专利名称：一种分子生物学与形态学相结合鉴定鱼类早期个体的方法
技术领域：
本发明属于鱼类早期资源研究领域，更具体涉及一种适用于对鱼类早期资源样品进行大规模种类鉴定的方法。
背景技术：
通过鱼类早期资源量的调查研究，可以获得鱼类产卵场和早期栖息地的分布、早期资源的数量、早期个体生长发育等资料，并可以对鱼类繁殖群体数量进行估算，预测鱼类资源量变动、分析影响鱼类早期存活和种群年际强度的内在机制和环境条件，对鱼类资源的保护和合理开发与利用具有重要意义。准确地鉴定鱼类早期阶段个体的种类，是鱼类早期资源相关研究的基础和主要技术瓶颈。我国已有的关于鱼类早期阶段个体种类鉴定和形态特征资料，主要是通过野外采集卵或仔鱼，人工饲养到稚鱼阶段，直至能利用形态特征确定种类，并获得种类个体发育过程的系列形态特征。通常，鱼卵、仔鱼的野外采集条件恶劣、饲养环境简陋，且饲养过程耗费大量人力、物力，不适宜广泛应用；此外，由于鱼类在早期生活史阶段的死亡率极高，饲养条件下一些种类的鱼卵和仔鱼在发育到能利用形态特征确定种类之前就已经全部死亡，导致该方法能鉴定的种类非常有限。利用分子生物学方法进行的物种鉴定，克服了形态学方法鉴定主观性强的缺点， 同时还具有灵敏度高、重复性好等优点，已在鱼类种类鉴定中广泛应用。然而分子生物学方法也存在DNA提取、扩增耗时长的缺点，且检测基因序列的费用较高，不适宜对大量的样品进行逐一鉴定。分子生物学方法与形态学方法相结合，采用分子生物学方法对具有一定形态特征的早期阶段个体进行准确鉴定，总结可用于种类鉴定的形态特征，建立形态特征检索表，再利用形态特征检索表对其它样品进行种类识别，并采用分子生物学方法进行验证， 能显著提高鱼类早期资源大规模种类鉴定的准确率，彻底解决先前种类鉴定的诸多难点。福尔马林溶液(甲醛)具有良好的防腐、固定效果，且廉价易得，是鱼类早期资源调查中被广泛使用的保存液。由于福尔马林对DNA分子的化学修饰作用，会给样品的DNA 提取和扩增带来较大困难，因此用于分子生物学研究的样品通常使用乙醇(70%或95% ) 固定保存。然而乙醇强烈的脱水作用会导致样品收缩、变硬，形态发生显著改变，不利于形态学观察。建立一种既能很好地保存样品的形态特征，又能相对容易地提取、扩增样品DNA 的鱼卵、仔鱼样品保存方法，是应用分子生物学方法与形态学方法相结合，对鱼类早期资源进行种类鉴定的前提。
发明内容
本发明的目的在于，针对鱼类早期资源研究中样品的种类鉴定难题，提供了一种分子生物学与形态学相结合鉴定鱼类早期个体的方法，方法易行，操作简便，该方法将分子生物学方法与形态学方法有机地结合起来，解决了种类鉴定的技术难题，为鱼类早期资源的研究提供了技术支持。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案一种分子生物学与形态学相结合鉴定鱼类早期个体的方法，其步骤是1.数据库建立在调查水域采集可以准确鉴定种类的样品保存于乙醇中，常规方法提取DNA、扩增mtDNA的COI基因片段并测序，同时搜集已发表的数据，建立该水域鱼类的 barcoding 数据库。通用引物序列正向引物FiShFl 5 ‘ TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3 ‘正向引物Fi shF2 5 ‘ TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3 ‘反向引物Fi shRl 5 ‘ TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA3 ‘反向引物Fi shR2 5 ‘ ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA3 ‘2.样品保存将采集的样品保存于4% (体积比)福尔马林(添加0. 35g/l硼酸钠或10g/l乙酸钠)保存液中。3.样品形态分组在解剖镜下将不能准确确定种类的样品依据形态特征归类，从每一类中选取具有代表性的个体进行显微拍照，记录形态特征(体型，色素分布，肌节数， 体长，体高，头高，眼径，吻长，肛前长)。4.分子生物学鉴定将选出的样品提取DNA、扩增mtDNA的COI基因片段并测序； 将测序结果与barcoding数据库中的序列进行比对，确定种类。(I)DNA 提取a.样品放入离心管中加入GTE溶液(甘氨酸100mmol/l、Tris 10mmol/l、EDTA lmmol/1)浸泡70-74小时，每隔7-9小时更换一次GTE溶液；浸泡期间样品保存于4°C的冰箱中；b.浸泡完成后，样品在室温下风干；c.加入 Iml GTE 溶液，95°C水浴 14-16 分钟；d.将样品转入灭菌离心管中，加入 STE 100 μ KNacl 0. lmol/1、Tris 10mmol/l、 EDTA 100mmol/l) ,SDS 15μ 1(10% ),DTT 5 μ 1 (100mmol/l)，蛋白酶 K20 μ 1 QO μ g/μ 1)；e. 55°C水浴Mh，至溶液澄清(前2小时每15min颠倒混勻一次，12h后，视情况可再加入蛋白酶K 10μ 1)；f.加入 160 μ 1 的 TE (Tris 10mmol/l、EDTA lmmol/1)混勻；g.加入等体积的NaCl溶液(6mol/l)，充分混勻，离心15min (12000r/min)，取上清液；h.加入等体积异丙醇，-20°C静置过夜；i.离心 15min(12000r/min)，弃上清液；j.使用70 % (体积比)乙醇洗涤DNA —次，室温下干燥；k.加入30 μ 1 TE后，置于4°C冰箱中使DNA充分溶解。(2)目的片段的扩增 反应体系总体积40 μ 1，含10 X PCR缓冲液4 μ 1，Mg2+ 3. 2 μ 1 (25mM)，Taq聚合酶 2μ 1(5U)，正、反向引物各 1μ I(IOmM), dNTP 1. 2 μ 1 (IOmM)，模板 DNA4 μ 1 (IOOng)，无菌水补足至40 μ 1。 采用的通用引物序列
正向引物FishFl5'TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3‘
正向引物FishF25'TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3‘
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扩增条件为:94°C 5min ；40个循环下列程序-MV lmin，52°C lmin，72°C lmin，最
后 72°C延伸 IOmin05.形态学鉴定依据步骤3中记录的样品形态特征及其照片，总结可用于种类鉴定的形态特征，再依形态特征对其它样品进行种类鉴定。6.鉴定结果的分子生物学验证对步骤5中依据形态特征鉴定出的种类随机选取部分样品(1% -10% )重复步骤4进行检验。本发明具有的优点在于1)筛选出了适合于形态学与分子生物学研究的保存液；2)采用分子方法鉴定出种类的同时，亦可获得其完整的形态特征。将分子生物学和形态学鉴定方法有机地结合，解决了快速、准确、大规模鉴定鱼类早期阶段个体的技术难题。
图IA鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IA为4%甲醛处理组图IB鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IB为4%甲醛+磷酸盐处理组图IC鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IC为4%甲醛+硼酸钠处理组图ID鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图ID为4%甲醛+乙酸钠处理组图IE鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IE为4%甲醛+EDTA处理组图IF鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IF为0. 1倍FCC处理组图IG鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IG为7%甲醛处理组图IH鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IH为7%甲醛+磷酸盐处理组图II鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图II为10%甲醛处理组图IJ鲫仔鱼样品在各种保存液中保存20天后的形态示意图。图IJ为4%甲醛固定12h后，70%乙醇保存处理组图2为一种出膜一周鲫仔鱼在10种保存液中保存20天后mtDNA的COI基因片段扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图。
5
1-2为4%甲醛处理组；3-4为4%甲醛+磷酸盐处理组；5_6为4%甲醛+硼酸钠处理组；7-8为4%甲醛+乙酸钠处理组；9-10为7%甲醛处理组；11-12为7%甲醛+磷酸盐处理组；13-14为10%甲醛处理组；15-16为4%甲醛+EDTA处理组；17-18为0. 1倍FCC 处理组；19-20为4%甲醛+乙酸钠固定12h后70%乙醇保存处理组；M为标记DL2000。
具体实施例方式一种分子生物学与形态学相结合鉴定鱼类早期个体的方法，其步骤是1.数据库建立在进行鱼类早期资源调查的同时，搜集能准确鉴定种类的样品并保存于95% (体积比)的乙醇中，采用常规的DNA提取扩增方法，利用通用引物(引物序列如下)，获得mtDNA COI基因片段并测定序列；同时搜集已发表的相同水域鱼类的mtDNA COI基因片段；建立该水域鱼类的barcoding数据库。通用引物序列正向引物FishFl 5 ‘ TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3 ‘正向引物Fi shF2 5 ‘ TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3 ‘反向引物Fi shRl 5 ‘ TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA3 ‘
反向引物 Fi shR2 5 ‘ ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA3 ‘2.样品保存将采集的仔稚鱼保存于4%的福尔马林(添加0.35g/l硼酸钠或 10g/l乙酸钠)保存液(见表1)中带回实验室。3.样品形态分组在解剖镜下将不能准确确定种类的样品依据形态特征归类，从每一类中选取具有代表性的个体进行显微拍照(见图1)，记录其形态特征(例如未定种 1，体型常见，头部、腹部、肌节上下缘、尾部均分布有大量星状色素，肛门位于身体约71% 处，肌节数21+13，体长5. 98毫米，体高0. 94毫米，头高1. 04毫米，肛前长4. 26毫米，眼径
0.43毫米，吻长0. 28毫米)。4.分子生物学鉴定对步骤3中选取的样品进行下列处理(I)DNA 提取a.样品放入离心管中加入GTE溶液(甘氨酸100mmol/l、Tris 10mmol/l、EDTA lmmol/1)浸泡70-74小时，每隔7-9小时更换一次GTE溶液；浸泡期间样品保存于4°C的冰箱中。b.浸泡完成后，样品在室温下风干。c.加入Iml GTE溶液，95°C水浴15分钟。d.将样品转入灭菌离心管中，加入 STE 100 μ 1 (Nacl 0. lmol/1、Tris IOmmol/
1,EDTA 100mmol/l), SDS 15 μ 1(10% ), DTT 5 μ 1 (10(toimol/l)，蛋白酶 K 20 μ 1 (20 μ g/ μ 1) οe. 55°C水浴Mh，至溶液澄清(前2小时每15min颠倒混勻一次，12h后，视情况可再加入蛋白酶K 10 μ 1)。f.加入 160 μ 1 的 TE (Tris 10mmol/l、EDTA lmmol/1)混勻。g.加入等体积的NaCl溶液(6mol/l)，充分混勻，离心15min (12000r/min)，取上清液。h.加入等体积异丙醇，-20°C静置过夜。
i.离心 15min(12000r/min)，弃上清液。j.使用70% (体积比)乙醇洗涤DNA —次，室温下干燥。k.加入30 μ 1 TE后，置于4°C冰箱中使DNA充分溶解。(2)目的片段的扩增反应体系总体积40 μ 1，含10XPCR缓冲液4 μ 1，Mg2+3. 2 μ 1 (25mM)，Taq聚合酶 2μ 1(5U)，正、反向引物各 1μ l(10mM)，dNTP 1· 2 μ 1 (IOmM)，模板 DNA4 μ 1 (IOOng)，无菌水补足至40 μ 1。采用的通用引物序列正向引物FishFl 5 ‘ TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3 ‘
正向引物 Fi shF2 5 ‘ TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3 ‘反向引物Fi shRl 5 ‘ TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA3 ‘反向引物Fi shR2 5 ‘ ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA3 ‘扩增条件为94°C5min ；40 个循环下列程序94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin0(3)扩增产物测序扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增成功的样品送测序公司进行测序〔见图 2 ；附录碱基序列(这些序列可以在以下网站的数据库中进行比对http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi ？ PROGRAM = blastn&BLAST_PROGRAMS = megaBlast&PAGE_TYPE =Blastkarch&SHOW_DEFAULTS = on&LINK_L0C = blasthome，结果显示，申请人实验得到的序列均为鲫mtDNA的COI基因片段)〕。(4)种类的确定将样品的测序结果与建立的barcoding数据库序列进行比对，确定种类。5.形态学鉴定依据步骤3中记录的样品形态特征及其照片，总结可用于种类鉴定的形态特征，再依形态特征对其它样品进行种类鉴定。6.鉴定结果的分子生物学验证对步骤5中依据形态特征鉴定出的种类随机选取部分样品(1% -10% )重复步骤4进行检验。表1.出膜一周鲫仔鱼在10种保存液中保存20天后的筛选结果
权利要求
1. 一种分子生物学与形态学相结合鉴定鱼类早期个体的方法，其步骤是A、数据库建立在调查水域采集可以准确鉴定种类的样品保存于乙醇中，常规方法提取DNA、扩增mtDNA的COI基因片段并测序，同时搜集已发表的数据，建立该水域鱼类的 barcoding 数据库；通用引物序列正向引物 FishFl 5 ‘ TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 3 ‘ 正向引物 Fi shF2 5 ‘ TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC 3 ‘ 反向引物 Fi shRl 5 ‘ TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3 ‘ 反向引物 Fi shR2 5 ‘ ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA 3 ‘；B、样品保存将采集的样品保存于4%福尔马林保存液添加0.35g/l硼酸钠或10g/l 乙酸钠中；C、样品形态分组在解剖镜下将不能准确确定种类的样品依据形态特征归类，从每一类中选取具有代表性的个体进行显微拍照，记录形态特征；D、分子生物学鉴定将选出的样品提取DNA、扩增mtDNA的COI基因片段并测序；将测序结果与barcoding数据库中的序列进行比对，确定种类；(1)DNA提取a.样品放入离心管中加入GTE溶液甘氨酸100mmol/l、Tris10mmol/l、EDTA Immo 1/ 1，浸泡70-74小时，每隔7-9小时更换一次GTE溶液；浸泡期间样品保存于4°C的冰箱中；b.浸泡完成后，样品在室温下风干；c.加入ImlGTE溶液，95°C水浴14-16分钟；d.将样品转入灭菌离心管中，加入STE 100 μ 1 =Nacl 0. lmol/l、Tris IOmmo 1/1,EDTA 100mmol/l, SDS 15 μ 1，DTT 5 μ 1，蛋白酶 K 20 μ 1 ；e.55 °C水浴Mh，至溶液澄清；f.加入160 μ 1 的 TE =Tris 10mmol/l、EDTA lmmol/1 混勻；g.加入等体积的NaCl:6mol/l溶液，充分混勻，离心15min，取上清液；h.加入等体积异丙醇，-20°C静置过夜；i.离心15min，弃上清液；j.使用70%体积比乙醇洗涤DNA —次，室温下干燥； k.加入30 μ 1 TE后，置于4°C冰箱中使DNA充分溶解；(2)目的片段的扩增反应体系总体积40 μ 1，含10XPCR缓冲液4 μ 1，Mg2Uy 1，Taq聚合酶2 μ 1，正、反向引物各1 μ 1，dNTP 1.2 μ 1，模板DNA 4 μ 1，无菌水补足至40 μ 1 ；扩增条件为94°C 5min ;40个循环下列程序94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin ；Ε、形态学鉴定依据步骤C中记录的样品形态特征及其照片，总结用于种类鉴定的形态特征，再依形态特征对样品进行种类鉴定；F、鉴定结果的分子生物学验证对步骤E中依据形态特征鉴定出的种类随机选取样品重复步骤D进行检验。
全文摘要
本发明公开了一种分子生物学与形态学相结合鉴定鱼类早期个体的方法，其步骤A、数据库建立采集可以准确鉴定种类的样品保存于乙醇中，建立鱼类的barcoding数据库；B、样品保存将采集的样品保存在添加硼酸钠或乙酸钠的4%甲醛保存液中；C、样品形态分组在解剖镜下将不能准确确定种类的样品依据形态特征归类，记录形态特征；D、分子生物学鉴定将选出的样品提取DNA、扩增mtDNA的COI基因片段并测序，确定种类；E、形态学鉴定依据步骤C中记录的样品形态特征，进行种类鉴定；F、鉴定结果的分子生物学验证。方法易行，操作简便，准确性极高，解决了种类鉴定的技术难题，为鱼类早期资源的提供了技术支持。
文档编号C12Q1/68GK102533997SQ20121000066
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者宋一清, 柳明, 段明, 程飞, 谢松光, 高雷 申请人:中国科学院水生生物研究所