专利名称：一种多孔壳聚糖支架的制备方法
技术领域：
本发明属于多孔材料材料制备领域，特别涉及一种多孔壳聚糖支架的制备方法。
背景技术：
目前，无论是实验室还是工业生产上，所使用的细胞培养微载体主要是实心 Cytodex系列的载体，且属于单层单层培养方式。而在体内，组织和细胞的生长发育过程是在三维立体的内环境条件下进行的，细胞和细胞基质以及细胞之间的相互信号传递对于调解细胞的增殖、分化有着重要影响，常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育所需的三维环境条件，因而制备三维多孔支架就具有十分重要的意义。近年来，在贴壁性细胞悬浮培养的研究领域，壳聚糖支架材料的研究非常广泛。然而，其制备方法往往仅限于常用的冷冻干燥法。传统的冷冻干燥法制备出的壳聚糖支架在可塑性能、微观结构及孔与孔之间的连通性均难以满足细胞培养的技术研究领域的要求。 因此本领域迫切需要提供一种微观结构均勻、易成型、孔与孔之间连通性较好的多孔壳聚糖支架材料。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种多孔壳聚糖支架的制备方法。本发明的技术方案
一种多孔壳聚糖支架的制备方法，即以壳聚糖为原料，以氯化铵为致孔剂，配制溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液；
然后对溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液进行第一次冷冻干燥得到含有氯化铵的壳聚糖支架，并将其浸泡在NaOH溶液中，使氯化铵与NaOH反应生成氨气来制孔得到壳聚糖支架；
最后将壳聚糖支架进行第二次冷冻干燥，以增大壳聚糖支架的孔隙率和孔与孔之间的连通性，最终得到的一种多孔壳聚糖支架。上述的一种多孔壳聚糖支架的制备方法，具体包括如下步骤 (1)、溶液的配制
①、配制溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液
先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，称取 0.2g氯化铵，加入1% (V/V)醋酸溶液中搅拌均勻后，再称取3. Og壳聚糖，加入溶有氯化铵的1% (V/V)醋酸溶液中即可;
②、配制1%(ν/ν)戊二醛溶液
量取Iml纯戊二醛并加蒸馏水定容至100ml，4°C保存备用；
③、配制5%的硼氢化钠溶液
称取5. Og的硼氢化钠加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氢化钠溶液；
④、配制10%(W/V)氢氧化钠溶液称取10. Og氢氧化钠，加入IOOml的蒸馏水中即可；(2)、第一次冷冻干燥量取0. 4ml步骤(1)中所得的1%(ν/ν)戊二醛溶液，并加入到IOOml步骤(1)中的溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液中，搅拌5min后，将搅拌后的溶液涂抹到模具上，静置过夜，然后将溶液注入模具中进行冷冻干燥，得到含有氯化铵的壳聚糖支架； 上述的冷冻干燥过程控制 预冻温度为_75°C，预冻时间为30min ； 一次干燥的隔板温度为_25°C，时间为Mh ；(3)、第二次冷冻干燥将步骤(2)中的含有氯化铵的壳聚糖支架浸泡到10% (W/V)氢氧化钠溶液中，浸泡 20min后，用去离子水反复清洗支架3次，用5%的硼氢化钠除去游离的戊二醛，再用大量的去离子水洗涤后得到壳聚糖支架；再对所得的壳聚糖支架进行冷冻干燥，最终得到多孔壳聚糖支架； 上述的冷冻干燥过程控制 预冻温度为_60°C，预冻时间为35min ； 一次干燥的隔板温度为-20°C，时间为17h ； 二次干燥的隔板温度为10°C，时间为1. 5-池。
上述的多孔壳聚糖支架的制备过程中先对溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液进行第一次冷冻干燥得到含有氯化铵的壳聚糖支架，然后将含有氯化铵的壳聚糖支架浸泡在NaOH 溶液中，使氯化铵与NaOH反应生成氨气来制孔得到壳聚糖支架，并且还可以除去壳聚糖支架中多余的醋酸，因为氢氧化钠可以与醋酸起中和反应，最后再对壳聚糖支架进行第二次冷冻干燥，以增大壳聚糖支架的孔隙率和孔与孔之间的连通性，最终得到多孔壳聚糖支架。
另外，通过调整氯化铵的浓度和壳聚糖溶液的浓度，从而调整所得的多孔壳聚糖支架的孔隙结构；即制备过程中氯化铵的浓度会影响其与氢氧化钠反应时产生气体的量， 一般氯化铵的浓度越高，产生的氨气越多，孔隙率就越高，但是过多的气体含量，会造成支架的机械强度降低，因而本发明中0. 2g氯化铵的含量为最佳。在进行冻干时是以水做致孔剂的，因而壳聚糖溶液的浓度会影响支架中水的相对含量，一般是水的相对含量越高，制得的孔就越多，但水的相对含量越高，则壳聚糖的相对含量就越低，这会使支架的机械强度降低，因而本发明以3g壳聚糖的含量最佳。
最终得到的多孔壳聚糖支架的孔径为20-60 μπι，孔隙率为90%，且孔与孔之间的连通性好，可用于细胞培养的技术研究。
本发明的技术效果本发明的一种多孔壳聚糖支架的制备方法，由于采用冷冻干燥法和氯化铵制孔技术相结合的方法，即先配置溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液，形成均相溶液，进行缓慢冻干，同时由冰晶升华来制孔，然后将含有氯化铵的壳聚糖支架浸泡在NaOH溶液中，使氯化铵与NaOH反应生成氨气来制孔，并且还可以除去支架中多余的醋酸后得到壳聚糖支架，然后再对所得的壳聚糖支架进行第二次冷冻干燥，以增大壳聚糖支架的孔隙率和孔与孔之间的连通性。 因此本发明的多孔壳聚糖支架不仅克服了传统制备壳聚糖支架孔隙率低，连通性差的缺点，并且由于分别进行两次完整的冷冻干燥，来调整孔隙结构，从而得到孔隙率高，连通性好的多孔壳聚糖支架。另外，由于采用酸性致孔剂氯化铵来制备的多孔壳聚糖支架，所得的多孔壳聚糖支架易于成型，孔隙率高，孔与孔之间的联通性好。
图1是本发明所得的多孔壳聚糖支架的扫描电镜图片。
具体实施例方式下面通过实施例并结合附图本发明进一步说明，但并不限制本发明。本发明所用的所有试剂均为医药纯，均来自上海国药集团；
本发明冷冻干燥所用的设备冻干机，型号为ES，仪器名字为Advantage PLUS冷冻型干燥机，生产厂家为美国Virtis公司；
本发明所用的扫描电镜为Quanta x50系列扫描电子显微镜(美国FEI公司)。实施例1
一种多孔壳聚糖支架的制备方法，包括如下步骤
(1)、溶液的配制
①、配制溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液
先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，称取 0.2g氯化铵，加入1% (V/V)醋酸溶液中搅拌均勻后，再称取3. Og壳聚糖，加入溶有氯化铵的1% (V/V)醋酸溶液中即可;
②、配制1%(ν/ν)戊二醛溶液
量取Iml纯戊二醛并加蒸馏水定容至100ml，4°C保存备用；
③、配制5%的硼氢化钠溶液
称取5. Og的硼氢化钠加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氢化钠溶液；
④、配制10%(W/V)氢氧化钠溶液
称取10. Og氢氧化钠，加入IOOml的蒸馏水中即可；
(2)、第一次冷冻干燥
量取0. 4ml步骤(1)中所得的1%(ν/ν)戊二醛溶液，并加入到IOOml步骤(1)中的溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液中，搅拌5min后，将搅拌后的溶液涂抹到模具上，静置过夜，然后将溶液注入模具中进行冷冻干燥得到含有氯化铵的壳聚糖支架； 上述的冷冻干燥过程控制 预冻温度为_75°C，预冻时间为30min ； 一次干燥的隔板温度为_25°C，时间为Mh ；
(3)、第二次冷冻干燥
将步骤(2)中所得的含有氯化铵的壳聚糖支架浸泡到10% (W/V)氢氧化钠溶液中，浸泡20min后，用去离子水反复清洗支架3次，用5%的硼氢化钠除去游离的戊二醛，再用大量的去离子水洗涤后得到壳聚糖支架；
再对所得的壳聚糖支架进行冷冻干燥，最终得到一种多孔壳聚糖支架；上述的冷冻干燥过程控制 预冻温度为_60°C，预冻时间为35min ； 一次干燥的隔板温度为-20°C，时间为17h ； 二次干燥的隔板温度为10°C，时间为1. 5-池。
上述所得的一种多孔壳聚糖支架经扫描电镜进行扫描，结果见图1，从图1中可以看出多孔壳聚糖支架的表面有许多孔，且孔径为20-60 LUn孔与孔之间的连通性较好，测得的多孔壳聚糖支架的孔隙率高达90%。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种多孔壳聚糖支架的制备方法，其特征在于以壳聚糖为原料，以氯化铵为致孔剂， 配制溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液；然后对溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液进行第一次冷冻干燥得到含有氯化铵的壳聚糖支架，并将其浸泡在NaOH溶液中，使氯化铵与NaOH反应生成氨气来制孔得到壳聚糖支架；最后将壳聚糖支架进行第二次冷冻干燥，以增大壳聚糖支架的孔隙率和孔与孔之间的连通性，最终得到的一种多孔壳聚糖支架。
2.如权利要求1所述的一种多孔壳聚糖支架的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤(1)、溶液的配制①、配制溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，称取 0.2g氯化铵，加入1% (V/V)醋酸溶液中搅拌均勻后，再称取3. Og壳聚糖，加入溶有氯化铵的1% (V/V)醋酸溶液中即可;②、配制1%(ν/ν)戊二醛溶液量取Iml纯戊二醛并加蒸馏水定容至100ml，4°C保存备用；③、配制5%的硼氢化钠溶液称取5. Og的硼氢化钠加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氢化钠溶液；④、配制10%(W/V)氢氧化钠溶液称取10. Og氢氧化钠，加入IOOml的蒸馏水中即可；(2)、第一次冷冻干燥量取0. 4ml步骤(1)中所得的1%(ν/ν)戊二醛溶液，并加入到IOOml步骤(1)中的溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液中，搅拌5min后，将搅拌后的溶液涂抹到模具上，静置过夜，然后将溶液注入模具中进行冷冻干燥，得到含有氯化铵的壳聚糖支架； 上述的冷冻干燥过程控制 预冻温度为_75°C，预冻时间为30min ； 一次干燥的隔板温度为_25°C，时间为Mh ；(3)、第二次冷冻干燥将步骤(2)中所得的含有氯化铵的壳聚糖支架浸泡到10% (W/V)氢氧化钠溶液中，浸泡20min后，用去离子水反复清洗支架3次，用5%的硼氢化钠除去游离的戊二醛，再用大量的去离子水洗涤后得到壳聚糖支架，再对所得的壳聚糖支架进行冷冻干燥，最终得到多孔壳聚糖支架；上述的冷冻干燥过程控制 预冻温度为_60°C，预冻时间为35min ； 一次干燥的隔板温度为-20°C，时间为17h ； 二次干燥的隔板温度为10°C，时间为1. 5-池。
3.如权利要求1或2所述的一种多孔壳聚糖支架的制备方法，其特征在于所用的壳聚糖脱乙酰度为80-91%。
4.如权利要求3所述的一种多孔壳聚糖支架的制备方法，其特征在于所得到的多孔壳聚糖支架孔径为20-60 UOi，孔隙率为90%。
5.如权利要求1或2所述的一种多孔壳聚糖支架的制备方法，其特征在于所得到的多孔壳聚糖支架用于细胞培养的技术研究。
全文摘要
本发明公开了一种多孔壳聚糖支架的制备方法，它是以壳聚糖为原料，以氯化铵为致孔剂，即先配制溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液，将该溶液注入模具中进行第一次冷冻干燥得到含有氯化铵的壳聚糖支架，然后将其浸泡在氢氧化钠溶液中20min，用蒸馏水清洗3次后得到壳聚糖支架，最后将其进行第二次冷冻干燥，即可得到多孔壳聚糖支架。所得到的多孔壳聚糖支架，孔径为20-60，孔隙率为90%，孔与孔之间的连通性好，其制备方法操作简单，工艺简捷，得到的多孔壳聚糖支架可用于细胞培养的技术研究。
文档编号C12N5/02GK102492648SQ20121000057
公开日2012年6月13日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者刘宝林, 李琳, 李维杰, 韩宝三 申请人:上海理工大学