQ ID NO: 12至21之一的核苷酸序列。根据本发明的编码融合蛋白的基因可由表达载体携带。因此，本发明提供了包含编码融合蛋白的基因的重组表达载体。本文使用的术语“载体”指用于将编码融合蛋白的DNA引入宿主细胞并在宿主细胞中表达融合蛋白的运载体。可采用常规载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体，优选质粒载体。根据目的，可构建合适的表达载体以使其包含用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列以及调控序列，例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号、增强子等。当应用基因构建体时，起始密码子和终止密码子必须起作用并且与编码序列同框。此外，所述表达载体可包含用于选择转化有表达载体的宿主细胞的选择标记物，以及在可复制表达载体的情况下的复制起点。所述载体可自主复制或者可整合入宿主细胞的染色体中。
特别地，根据本发明的重组表达载体可通过将编码融合蛋白的基因插入到pcDNA3.1-hygro载体中来构建。另外，本发明提供了经用于表达融合蛋白的重组表达载体转化的宿主细胞。因为宿主细胞在表达水平和蛋白质修饰方面彼此不同，所以选择最适用于本发明目的的宿主细胞是重要的。用于本发明的宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾细胞(HEK293)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21)和人肝癌细胞系0fepG2)，但不限于此。可使用本领域已知的常规技术将本发明的重组表达载体引入到宿主细胞中，所述技术的实例包括电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(CaPO4)共沉淀和氯化钙(CaCl2)沉淀，但不限于此。根据本发明的具有FIX活性的融合蛋白表现出比天然FIX更高的FIX生物活性，因此可有用地应用于治疗FIX缺陷相关疾病。以下实施例旨在进一步阐明本发明，而不限制其范围。下文中， 通过以下实施例更具体地描述本发明，但是提供它们仅是为了说明目的并且本发明不限于此。
实施例1:构建FIX表达载体为了用于构建FIX表达载体(如图1A所示)，制备编码FIX蛋白的多核苷酸片段E。通过将FIX内含子的部分插入到FIX外显子来产生片段E以增加FIX的表达效力。为此，将FIX内含子15’和3’端各自的981和443bp序列插入FIX外显子I的第88位碱基位置处(JBC，第270卷，第5276-5281页)。以下将给出该方法的详细描述。
〈1-1>片段A的产生将FIX (Kozak+ORF)插入到 pcDNA3.1/Hygro/lacZ 载体(Invitrogen)中以得到重组载体，命名为pcDNA3.1 FIX pDNA。具体地,合成包含Kozak序列(gccaccatggag)的正义引物(Fl, SEQ ID NO:22)和反义引物(R1, SEQ ID NO:23)并用于在H印G2中进行PCR以得到 FIX (kozak+ORF)。在 pfu turbo DNA 聚合酶(Invitrogen, 2.5 单位 / μ L#600252)的存在下进行PCR，在56°C退火并在68°C延伸3分钟，进行30个循环。将由此得到的PCR产物克隆到pGEM T-easy载体(Promega,Madison,WI,货号A1360)中用于碱基测序。当该载体充当模板时，使用正义引物(F2，SEQ ID NO:24)和反义引物(R2，SEQ ID NO:25)通过PCR 扩增 FIX (kozak+ORF)插入物。在 pfu turbo DNA 聚合酶(Invitrogen, 2.5 单位 / μ L#600252)的存在下进行PCR，在58 °C退火并在68 °C延伸3分钟，进行30个循环。在经BamHI/SpeI消化后，使用T4DNA连接酶(Takara，#2011A)使插入物连接至先前经BamHI/Xbal处理的 pcDNA3.Ι/Hygro/lacZ，以得到重组表达载体，命名为 “pcDNA3.1-hygro-FIX (KOI) ”。使pcDNA3.1FIX pDNA 充当模板，在 pfu turbo DNA 聚合酶(Invitrogen, 2.5 单位/μ L #600252)存在下使用正义引物(F3，SEQ ID NO:26)和反义引物(R2，SEQ ID NO:25)通过PCR扩增图1a的片段Α。在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen, 2.5单位/ μ L#600252)存在下进行PCR，在58°C下退火并在68°C下延伸2分钟，进行30个循环。
〈1-2>片段B的产生根据图1b中阐明的方法，图1b的片段B (由“内含子Fl的部分+内含子F2”构成)由FIX的内含子1(由“内含子Fl+Χ+内含子F2”构成)产生。具体地，在pfu turboDNA聚合酶(Invitrogen，2.5单位/μ L #600252)存在下使用正义引物(F4，SEQ ID NO:27)和反义引物(R3，SEQ ID NO:28)对HEK 293基因组DNA进行PCR，在58°C下退火并在68°C下延伸2分钟，进行30个循环，以得到内含子F2 PCR产物。使该内含子F2 PCR产物充当模板，在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen, 2.5单位/ μ L#600252)存在下使用正义引物(F5，SEQ ID NO:29)和反义引物(R3，SEQ ID NO:28)进行PCR，在58°C下退火并在68°C下延伸2分钟，进行30个循环，以得到由内含子Fl的部分和内含子F2组成的片段B。
<1-3>片段C的产生在pfu turbo DNA 聚合酶(Invitrogen, 2.5 单位 / μ L #600252)存在下使用正义引物(F5，SEQ ID NO:29)和反义引物(R2，SEQ ID NO:25)通过PCR由分别得自于实施例<1-1>和〈1-2>的片段A和B扩增由内含子Fl的部分、内含子F2和外显子F2组成的片段C。使用 pfu turbo DNA 聚合酶(Invitrogen，2.5 单位 / μ L #600252)进行 PCR，在 58°C退火并在68°C延伸3分钟，进行30个循环。
<1-4>片段D的产生使用正义引物(F6，SEQ ID NO:30)和反义引物(R4，SEQ ID NO:31)通过PCR由HEK 293基因组DNA中扩增由外显子Fl和内含子Fl组成的片段D。在pfu turbo DNA聚合酶(11^行1"08611，2.5单位/^1^ #600252)存在下进行PCR，在58°C下退火并在68°C下延伸2分钟，进行30个循环。
<1-5>片段E的产生在pfu turbo DNA 聚合酶(Invitrogen, 2.5 单位 / μ L #600252)存在下使用正义引物(F6 ；SEQ ID NO:30)和反义引物(R2，SEQ ID NO:25)通过PCR由分别得自于实施例〈1-3>和〈1-4>的片段C和D扩增片段E。进行PCR，在58°C退火下并在68°C下延伸3分钟，进行30个循环。将PCR产物克隆到pGEM T-easy载体(Promega，Madison, WI，货号A1360)中并进行碱基测序。片段E由Kozak序列、ORF和内含子I的部分构成，并且命名为“FIX (KOI) ”。
<1-6>表达载体的构建
开始在980C下维持30秒以变性之后,在Phusion 高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2单元/yL，#F-530S)存在下使用正义引物(F2，SEQ ID NO:24)和反义引物(R5，SEQ IDNO: 32)对得自于实施例〈1-5>的FIX(KOI)进行PCR，在98°C下10秒，在58 °C下45秒，在72°C下2分钟，进行30个循环，然后在72°C下进行最终的延伸7分钟。用BamHI和XhoI处理由此得到的PCR产物，然后使用T4DNA连接酶(Takara，#2011A)连接至之前经相同酶消化的 pcDNA3.Ι/hygro 载体，以构建重组表达载体 “pcDNA3.1-hygro-FIX (KOI) ”。在用于构建FIX(KOI)表达载体的PCR中使用的引物归纳于下表I中。
[表I]
权利要求
1.融合蛋白，其包含人源因子IX(FIX)和人源转铁蛋白。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述FIX是具有SEQID NO:1的氨基酸序列的多肽或其功能等价物。
3.权利要求2的融合蛋白，其中所述功能等价物具有与FIX基本相同的功能活性，并且在SEQ ID NO:1的所述氨基酸序列上具有一个或更多个氨基酸插入、缺失或替换。
4.权利要求1的融合蛋白，其中所述转铁蛋白是具有SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽或其功能等价物。
5.权利要求4的融合蛋白，其中所述功能等价物具有与转铁蛋白基本相同的功能活性，并且在SEQ ID NO:2的所述氨基酸序列上具有一个或更多个氨基酸插入、缺失或替换。
6.权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白在所述FIX与所述转铁蛋白之间包含接头。
7.权利要求6的融合蛋白，其中所述接头是由氨基酸序列(GGGGS)n表示的肽，其中N是I至20的整数。
8.权利要求7的融合蛋白，其中所述接头是由SEQID NO:3或4的氨基酸序列表示的肽。
9.权利要求7的融合蛋白，其中所述接头还包含蛋白酶的切割识别位点，所述蛋白酶选自凝血酶、因子Xa和因子XIa。
10.权利要求9的融合蛋白，其中所述接头是由SEQID NO:5至11的氨基酸序列中的任何一个表示的肽。
11.基因，其编码权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白。
12.权利要求11的基因，其中所述基因具有SEQID NO: 12至21中任何一个的核苷酸序列。
13.重组载体，其包含权利要求12所述的基因。
14.宿主细胞，其中包含权利要求13所述的重组载体。
15.权利要求14的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自CHO细胞、BHK-21细胞、HEK293细胞和HepG2细胞。
全文摘要
本发明涉及包含凝血因子IX(FIX)和转铁蛋白的融合蛋白。本发明的融合蛋白具有比天然FIX更大的比活性，因此可用于使用FIX的治疗中。
文档编号C12N15/63GK103180344SQ201180050731
公开日2013年6月26日 申请日期2011年10月19日 优先权日2010年10月20日
发明者李旼宣, 金薰泽, 李峰镛, 朴万勋, 林允挺 申请人:Sk化学公司