专利名称：一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学技术领域，涉及体外传代细胞培养技术，更具体涉及一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法。
背景技术：
在生物学技术飞速发展的当今，人们在细胞生物学及其相关学科的研究中，越来越多的运用细胞培养增殖技术，将有研究意义或有应用前景的细胞采用低温度进行长期保存数年，数十年甚至百年，一旦需要，可随时对所保存的细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特性，供生命科学研究实验。复苏率是指在长期冷冻保存状态下的细胞，经过复苏过程，恢复其活性与生物学特性的细胞数量占冻存细胞总数的百分比。影响细胞复苏率的因素有三部分降温冷冻过程、低温下保存过程及升温复苏过程。冻存细胞复苏后16-M小时，在普通光学显微镜下观察当复苏率小于40%时，见活细胞较少而且形态不规则，生长繁殖速度缓慢，甚至停止生长死亡，导致细胞保存失败； 当复苏率大于40%且小于70%时，显示部分成活细胞，细胞大小不均勻，生长繁殖速度慢， 培养5-7天才能生长成单层细胞；当复苏率大于80%时，显示成活细胞较多，细胞形态正常，生长繁殖速度快，培养2-3天就能生长成单层细胞。综上所述，升温复苏过程，是直接影响人工培养细胞增殖是否成功和顺利进行的一个关键技术。复苏率的高低是直接影响细胞生长质量与增殖周期的重要因素。所以复苏的方法对复苏率有重要和直接的影响作用。数十年来，大量国内外生物细胞学技术相关书籍，介绍常规的复苏方法如下操作1、从液氮中取出细胞冻存管，置37°C水浴，180-300秒融化，加入适配营养液，800 转/分钟离心5分钟，弃上清，加入适配生长液适量，静止37°C培养；2、16-M小时镜下观察复苏后的细胞状态，可见约60-70%的细胞贴壁生长，细胞形态边缘不光滑，有凹凸，大小不均勻，折光性差，培养液中有大量悬浮圆缩的无活力细胞；3、更换适配生长液，继续培养至48小时；4、镜下观察细胞未生长成单层，60-80%融合，继续培养至72-96小时，细胞完全融合，按比例传代培养；5、完成细胞复苏生长繁殖周期。以上广泛使用的复苏温度37°C，再者由于聚丙烯冻存管在实际中的大量广泛应用，造成传热性的差异，一般要180-300秒才能溶解完全，每分钟复温25 50°C，在排除其它影响因素的情况下，复苏率为40-80%。
发明内容
本发明目的是提供一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法，该方法能保持细胞壁的完整，溶解速度更快，以达到使细胞形态结构与生物学特性恢复的更完整，复苏时间短，且复苏率高。为了达到上述发明目的，本发明是通过如下技术方案实现的本发明提供一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法，其特征在于步骤如下(1)从液氮中取出细胞冻存管，复苏温度46-67°C下水浴30_70秒，加入适配营养液，800转/分，离心5分，弃上清，得离心后的细胞；(2)离心后的细胞用适配营养液稀释，无菌取细胞，用台盼蓝染色，计数活细胞数和细胞总数，计算复苏率为95-98% ；(3)其余细胞加入适配生长液，静止37°C培养5-7小时，至90_95%的细胞贴壁；(4)更换细胞适配生长液继续培养48-72小时，至细胞完全融合生长成单层；按比例传代培养；完成细胞复苏生长繁殖周期。进一步，所述的复苏温度为55_60°C。在复苏过程中，冰晶在-50°C以上时进行得较快，因而缓慢解冻往往会由于重结晶而造成细胞死亡，迅速升温可使重结晶的晶体数量减至最少，也可使细胞处在高浓度溶质中的时间缩到最短，以减少细胞的“渗透压休克”，恢复细胞的正常生理功能。本发明与现有技术相比，复苏温度提高，复苏时间缩短，溶解速度更快，复苏速度分别可达100-250°C / min，复苏时间在30-70秒，6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约90-95%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，有部分分支生长状态，培养液中有少量悬浮圆缩的无活力细胞；最终的细胞复苏率达90-98%，提高了传代细胞系冻存细胞的复苏率，保证了细胞生长质量，保持了细胞壁的完整，缩短了细胞复苏的增殖周期。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是所述实施例仅是为了说明本发明， 而不是以任何形式限制本发明的保护范围。
具体实施例方式下述实施例中的适配营养液、适配生长液为申请人在GIBCO公司购买得到。实施例中所用的传代细胞系可为现有技术中的相应传代细胞系。实施例1 BHK21细胞的复苏方法1、从液氮中取出BHK21细胞冻存管，置67°C水浴复苏，32秒融化，加入适配营养液 (MEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(MEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率为97. 6% ；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的MEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约93-95%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，有部分分支生长状态，培养液中有少量悬浮圆缩的无活力细胞；5、更换细胞适配生长液(含10% FBS的MEM)，继续培养至M小时镜下观察，细胞未生长成单层，85-90%融合，继续培养至36小时镜下观察，细胞完全融合生长成单层，在48小时细胞致密单层时按比例传代培养；6、完成细胞复苏生长繁殖周期。实施例2 IBRS-2细胞的复苏方法1、从液氮中取出IBRS-2细胞冻存管，置46°C水浴复苏，62秒融化，加入适配营养液(MEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(MEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率为95. 2% ；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的MEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约90-95%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，培养液中有少量悬浮圆缩的无活力细胞；5、更换细胞适配生长液(含10% FBS的MEM)，继续培养至M小时镜下观察，细胞未生长成单层，80-85%融合，继续培养至36小时镜下观察，细胞完全融合生长成单层，在 48小时致密单层时按比例传代培养；6、完成细胞复苏生长繁殖周期。实施例3 PK15细胞的复苏方法1、从液氮中取出H(15细胞冻存管，置60°C水浴复苏，42秒融化，加入适配营养液 (DMEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(DMEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率在96. 7%之间；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的DMEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约95-97%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，培养液中有极少量悬浮圆缩的无活力细胞；5、更换细胞适配生长液(含10% FBS的DMEM)，继续培养至M小时镜下观察，细胞100%融合，生长成单层，继续培养至36-48小时镜下观察，细胞致密单层，可按比例传代培养；6、完成细胞复苏生长繁殖周期。实施例4 Vero细胞的复苏方法1、从液氮中取出Vero细胞冻存管，置50°C水浴复苏，55秒融化，加入适配营养液 (DMEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(DMEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率在98. 1% ；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的DMEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约95-98%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，有部分分支生长状态，培养液中有极少量悬浮圆缩的无活力细胞；5、更换细胞适配生长液(含10% FBS的DMEM)，继续培养至M小时镜下观察，细胞生长成单层，100 %融合，继续培养至36-48小时镜下观察，细胞生长成致密单层，可按比例传代培养；6、完成细胞复苏生长繁殖周期。
实施例5 PK15细胞复苏方法与现有技术方法的对比
权利要求
1.一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法，其特征在于步骤如下(1)从液氮中取出细胞冻存管，置46-67°C水浴复苏，融化30-70秒，加入适配营养液， 800转/分，离心5分，弃上清，得离心后的细胞；(2)离心后的细胞用适配营养液稀释，无菌取样，用台盼蓝染色，计数活细胞数和细胞总数，计算复苏率为95-98% ；(3)其余细胞加入适配生长液，静止37°C培养5-7小时，至90-95%的细胞贴壁；(4)更换细胞适配生长液继续培养48-72小时，至细胞完全融合生长成单层；按比例传代培养；完成细胞复苏生长繁殖周期。
2.权1所述的复苏方法，其特征在于所述的复苏温度为55-60°C。
全文摘要
本发明属于细胞生物学技术领域，涉及体外传代细胞的培养技术，更具体涉及一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法。通过改变冻存细胞复苏的温度，缩短了复苏时间，提高了冻存细胞的复苏率，可达90-98％，保证了细胞生长质量，缩短了细胞复苏的增殖周期。
文档编号C12N5/00GK102559573SQ20121000430
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者刘长辉, 王敏, 边程 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司