专利名称：一种用于豆粕发酵的益生菌菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种用于豆柏发酵的益生菌菌剂及其制备方法。
背景技术：
随着饲料工业发展和生产高度集约化，对优质饲料蛋白的需求日趋增大，由于动物蛋白需求的膨胀和来源的快速减少，促使人们选用低价低廉、来源可靠的植物蛋白来替代之。 豆柏因具有蛋白质含量高、氨基酸组成平衡、供应量充足、价格适宜等优点而成为最好的选择。但豆柏也有含多种抗营养因子、蛋白质消化率低、有豆腥味适口性差等缺陷。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明一种用于豆柏发酵的益生菌菌剂及其制备方法，该方法可降低发酵成本，提高生物量，制得具有发酵降解豆柏功能的益生菌菌剂。本发明首先提供了一种所述用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其具体步骤包括
(1)枯草芽孢杆菌液体发酵培养基
按重量百分数计为，黄豆粉或豆柏O. 5-5%、糖蜜O. 5-5%、柠檬酸钠O. 05-0. 5%、 NaClO. 05-0. 5%，余量为水;pH5_9 ;在 121°C下高压灭菌 30min ；
(2)枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌菌株活化后接种到细菌液体发酵培养基中，置于25-40°C、100-200r/ min条件下震荡发酵10-50h，制得枯草芽孢杆菌种子液；所述细菌液体发酵培养基为牛肉膏-蛋白胨液体培养基；
(3)枯草芽孢杆菌发酵罐发酵
将枯草芽孢杆菌种子液接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量1-20% (体积)， 在温度20-45°C下于发酵罐中发酵10-50h ；
(4)发酵完成后收集发酵液，进一步加工为液体或固体的益生菌菌剂。其中所述黄豆粉或豆柏预先过60目筛。步骤(2)所述的活化在细菌培养斜面上活化,活化时间10_48h ;细菌培养斜面的固体培养基配制如下:牛肉膏O. 5 %，NaCl O. 5%，蛋白胨1%，琼脂2%，pH 7. 2。更优选地，所述枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，按重量百分数计为，黄豆粉或豆柏 1-5%、糖蜜 1_5%、柠檬酸钠 O. 05-0. l%、NaCl O. 3-0. 5%，余量为水；pH6. 5-7. 5 ;在 121°C 下高压灭菌30min。更优选地，步骤(3)的发酵条件为接种量5-20% (体积)，在温度30_35°C下于发酵罐中发酵15-50h。步骤(3)中控制发酵罐中溶氧量为10-50%。步骤(4)中将收集的发酵液直接瓶装或袋装成液体的益生菌菌剂；或将发酵液用沸石吸附后袋装成固体的益生菌菌剂。
本发明另外提供了由上述制备方法制得的益生菌菌剂。本发明还提供了所述的益生菌菌剂在豆柏发酵中的应用。本发明将枯草芽孢杆菌subti I is)作为益生菌制成菌剂发酵豆柏，降解豆柏中的大分子蛋白，生成具高营养价值的小肽和游离氨基酸，大大提高蛋白质的消化率和转化率，还可以消除豆柏中各种抗营养因子，提高豆柏饲料的利用率。另外，微生物发酵过程中可能产生的各种生物活性物质，如益生素、有机酸、抗菌素、异黄酮等，较大程度上改善了适口性，对动物具有一定的保健功能。本发明的显著优点
1、常见枯草芽孢杆菌液体发酵所用的培养基大多以牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等为主，生产成本较高，本发明选用的发酵培养基的主要成分为黄豆粉(或豆柏)、糖蜜，分别为农产品和工业制糖废弃物，容易获得且价格便宜，成本低；
2、发酵后的每毫升发酵液中的生物量达到100亿左右，可用于降解豆柏中的大分子蛋白，生成具高营养价值的小肽和游离氨基酸，大大提高蛋白质的消化率和转化率，还可以消除豆柏中各种抗营养因子，提高豆柏饲料的利用率，具有较好的应用价值。3、本发明的制备方法可降低发酵成本，简化生产环节，提高效率。
具体实施例方式以下为本发明的几个具体实施案例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。 其中采用的菌株CS27、CS21均出自文献“李善仁等，三株芽孢杆菌作为益生菌的生物特性， 营养学报，2010年第32卷第I期”。实施例I
I、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
将IOg糖蜜，50g黄豆粉,Ig朽1檬酸钠，5g氯化钠投入水中搅拌均勻，并用水定容至1L, 调至pH7. 5,在121°C下高压灭菌30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS27菌株(福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室分离并保存，保藏号CS27。中国科学院微生物研究所鉴定菌株CS27为-.Bacillus subtilis subsp. subtil is，枯草芽孢杆菌枯草亚种)在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml 的三角瓶细菌液体培养基中，置于37°C、180r/min条件下震荡培养12h。3、枯草芽孢杆菌发酵
将CS27种子液接种到枯草芽孢杆菌发酵培养基中(接种量10%)，控制发酵罐中氧气含量为50%，发酵温度30°C，培养50h。4、发酵完成后收集发酵液。5、检测
平板计数法测定生物量为IjSXIO'uf/mL 6、制成固体或液体益生菌菌剂产品。实施例2
I、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
将50g糖蜜，IOg豆柏(过60目筛),0. 5g朽1檬酸钠,5g氯化钠投入水中搅拌均勻，并用水定容至1L,调至pH6. 5,在121°C下高压灭菌30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS27菌株(福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室保存) 在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于 37°C、180r/min条件下震荡培养48h。3、枯草芽孢杆菌发酵
将CS27种子液接种到发酵培养基中(接种量20%)，控制发酵罐中氧气含量为50%，发酵温度30°C，培养50h。4、发酵完成后收集发酵液。5、检测
平板计数法测定生物量为9. 21 X 109cuf/mL 6、制成固体或液体益生菌菌剂产品。实施例3
I、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
将25g糖蜜，25g豆柏(过60目筛)，O. 5g柠檬酸钠，3g氯化钠投入水中搅拌均匀，并用水定容至1L,调至pH7. O,在121°C下高压灭菌30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS27菌株(福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室保存) 在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于 33°C、180r/min条件下震荡培养24h。3、枯草芽孢杆菌发酵
将CS27种子液接种到发酵培养基中(接种量5%)，控制发酵罐中氧气含量为10%，发酵温度33。。，培养20h。4、发酵完成后收集发酵液。5、检测
平板计数法测定生物量为7. 80 X 109cuf/mL
6、制成固体或液体益生菌菌剂产品。实施例4
I、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
将20g糖蜜，50g豆柏(过60目筛)，O. 5g柠檬酸钠，5g氯化钠投入水中搅拌均匀，并用水定容至1L,调至pH6. 5,在121°C下高压灭菌30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS27菌株(福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室保存) 在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于 33°C、180r/min条件下震荡培养24h。3、枯草芽孢杆菌发酵
将CS27种子液接种到发酵培养基中(接种量10%)，控制发酵罐中氧气含量为30%，发酵温度33°C，培养24h。4、发酵完成后收集发酵液。
5、检测
平板计数法测定生物量为I. 13X1010cuf/mL 6、制成固体或液体益生菌菌剂产品。实施例5
I、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
将50g糖蜜,50g黄豆粉(过60目筛),0. 5g朽1檬酸钠,5g氯化钠投入水中搅拌均勻，并用水定容至1L,调至pH7. O,在121°C下高压灭菌30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS27菌株(福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室分离并保存，保藏号CS27)在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于30°C、180r/min条件下震荡培养24h。3、枯草芽孢杆菌发酵
将CS27种子液接种到发酵培养基中(接种量20%)，控制发酵罐中氧气含量为40%，发酵温度30。。，培养15h。4、发酵完成后收集发酵液。5、检测
平板计数法测定生物量为8. 81 X 109cuf/mL 6、制成固体或液体益生菌菌剂产品。实施例6
I、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
将50g糖蜜,50g黄豆粉(过60目筛),0. 5g朽1檬酸钠,5g氯化钠投入水中搅拌均勻，并用水定容至1L,调至pH7. O,在121°C下高压灭菌30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS21 (福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室分离并保存， 保藏号CS21)在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于35°C、180r/min条件下震荡培养24h。3、枯草芽孢杆菌发酵
将CS21种子液接种到发酵培养基中(接种量20%)，控制发酵罐中氧气含量为40%，发酵温度35°C，培养24h。4、发酵完成后收集发酵液。5、检测
平板计数法测定生物量为2. 78 X 109cuf/mL
6、制成固体或液体益生菌菌剂产品。应用实施例I
将实施例I中获得的液体益生菌菌剂产品，接种豆柏进行固态发酵，豆柏与液体益生菌菌剂产品的体积比为I :1，发酵48h后烘干测定发酵产物中大豆肽含量。(I)酸溶蛋白质含量的测定称取样品2. OOg溶解，加入15%TCA(三氯乙酸)溶液 10mL，混合均匀，静置5min。将溶液定量转移，在4000r/min下离心IOmin后，取全部上清液，按凯氏定氮的方法测定上清液中可溶性蛋白质含量。
(2)游离氨基酸含量的测定利用茚三酮显色法测定。(3)肽含量的测定由酸溶蛋白质测定值减去游离氨基酸测定值计算即得大豆肽的含量。由表I和表2可知，豆柏发酵后，消除了豆腥味，适口性好，且生成具高营养价值的小肽和游离氨基酸，大大提高蛋白质的消化率和转化率，还可以消除豆柏中各种抗营养因子，提高豆柏饲料的利用率，具有较好的应用价值。
表I豆柏发酵前后成分比较
权利要求
1.一种用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于所述制备方法的具体步骤包括(1)枯草芽孢杆菌液体发酵培养基按重量百分数计为，黄豆粉或豆柏O. 5-5%、糖蜜O. 5-5%、柠檬酸钠O. 05-0. 5%、 NaClO. 05-0. 5%，余量为水;pH5_9 ;在 121°C下高压灭菌 30min ；(2)枯草芽孢杆菌种子液制备将枯草芽孢杆菌菌株活化后接种到细菌液体发酵培养基中，置于25-40°C、100-200r/ min条件下震荡发酵10-50h，制得枯草芽孢杆菌种子液；所述细菌液体发酵培养基为牛肉膏-蛋白胨液体培养基；(3)枯草芽孢杆菌发酵罐发酵将枯草芽孢杆菌种子液接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量1-20% (体积)， 在温度20-45°C下于发酵罐中发酵10-50h ；(4)发酵完成后收集发酵液，进一步加工为液体或固体的益生菌菌剂。
2.根据权利要求I所述的用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于所述黄豆粉或豆柏预先过60目筛。
3.根据权利要求I所述的用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的活化在细菌培养斜面上活化，活化时间10-48h;细菌培养斜面的固体培养基配制如下:牛肉膏O. 5 %，NaCl O. 5%，蛋白胨1%，琼脂2%，pH 7. 2。
4.根据权利要求I所述的用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，按重量百分数计为，黄豆粉或豆柏1_5%、糖蜜1_5%、柠檬酸钠 O. 05-0. 1%, NaCl O. 3-0. 5%，余量为水；pH6. 5-7. 5 ;在 121°C 下高压灭菌 30min。
5.根据权利要求I所述的用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于步骤(3)的发酵条件为接种量5-20%(体积)，在温度30-35°C下于发酵罐中发酵15_50h。
6.根据权利要求I所述的用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中控制发酵罐中溶氧量为10-50%。
7.根据权利要求I所述的用于豆柏发酵的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中将收集的发酵液直接瓶装或袋装成液体的益生菌菌剂；或将发酵液用沸石吸附后袋装成固体的益生菌菌剂。
8.—种如权利要求1-7中任一条所述制备方法制得的益生菌菌剂。
9.如权利要求8所述的益生菌菌剂在豆柏发酵中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种用于豆粕发酵的益生菌菌剂及其制备方法。该方法可降低发酵成本，提高生物量，制得具有发酵降解豆粕功能的益生菌菌剂。通过将枯草芽孢杆菌种子液接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中发酵；发酵完成后收集发酵液，进一步加工为液体或固体的益生菌菌剂。本发明选用的发酵培养基的主要成分为黄豆粉(或豆粕)、糖蜜，分别为农产品和工业制糖废弃物，容易获得且价格便宜，成本低；发酵后的每毫升发酵液中的生物量达到100亿左右，可用于降解豆粕中的大分子蛋白，还可以消除豆粕中各种抗营养因子，提高豆粕饲料的利用率，具有较好的应用价值。本发明的制备方法可降低发酵成本，简化生产环节，提高效率。
文档编号C12N1/20GK102604871SQ20121008301
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者吴大华, 林戎斌, 林新坚, 林陈强, 陈济琛 申请人:福建省农业科学院土壤肥料研究所